專利名稱：用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米mir162的特異性引物、探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物及探針，及其在基因特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
90年代初，市場上第一個轉(zhuǎn)基因食品出現(xiàn)在美國，是一種保鮮番茄。隨后十幾年， 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)產(chǎn)品陸續(xù)誕生，尤其在食品、醫(yī)藥方面取得很大成績。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生態(tài)安全和食用安全一直備受爭議，相繼有40多個國家和地區(qū)建立和實施了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度。隨著這些制度的建立與不斷完善，人們對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏度提出了嚴(yán)格的要求，各種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)也成為了研究熱點。根據(jù)不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測目的不同，鑒定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的主要方式有篩查法、基因特異性檢測方法、轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法和構(gòu)建特異性檢測方法。其中轉(zhuǎn)化體特異性檢測是特異性最強，應(yīng)用最多的檢測方法。從技術(shù)層面講，在上述檢測中應(yīng)用最多的是PCR技術(shù)，包括定性PCR、巢式PCR、復(fù)合PCR、競爭性定量PCR和熒光定量PCR等。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162是美國先正達(dá)公司開發(fā)出來的新型抗鱗翅目昆蟲品種。申請人經(jīng)過對現(xiàn)有專利和其他文獻(xiàn)的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物及探針，及其在基因特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的—種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，其序列為MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'；如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。所述用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物可以用于定性檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件，具體應(yīng)用時，步驟為(I)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用MIR162-F和MIR162-R引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；若存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品中含有MIR162轉(zhuǎn)化事件；若不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含有MIR162轉(zhuǎn)化事件。所述步驟(I)中，PCR程序為95°C 5min 預(yù)變性；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s，35 個循環(huán)；72°C延伸7min。所述用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物可以用于SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件，具體應(yīng)用時，步驟為(I)建立MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物的SYBR Green I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的SYBR Green I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線①提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入MIR162轉(zhuǎn)化事件的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制MIR162轉(zhuǎn)化事件的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后， 測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的MIR162基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)基因玉米 MIR162基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。所述步驟⑴①和⑵中，zSSIIb引物序列(國家標(biāo)準(zhǔn))如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。所述步驟⑴①和⑵中，擴(kuò)增的參數(shù)如下擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL，2XPremix Ex Taq (Rox) IOuL,濃度為 10umol/L 的 Forward primer O. 4uL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primerO. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 IuL ；擴(kuò)增反應(yīng)條件95°CIOmin 預(yù)變性；95°C 15s,50°C 30s,72°C 30s，在 72°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的熒光標(biāo)記探針，序列為MIR162-P :FAM-5' -C AGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3' -Eclipse，如 SEQ ID NO. 3所示，探針的 5'端連接一個熒光報告集團(tuán)FAM，3'端連接有一個熒光淬滅集團(tuán)Eclipse。上述用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物及用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的熒光標(biāo)記探針，可以用于TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有 MIR162轉(zhuǎn)化事件，具體應(yīng)用時，步驟為(I)建立MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物的TaqMan探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和 zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線①提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入MIR162轉(zhuǎn)化事件的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制MIR162轉(zhuǎn)化事件的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的MIR162基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。所述步驟⑴①和⑵中，zSSIIb引物和探針序列(國家標(biāo)準(zhǔn))如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；zSSIIb-P FAM-5/ -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRA。所述步驟⑴①和⑵中，擴(kuò)增的參數(shù)如下擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL, 2XPremix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,濃度為 10umol/L 的 Forward primer IuL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer IuL,濃度為 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；擴(kuò)增反應(yīng)條件95°CIOmin 預(yù)變性；95°C 15s,50°C 30s,72°C 30s，在 72°C收集熒光信號，共計45個循環(huán)。本發(fā)明設(shè)計了針對轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)基因的引物與探針序列，建立了轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法、SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法經(jīng)實驗驗證，靈敏、準(zhǔn)確、簡單、可靠，具有廣闊的應(yīng)用價值與市場前景。


圖I為實施例I中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳示意圖。圖2為實施例2中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的SYBR Green I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為實施例2中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體SYBR Green I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為實施例3中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的TaqMan探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為實施例3中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體TaqMan探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例I轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法引物由大連Takara公司合成,稀釋成10umol/L備用。合成的引物序列如下MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；
MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。分別提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、M0N810、NK603、Btl76、M0N88017、GA21、TC1507、 MIR604、Btll,轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、M0N87701,非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2，轉(zhuǎn)基因棉花 M0N88913、LLcotton25、M0N531、M0N1445，轉(zhuǎn)基因水稻TT51、科豐6號，非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單 958基因DNA為模板，分別用MIR162-F和MIR162-R引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序為 950C 5min 預(yù)變性；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s, 35 個循環(huán)；72°C延伸 7min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果利用所設(shè)計的引物以提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖I所示， 由圖可見，只有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因組成功擴(kuò)增出94bp特異性產(chǎn)物，而其他轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品模板都沒有可觀察到的擴(kuò)增產(chǎn)物。由此證明，該引物具有良好的特異性，適合于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性的定性檢測。實施例2轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA，按5倍倍比分別稀釋至5°，5—1，5_2，5_3， 5^4 ;相應(yīng)的拷貝數(shù)設(shè)為100000，20000，4000，800，160，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，檢測擴(kuò)增的重復(fù)性。引物由大連Takara公司合成,稀釋成10umol/L備用。合成的MIR162引物序列如下MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。玉米內(nèi)標(biāo)引物(zSSIIb)采用國家標(biāo)準(zhǔn)引物，其序列如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL, 2 XPremix Ex Taq (Rox) IOuL,濃度為 10umol/L 的 Forward primerO. 4uL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 luL。擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s，50。。30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計 45個循環(huán)。每個試樣重復(fù)3次，同時設(shè)立無菌雙蒸水(ddH20，空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品(鄭單958，陰性)對照。結(jié)果通過對不同MIR162標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為100000，20000，4000，800，160的DNA進(jìn)行SYBR Green I實時熒光定量PCR擴(kuò)增，計算機軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為Ct，橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)Bnn (1%,0.5%,0. I %, 0. 05 %, 0. 01 % ) 性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的轉(zhuǎn)化體特異性引物對同一組標(biāo)準(zhǔn)品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行SYBR Green I實時熒光定量PCR擴(kuò)增，分別得到PCR擴(kuò)增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，該曲線的斜率為-3. 25，相關(guān)系數(shù)R2為0. 999。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的轉(zhuǎn)化體特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，該曲線的斜率為-3. 332，相關(guān)系數(shù)R2為0.999.因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式
樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb 拷貝數(shù))X 100%可以計算出待測樣品中轉(zhuǎn)基因成分MIR162的百分含量。實施例3轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA，按5倍倍比分別稀釋至5°，5—1，5_2，5_3， 5^4 ;相應(yīng)的拷貝數(shù)設(shè)為100000，20000，4000，800，160，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，檢測擴(kuò)增的重復(fù)性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10umol/L備用。合成的MIR162引物與探針序列如下MIR162-F 5/ -CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；MIR162-R 5/ -GTGACTCCCTTAATTCTC-3'；MIR162-P FAM-5/ -CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3' -Eclipse。玉米內(nèi)標(biāo)引物與探針(zSSIIb)采用國家標(biāo)準(zhǔn)引物與探針，其序列如下zSSIIb-F 5/ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；zSSIIb-R 5/ -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；zSSIIb-P FAM-5/ -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRA。擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL, 2 X Premix Ex Taq (Rox) 12. 5uL,濃度為 10umol/L 的 Forwardprimer IuL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer IuL,濃度為 10umol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ;擴(kuò)增反應(yīng)條件95 °C IOmin 預(yù)變性；95 °C 15s, 50°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計45個循環(huán)，每個試樣重復(fù)3次，同時設(shè)立無菌雙蒸水(ddH20，空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品(鄭單958，陰性)對照。結(jié)果通過對不同MIR162標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為100000，20000，4000，800，160的DNA進(jìn)行TaqMan實時突光定量PCR擴(kuò)增,計算機軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,縱坐標(biāo)為Ct,橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)Bnn (I%,0.5%,0. I%,0.05%,0.01% ) 性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的轉(zhuǎn)化體特異性引物對同一組標(biāo)準(zhǔn)品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行TaqMan實時熒光定量PCR擴(kuò)增，分別得到 PCR擴(kuò)增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 4所示，該曲線的斜率為-3. 557，相關(guān)系數(shù)R2為0. 999。轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的轉(zhuǎn)化體特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，該曲線的斜率為-3. 556，相關(guān)系數(shù)R2為0.997.因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量=(外源基因MIR162拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb 拷貝數(shù))X 100%可以計算出待測樣品中轉(zhuǎn)基因成分MIR162的百分含量。以上結(jié)果可以證明，本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測提供了簡單、可靠的測定方法，可以用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的檢測。本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識提供了一種強有力的技術(shù)支撐，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的手段。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物組成，其序列如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示。
2.權(quán)利要求I所述的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物在定性檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物在SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件中的應(yīng)用。
4.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的熒光標(biāo)記探針，其特征在于所述探針的序列如 SEQ ID NO. 3所示，探針的5'端連接一個熒光報告集團(tuán)FAM，3'端連接有一個熒光淬滅集團(tuán) Eclipse。
5.權(quán)利要求I所述的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物及權(quán)利要求4所述的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的熒光標(biāo)記探針在TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件中的應(yīng)用。
6.一種定性檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件的方法，其特征在于步驟為(1)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用MIR162-F和MIR162-R引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；若存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品中含有MIR162轉(zhuǎn)化事件；若不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含有MIR162轉(zhuǎn)化事件。
7.一種SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件的方法，其特征在于步驟為(1)建立MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物的SYBRGreen I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和 zSSIIb基因的SYBR Green I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線①提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入 MIR162轉(zhuǎn)化事件的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制MIR162轉(zhuǎn)化事件的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線.(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的MIR162基因的定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)基因玉米MIR162 基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟⑴①和⑵中，擴(kuò)增的參數(shù)如下:擴(kuò)增反應(yīng)體積為 20uL, 2XPremix Ex Taq(Rox) IOuL,濃度為 10umol/L 的 Forward primer 0.4uL,濃度為 lOumol/L 的 Reverse primer 0. 4uL, ddH20 8. 2uL, DNA 模板 IuL ;擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s，50。。30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計 40個循環(huán)。
9.一種TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件的方法，其特征在于步驟為(1)建立MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物的TaqMan探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和 zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線①提取轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入 MIR162轉(zhuǎn)化事件的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制MIR162轉(zhuǎn)化事件的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線.(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的MIR162基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟(I)①和(2)中，擴(kuò)增的參數(shù)如下擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL,2XPremix Ex Taq(Rox) 12. 5uL,濃度為10umol/L的 Forward primer IuL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer IuL,濃度為 lOumol/L 的 TaqMan probeO. 5uL, ddH20 4uL, DNA 模板 IuL ；擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s, 50°C 30s, 72°C 30s，在72°C收集熒光信號，共計45個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的熒光標(biāo)記探針，序列如SEQ ID NO.3所示，探針的5′端連接一個熒光報告集團(tuán)FAM，3′端連接有一個熒光淬滅集團(tuán)Eclipse。本發(fā)明還公開了利用該引物和探針進(jìn)行基因特異性定性PCR、SYBR Green I實時熒光定量PCR和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有MIR162轉(zhuǎn)化事件的檢測方法，該檢測方法經(jīng)實驗驗證，靈敏、準(zhǔn)確、簡單、可靠，具有廣闊的應(yīng)用價值與市場前景。
文檔編號C12Q1/68GK102586442SQ20121005359
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者孫紅煒, 張廣遠(yuǎn), 李凡, 楊淑珂, 路興波 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所