專利名稱：海綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途。
背景技術：
土曲霉已被廣泛應用于降脂藥物洛伐他汀以及化工原料衣康酸的生產，但尚未被用于(+)_terrein的生產。(+)_terrein是一種環戍烯酮類化合物，結構如圖I所示，最初即從土曲霉發酵液中分離得到，近年來，人們發現(+hterrein的活性十分多樣，不僅具有抗細菌、真菌、雜草的活性，還可以抑制腫瘤細胞血管新生素的分泌，抑制黑色素合成，抑制皮膚角質增生，抑制牙髓細胞炎癥反應，促進成骨細胞與鈦支架融合等。可以預見(+)-terrein將來在醫療、美容、農業等眾多領域會有良好的應用前景。
化學合成制備(+)_terrein的技術往往有總產率不高，且需要采用高溫高壓等極端反應條件，需要昂貴的反應試劑，或是終產物不具備立體結構的選擇性。而目前采用微生物發酵制備(+)-terrein的產量又十分有限，少則數百μ g/L(Phattanawasin P, etal. Weed growth inhibitors from Aspergillus fischeri TISTR 3272. Natural ProductResearch 2007 ;21 :1286-1291)，多則數百mg/L(M. Demasi，et al. Studies on (+) -terreinas a New Class of Proteasome Inhibitors.Journal of the Brazilian ChemicalSociety 2010 ；21 :229-305)，而未能達到具備生產價值的g/L量級。

發明內容
本發明的目的在于提供一種海綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途。本發明的海綿共附生土曲霉分離自中國南海永興島Phakellia fusca海綿,其(+)_terrein產量相較于現有其他菌株有較大提高，可達到3. 71g/L。本發明是通過以下的技術方案實現的本發明的海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26已經于2011年8月31日遞交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO. 5208。該微生物經分子生物學18S及ITS rDNA基因序列分析，結合形態學觀察，確定其分類學地位屬于曲霉屬(Aspergillus)的土曲霉(Aspergillus terreus),菌株編號為PF26。所述的18S rDNA基因序列已提交GenBank,序列號為JN831364,最相似序列為土曲霉序列⑶227345，最大相似度為99%，以18S rDNA基因序列同源性為基礎構建形成包括菌株PF26在內的相關真菌系統發育樹如圖2所不。所述的ITS rDNA基因序列已提交GenBank,序列號為JN831365,最相似序列為土曲霉序列JN194186，最大相似度為100%，以ITS rDNA基因序列同源性為基礎構建形成包括菌株PF26在內的相關真菌系統發育樹如圖3所不。
18S rDNA基因與ITS rDNA基因的鑒定結果吻合，最相似序列均為土曲霉序列，且在兩個系統發育樹上PF26的序列也均與土曲霉序列聚類在一起，因此通過分子生物學的鑒定可以說明PF26是一株土曲霉。本發明還涉及上述的海綿共附生土曲霉菌株在制備化合物(+)-terrein中的用途。優選的，所述制備包括將海綿共附生土曲霉菌株進行發酵的步驟。優選的，所述發酵具體為將發酵培養基于115°C滅菌30min ;將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的所述發酵培養基中，接種量為4 X IO6個孢子/mL，于28°C，ISOrpm的搖床培養24天。優選的，所述發酵培養基的配置方法包括如下步驟取葡萄糖28.41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. 00g，之后溶于IL 人工海水中，即得所述發酵培養基。優選的，所述人工海水的配置方法包括如下步驟將26. 518g氯化鈉、2. 447g氯化鎂、3. 305g硫酸鎂、I. 141g氯化鈣、0. 725g氯化鉀、0. 202g碳酸氫鈉以及O. 083g溴化鈉溶解于IL蒸餾水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值為7. O 7. 2。本發明具有的有益效果為本發明提供了海綿共附生土曲霉(Aspergillusterreus)PF26CGMCC NO. 5208 ;其用于化合物(+)-terrein 的生產時，(+)-terrein 的產量相較于現有其他菌株有較大提高，可達到3. 71g/L。


圖I 為(+)-terrein 的結構圖；圖2為土曲霉PF26與相關真菌18S rDNA基因序列系統發育樹圖；圖3為土曲霉PF26與相關真菌ITS rDNA基因序列系統發育樹圖；圖4為土曲霉PF26分生孢子絲的400倍放大光鏡照片；圖5為土曲霉PF26分生孢子頭的掃描電鏡照片。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例本實施例是采用土曲霉(Aspergillusterreus)PF26CGMCC NO. 5208 制備化合物(+)-terrein,包括如下步驟I、取海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCCNO. 5208所述土曲霉PF26的形態學特征如下(a)在人工海水察氏培養基上28°C培養時，菌落平坦，質地致密，菌落黃色與淺褐色相間，菌落周圍可產生黃色水溶性色素，生長較為緩慢，培養4天菌落直徑達到2. 9cm, 7天可達6. Ocm ；(b)在人工海水PDA培養基上28°C培養時，菌落平坦，質地致密，菌落褐色，分生孢子更多，菌落周圍可產生黃色水溶性色素，生長較快，培養4天菌落直徑達到5. 7cm, 7天可布滿平板；(C)該菌株的顯微特征在于菌絲有隔，分生孢子頭的頂囊半球形，小梗雙層，第一層短，第二層長，呈放射狀排列，分布頂囊表面2/3，頂端有鏈形孢子，如圖4、5所示；(d) 土曲霉PF26的發酵特征在于該菌株在含有葡萄糖28. 41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. OOg及IL人工海水的發酵培養基中，可以產生單一結構的(+)-terrein，當接種量為4X IO6個孢子/mL，在28°C，180rpm的搖床培養24天，(+)-terrein的產量可以達到3. 71g/L。前述中的人工海水，其配置方法包括如下步驟將26. 518g氯化鈉、2. 447g氯化鎂、3. 305g硫酸鎂、I. 141g氯化鈣、O. 725g氯化鉀、O. 202g碳酸氫鈉以及O. 083g溴化鈉溶 解于IL蒸餾水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值為7. O 7. 2。2、制備發酵培養基所述發酵培養基的配置方法包括如下步驟取葡萄糖28. 41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. OOg,之后溶于IL人工海水中，即得所述發酵培養基；3、發酵制備化合物(+)-terrein培養基在250mL三角瓶中裝液量為IOOmL,于115°C滅菌30min ;將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的培養基，使接種量為4X IO6個孢子/mL，在28°C、180rpm的恒溫搖床中培養，pH自然；培養24天，發酵液上清中的(+)-terrein產量可以達到3. 71g/L。培養結束后將發酵液抽濾，分離上清與菌體。上清用等體積乙酸乙酯萃取3輪，減壓蒸餾回收乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯提取物。該提取物經ODS柱水甲醇=7 3(v/v)洗脫及反相HPLC純化制備得到純化的主發酵產物。該主發酵產物經質譜測定分子量為154. 1，其核磁數據如表I所示，其0. 1%和1%(w/v)的水溶液的比旋光值分別為[a ]D =+168° (c = 0. 1,H20)和[a ]D =+163。(c =I，H2O)，與文獻數據比對，可以確定該主發酵產物為(+)-terrein。表I.發酵產物的核磁數據(400MHz，DMS0_d6)
權利要求
1.一種海綿共附生土曲霉菌株，其特征在于，所述海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCC NO. 5208。
2.一種海綿共附生土曲霉菌株在制備化合物(+hterrein中的用途。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述制備包括將海綿共附生土曲霉菌株進行發酵的步驟。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述發酵包括如下步驟將發酵培養基于115°C滅菌30min ;將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的所述發酵培養基中，接種量為4 X IO6個孢子/mL，于28°C，180rpm的搖床培養24天。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述發酵培養基的配置方法包括如下步驟取葡萄糖28. 41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. 00g，之后溶于IL人工海水中，即得所述發酵培養基。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述人工海水的配置方法包括如下步驟將26. 518g氯化鈉、2. 447g氯化鎂、3. 305g硫酸鎂、I. 141g氯化鈣、0. 725g氯化鉀、0. 202g碳酸氫鈉以及0. 083g溴化鈉溶解于IL蒸餾水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值為.7.O 7. 2。
全文摘要
本發明公開了一種海綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途。所述海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCC NO.5208。所述海綿共附生土曲霉菌株用于制備化合物(+)-terrein時包括將海綿共附生土曲霉菌株進行發酵的步驟，具體為將發酵培養基于115℃滅菌30min；將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的所述發酵培養基中，接種量為4×106個孢子/mL，于28℃，180rpm的搖床培養24天。本發明的海綿共附生土曲霉分離自中國南海永興島Phakellia fusca海綿，其(+)-terrein產量相較于現有其他菌株有較大提高，可達到3.71g/L。
文檔編號C12R1/66GK102827777SQ20121000794
公開日2012年12月19日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者殷穎, 李志勇, 張風麗, 孫偉, 余智生, 丁博 申請人:上海交通大學