專利名稱：含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒及其應用，以及一種含有多種轉座因子的轉Bt基因熒光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術：
Bt基因是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶體蛋白基因的簡稱。 1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt基因中分為Cry和Cyt 二大類。迄今為止，已經報道的Bt 達至Ij 476種，其中 Cry 分為 58群、449 種，Cyt 分為 2群、27種(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/toxins2. html)。經過密碼子優化的Bt基因已被成功地導入水稻、棉花、煙草、玉米等多種植物，獲得一大批具良好抗蟲性的轉基因植物品種和種質資源，Bt基因已成為植物基因工程及轉基因育種中應用最廣泛、最具潛力和應用前景的抗蟲基因。目前全世界總共已獲得了50多種轉Bt殺蟲晶體蛋白基因植物，其中玉米、棉花、 馬鈴薯、油菜、楊樹、煙草等已商品化，我國農業部于2009年批準轉基因抗蟲水稻的生物安全證書。自1996年首例轉基因農作物產業化應用以來，全球轉基因技術研究與應用快速發展。截至2010年底，已有25個國家批準了 24種轉基因作物的商業化應用。以轉基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉基因作物種植面積由1996年的170萬公頃發展到2010年的14800萬公頃，14年間增長了 87倍。ACP(Fiber-specific acyl carrier protein)基因是棉花內源基因，用于定量檢測的棉花ACP基因片段長度為116b的DNA片段；其核苷酸序列不僅具備種內一致性，即所有棉花品種中含有ACP基因；還具備種間特異性，即在除棉花外其它物種里沒有該基因DNA 片段。SPS(sucrose phosphate synthase)基因是水稻內源基因，用于定量檢測的水稻 SPS基因長度為Slbp的DNA片段；其核苷酸序列不僅具備種內一致性，即所有水稻品種中含有SPS基因；還具備種間特異性，即在除水稻外其它物種里沒有該基因DNA片段。CaMV35S啟動子來自于花椰菜花葉病毒的35S啟動子，存在于轉基因大豆、玉米、 油菜籽、番茄、馬鈴薯及其加工產品中；N0S終止子為胭脂堿合成酶基因終止子，也廣泛存在于轉基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、馬鈴薯及其加工產品中；Npt II為新霉素_3’ -磷酸轉移酶基因，該基因的加入可促使轉基因產品在新霉素培養基中成長。近年來，關于轉基因植物的安全性事件報道不斷，如1996年巴西豆過敏事件、 1998年Pusztai事件、1999年美國大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星聯Bt玉米事件、2007年印度轉基因抗蟲棉事件、加拿大超級雜草事件和中國抗蟲棉事件等，這些事件促使國際組織和國家紛紛制定相應的安全管理法規，加強遺傳改良作物的規范管理，并對遺傳改良植物及其產品實施標識制度。為了應對遺傳改良作物管理相關的法律法規和制度，有必要建立一套高效、快速、特異的檢測技術。聚合酶鏈反應(PCR)無疑是最佳選擇。在實際檢測中，標準物質十分關鍵。標準分子的概念由日本科學家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有檢測目的基因特異性片段的線性化重組質粒分子。經實驗驗證，不管是由單一特異性外源序列還是多段目標序列構建的質粒標準分子，都能很好的達到轉基因作物定量分析檢測，特別是定量PCR檢測的目的。質粒標準分子由于生產方便、易擴增、操作簡便、穩定性好、純度較高、高效經濟等優點愈來愈受全世界轉基因檢測專家和研究者們重視，在轉基因生物鑒定檢測中是很好的標準陽性物質替代物，應用于轉基因品系以及其加工品的定量PCR檢測。標準質粒分子在轉基因作物和附屬產品檢測鑒定中的應用將會發揮越來越重要的作用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒分子，解決轉Bt基因農作物尤其是轉Bt基因棉花、水稻檢測中標準物質缺乏的難題。本發明采用的技術方案是一種含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒，由SEQ ID No. I (35S啟動子)、 SEQ ID No. 2 (Bt)、SEQ ID No. 3 (SPS)、SEQ ID No. 4 (ACP)、SEQ ID No. 5 (N0S 終止子)和 SEQ ID No. 6 (Npt II新霉素)所示核苷酸片段添加常規酶切位點后，插入克隆載體制得。優選的，上述6個核苷酸，每個核苷酸片段兩端添加同一種酶切位點，其添加順序依次為 HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII。本發明的轉Bt基因棉花、水稻標準質粒分子既含有Bt外源基因又包括棉花ACP 內源基因和水稻SPS內源基因。Bt外源基因既可用于定性、定量檢測轉Bt基因農作物的轉基因含量，又可以定性檢測樣品是否來自轉Bt基因農產品；相同原理，棉花ACP和SPS內源基因可定性檢測上述轉Bt基因農產品是否為棉花或水稻品系，亦可定量檢測轉Bt基因棉花、水稻的轉基因含量。所述克隆載體為常規克隆載體(PMD18-T、PMD19-T、pEASY_T3等克隆載體)，本發明中優選為PEASY-T3。優選的，所述標準質粒由SEQ ID No. 7 (SEQ ID No. I兩端添加HindIII位點)、SEQ ID No. 8 (SEQ IDNo. 2 兩端添加 KpnI 位點)、SEQ ID No. 9 (SEQ ID No. 3 兩端添加 XbaI 位點)、SEQ ID No. 10 (SEQ ID No. 4 兩端添加 XhoI 位點)、SEQ ID No. 11(SEQID No. 5 兩端添加BamHI位點)和SEQ ID No. 12 (SEQ ID No. 6兩端添加BglII位點)所示核苷酸序列依次連接后，插入PEASY-T3載體制得。所述標準質粒的構建,包括如下步驟I.設計PCR特異性引物；2. PCR 擴增；3、35S啟動子、Bt、SPS、ACP、N0S終止子以及Npt II新霉素核苷酸目標序列獲取， 長度分別為74、174、81、116、180和183bp，通過測序進行驗證；并設計熒光定量PCR引物及探針；4.構建標準質粒；將4中所選取的355啟動子』15 530 、勵5終止子以及恥七II新霉素特異片段經過拼接,每個核苷酸頭尾均添加相同成分酶切位點,添加的酶切位點依次為HindIII、 KpnI, XbaI, XhoI, BamHI, Bglll，最終獲得長度為880bp的基因片段，而后插入pEASY_T3 載體，完成標準質粒的組合，標準質粒分子如圖1(因其插入片段長度為880bp，本發明簡稱 880號質粒)。5.通過PCR、酶切、測序等驗證標準質粒；6.對標準質粒進行特異性、穩定性及均勻性檢測；7.對標準質粒特異性、穩定性及均勻性結果進行分析。本發明還涉及所述的標準質粒在定量檢測轉基因農作物中轉基因含量中的應用。所述農作物可為下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。所述標準質粒可用于檢測下列之一的Bt外源基因(I) CryIA ( α )，(2) CryIA (b)，
(3)CryIA (c), (4)Crylab/ac。本發明還涉及一種含多種轉座因子的轉Bt基因熒光定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和所述含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒，所述特異性引物和探針序列如下35S啟動子的引物和探針(目標條帶74bp)35S-F:5，-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’35S-R:5’ -AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’35S-P : 5，- (FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3，NOS終止子的引物和探針(目標條帶180bp)NOS-F :5’ -GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’NOS-R :5’ -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’NOS-P : 5 ’ - (FAM)-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-(TAMRA)-3，Npt II新霉素的引物和探針(目標條帶183bp)NPT II-F :5，-GCACGAGGAAGCGGTCA-3’NPT II-R :5，-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3， NPTII-P :5，_(FAM)-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-(TAMRA)-3，棉花ACP基因的引物和探針(目標條帶116bp)ACP-F :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，ACP-R :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，ACP-P : 5，_(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-(TAMRA)-3，Bt基因的引物和探針(目標條帶174bp)Bt-F :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-P :5’ -(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3’水稻SPS基因的引物和探針(目標條帶8Ibp) SPS-F 5' -TTGCGCCTGAACGGATAT-3'SPS-R 5' -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3'SPS-p : 5，- (FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3’其中FAM為熒光報告基團，TAMRA、Eclipse為熒光淬滅基團；
所述含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒分子由SEQ ID No. 7、SEQ IDNo. 8,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 所示核苷酸序列依次連接后，插入PEASY-T3載體制得。使用以上試劑盒對轉Bt基因農作物的熒光定量PCR檢測可按本領域常規方法進行，提取待測樣品基因組DNA后，配制PCR緩沖液進行PCR擴增，取PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果是否出現Bt基因的特異性條帶(174bp)，判斷待測農作物是否含有相應外源基因，若電泳結果同時出現ACP基因特異性條帶(116bp)，則待測農作物為轉 Bt基因棉花；若電泳結果同時出現SPS基因特異性條帶(81bp)，則待測農作物為轉基因水稻；還可用于轉基因大豆、玉米、油菜籽、番茄、馬鈴薯及其加工產品中CaMV35S啟動子、NOS 終止子以及Npt II基因的定性定量檢測。定量檢測時同時以標準質粒梯度濃度溶液于相同條件下進行擴增，繪制標準曲線，對照標準曲線，即可獲得待測樣品中外源基因和內源基因的拷貝數，即可獲知待測樣品的外源基因含量。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一種含多種轉座因子的抗蟲水稻、 棉花標準質粒，生產方便、易擴增、操作簡便、穩定性好、高效經濟，解決了轉基因農作物檢測中標準物質缺乏的難題，并且提供了一種準確、快速、簡便的含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花熒光定量PCR檢測試劑盒，能夠很好的進行轉基因農作物的定性、定量分析檢測。


圖I為pEASY-T3重組載體結構圖;1 6分別為酶切位點HindIII、KpnI、XbaI、 Xhol、BamHI、BglII ；圖2 為 Bt 和 ACP 基因驗證電泳圖；Marker DL2000 ； I (35S)、2 (NTC) ,3 (NOS)、 4(NTC)、5(SPS)、6(NTC),7(Npt II),8(NTC)、9(ACP)、10(NTC)、11(Bt)、12 (NTC)；圖 3 為 EcoRI 單酶切；M (DL2000) ；1 (880 質粒)；2 (HindIIII 酶切)；3 (KpnI 酶切)；4 (XbaI 酶切)；5 (XhoI 酶切)；6 (BamHI 酶切)；7 (880 質粒)；8 (Bgl II 酶切)；M (DL2000)；圖4為880號質粒的各基因熒光定量PCR結果(標準曲線)汸 ？分別為355、 Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II ；圖5為880號質粒各基因片段短期穩定性熒光定量PCR結果(標準曲線)；1 為-70。。、_20°C、4°C的檢測擴增曲線；2為20°C、40°C的檢測擴增曲線;A F分別為35S、 Bt、SPS、ACP、NOS、Npt II ；圖6為880號質粒各基因均勻性qPCR分析，A F分別為35S、Bt、SPS、ACP、N0S、 Npt II ；圖7為880號質粒熒光定量檢測極限分析。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I :880標準質粒分子的構建本發明含多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒包含Bt、35S啟動子、NOS終止子以及Npt II基因四個外源基因和棉花ACP、水稻SPS二種內源基因，其構建方法包括如下
步驟
I.設計PCR特異性引物；
2. PCR擴增；
3. Bt、35S啟動子、NOS終止子、Npt 11, ACP, SPS等目標序列獲取，并通過測序進行驗證；
4.選擇合適片段，并設計熒光定量PCR引物及探針；
熒光定量PCR引物及探針如下所示
35S-F :5，-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3，
35S-R :5，-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3，
35S-P :5，-FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA-3，
Bt-F :5，--GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3，
Bt-R :5，--CGCCTTGACCACAGCTATCC-3，
Bt-P :5’ --(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’
SPS-F 5/-TTGCGCCTGAACGGATAT-3'
SPS-R 5/-CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3'
SPS-p :5，-FAM-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-TAMRA-3’
ACP-F :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，
ACP-R :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，
ACP-P :5，-(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG(TAMRA)-3，
NOS-F :5，-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3，
NOS-R :5，-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3，
NOS-P :5’-FAM-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-TAMRA-3，
NPT II-F:5，-GCACGAGGAAGCGGTCA-3，
NPT II-R:5，-AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3，
NPT II-P5，-FAM-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA-3，
其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
5.構建標準質粒；
35S啟動子、Bt、SPS、ACP、NOS終止子以及Npt II新霉素核苷酸片段其長度分別
為74bp、174bp、81bp、116bp、180bp、183bp。上述6個核苷酸片段,每個核苷酸片段兩端添加同一種酶切位點，其添加順序依次為HindIII、KpnI、XbaI、XhoI、BamHI、BglII。所得片段插入PEASY-T3克隆載體(購自北京全式金生物技術有限公司)，完成標準質粒的組合，標準質粒分子如附圖I (因其插入片段長度為880bp，本發明簡稱880號質粒)。其重組流程如下a.基因序列的QC :對所需合成的基因全序列進行分析，檢查基因內部是否含有復雜二級結構和重復序列。根據序列情況設計合成方案；b.根據基因序列分析的結果，進行單鏈oligo的設計及合成；c.利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因；d.將合成好的基因裝入pEASY_T3Cloning載體并轉化至感受態細胞DH5a ；
e.測序驗證重組克隆中基因序列是否與要求相符。6.通過PCR、酶切、測序等驗證標準質粒；(I) PCR 驗證對所構建的880號質粒用355啟動子、815 5、么0 、勵5終止子以及恥七II引物進行擴增電泳，在目標片段區域獲得清晰的單一預期條帶，如圖2，說明這六個片段已經被正確地插入質粒中。(2)酶切驗證根據插入片段和pEASY-T3載體TA克隆位點兩端特異性較高的酶切位點選擇 EcoRI單酶切，結果見圖3。根據載體結構圖以及載體和整合片段序列估算，880號質粒經 HindIIII、KpnI、XbaI、Xhol、BamHI、Bgl II六種限制性內切酶進行單酶切，酶切獲得選取的355啟動子、81\5 5、40 、勵5終止子、冊1 II新霉素這六個基因的特異片段，大小分別為74、174、81、116、180、183bp，基本肯定質粒片段的正確性。(3)測序驗證根據插入片段(含兩端酶切位點)設計引物，進行PCR擴增，將擴增結果進行測序。并對測序結果與設計序列進行匹配對比，結果完全吻合，驗證了質粒序列100%的可靠性。7.對標準質粒進行特異性、穩定性及均勻性檢測；(I)標準質粒的濃度測定和檢測重復性質粒突光定量PCR引物與上述4中相同，探針采用Primer Express2. O和Beacon designer 設計，然后由 TaKaRa公司負責合成。根據PicoGreen dsDNA Reagent and Kits所測定母液濃度計算質粒拷貝數，再用滅菌去離子水分別稀釋成初始模板拷貝數為107、106、 ΙΟ5、104、IO3,100、10拷貝的標準質粒進行熒光定量PCR繪制標準曲線，從而建立標準質粒的qPCR定量分析體系并用于實際標準分子的定量分析，重復定量分析3次，分析檢測靈敏性。表I為qPCR擴增程序，表2為熒光定量PCR 25 μ I擴增體系。表l:qPCR擴增程序
steplstep235S95°C，30s ；95°C，5s ;63°C，30s ；40cyclesBt95°C，30s ；95°C，5s ;60°C，30s ；40cyclesSPS95°C，30s ；95°C，5s ;55°C，30s ；40cyclesACP95°C，30s ；95°C，5s ;59°C，30s ；40cyclesNOS95°C，30s ；95°C，5s ;57°C，30s ；40cyclesnptll95°C，30s ；95°C, 5s ;65°C，30s ；40cycles 表2 :熒光定量PCR 25 μ I擴增體系
權利要求
1.含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒，由SEQID No. I、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示核苷酸片段添加酶切位點后，插入克隆載體制得。
2.如權利要求I所述的標準質粒，其特征在于所述克隆載體為PEASY-T3。
3.如權利要求I所述的標準質粒，其特征在于所述標準質粒由SEQID No. 7、SEQ IDNo. 8,SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 所示核苷酸片段依次連接后，插入PEASY-T3載體制得。
4.如權利要求I 3之一所述的標準質粒在定量檢測轉基因農作物中轉基因含量中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述農作物為下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述標準質粒用于檢測下列之一的Bt外源基因(I)CryIA (a), (2)CryIA(b), (3)CryIA (c), (4)Crylab/ac。
7.一種含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒含有熒光定量PCR檢測試劑盒， 主要包括特異性引物和探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒，其特征在于所述特異性引物和探針序列如下35S-F :5，-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3’35S-R :5’ -AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’35S-P : 5，- (FAM)-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-(TAMRA)-3，NOS-F :5’ -GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’NOS-R :5’ -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’NOS-P : 5 ’ - (FAM)-GCATGACGTTATTTATGAGATGGGT-(TAMRA)-3，NPT II-F :5，-GCACGAGGAAGCGGTCA-3，NPT II-R :5’ -AGGATCTCGTCGTGACCCAT-3，NPT II-P :5，-(FAM)-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-(TAMRA)-3，ACP-F :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，ACP-R :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，ACP-P :5’ _(FAM)-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-(TAMRA)-3，Bt-F :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-P :5’ -(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-(Eclipse)-3，SPS-F 5' -TTGCGCCTGAACGGATAT-3'SPS-R 5' -CGGTTGATCTTTTCGGGATG-3'SPS-p :5’ - (FAM)-TCCGAGCCGTCCGTGCGTC-(TAMRA)-3，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA, Eclipse為熒光淬滅基團；所述含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒由SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示核苷酸片段依次連接后，插入 PEASY-T3載體制得。
全文摘要
本發明涉及一種含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒，由SEQ IDNo.1(35S啟動子)、SEQ ID No.2(Bt)、SEQ ID No.3(SPS)、SEQ ID No.4(ACP)、SEQ ID No.5(NOS終止子)和SEQ ID No.6(Npt II新霉素)所示核苷酸片段添加常規酶切位點后，插入克隆載體制得。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一種含有多種轉座因子的抗蟲水稻、棉花標準質粒，生產方便、易擴增、操作簡便、穩定性好、高效經濟，解決了轉Bt基因農作物檢測中標準物質缺乏的難題，并且提供了一種準確、快速、簡便的含有多種轉座因子的轉Bt基因熒光定量PCR檢測試劑盒，能夠很好的進行轉Bt基因農作物的定性、定量分析檢測。
文檔編號C12N15/63GK102586304SQ20121000839
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者付賢樹, 俞曉平, 葉子弘, 崔海峰, 趙煦泓, 金榮愉 申請人:中國計量學院