專利名稱：一株高產(chǎn)多糖的菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー株膠質(zhì)芽孢桿菌，又名硅酸鹽細(xì)菌 {Bacillus mucilaginosus) SM-OI的菌種及利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖的方法。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus,是ー種能夠強(qiáng)烈分解娃酸鹽礦物和磷灰石的細(xì)菌，又被稱為硅酸鹽細(xì)菌或鉀細(xì)菌。其在分類學(xué)上屬于細(xì)菌域、厚壁菌門、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬。硅酸鹽細(xì)菌在エ業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工等眾多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。多糖是ー類廣泛存在于自然界的生物體產(chǎn)生的獨(dú)特的生物大分子。它具有各種各樣特殊的且在大多數(shù)情況下相當(dāng)復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，不同的生理功能和廣泛的(潛在的)應(yīng)用價(jià)值。近些年來微生物多糖作為ー種新型發(fā)酵產(chǎn)品，具有獨(dú)特的物化性質(zhì)，已作為乳化剤、 增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑、懸浮劑和潤滑劑等應(yīng)用于石油、化工、食品、制藥、環(huán)保和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。膠質(zhì)芽孢桿菌在生長過程中能產(chǎn)生豐富的莢膜多糖，此多糖是ー種酸性多糖分為中性部分和酸性部分，中性部分多糖的單糖組分主要為葡萄糖，半乳糖，甘露糖，酸性部分為葡萄糖醛酸。有報(bào)道該多糖已被用于陶瓷エ業(yè)中的添加剤，改善陶瓦、瓷器、餐具和磚的彎曲強(qiáng)度、機(jī)械強(qiáng)度并降低能耗；該多糖還具有良好的絮凝效果已被用于絮凝劑，且絮凝對象較廣，用于處理活性污泥，處理污水，浄化水質(zhì)。由于多糖同透明質(zhì)酸、黃原膠、熱凝膠、 結(jié)冷膠、威蘭膠一祥在一定的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出很好的流變學(xué)特性，非牛頓流體具有假塑流變性其保濕性和成膜性在化妝品方面也具有廣泛的應(yīng)用前景。目前已報(bào)道的多糖產(chǎn)生菌生產(chǎn)多糖時(shí)，培養(yǎng)基成分營養(yǎng)豐富，通常會造成產(chǎn)物得率不高，副產(chǎn)物多，產(chǎn)品后續(xù)分離純化過程復(fù)雜等問題，并且多糖生產(chǎn)大多停留在實(shí)驗(yàn)室水平。因此篩選得到一株?duì)I養(yǎng)要求低、多糖產(chǎn)量高又適合エ業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)多糖的菌株具有十分重要的意義。本發(fā)明的目的在于提供并鑒定一株高產(chǎn)多糖的膠質(zhì)芽孢桿菌OfecWAz1S muci laginosus )SM-01,以及利用該菌株發(fā)酵產(chǎn)生多糖的方法。該菌株發(fā)酵生產(chǎn)多糖的營養(yǎng)要求較低，并且在實(shí)驗(yàn)室條件下該菌株產(chǎn)多糖得率可高達(dá)60%，實(shí)踐證明該菌株還比較適合中試發(fā)酵生產(chǎn)，分離提純過程簡單，更符合エ業(yè)化生產(chǎn)低投入高產(chǎn)出的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人從土壤樣品中分離篩選獲得ー株膠質(zhì)芽孢桿菌OfeciBM fiK/ci/agifliosttsOSM-Ol,該菌于2012年2月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5766。對于膠質(zhì)芽孢桿菌的菌種鑒定，其步驟如下
(I)形態(tài)特征的觀察將菌株SM-Ol接種于無氮固體平板培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)；挑取單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)、大小。(2)分子生物學(xué)鑒定提取菌株SM-Ol的基因組DNA、16S rDNA的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的回收純化與測序(序列測定工作由上海生工生物工程有限公司完成)。將測得的序列在 NCBI中利用Blast軟件進(jìn)行比對，選取同源性較高的序列用DNAMAN軟件編輯后，利用軟件 CLUSTAL X ver. I. 81 和 MEGA ver. 3. 1，基于菌株的 16S rDNA 序列以 neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。應(yīng)用上述微生物發(fā)酵生產(chǎn)的方法，其步驟如下
(1)米用保藏號為CGMCC No. 5766 的膠質(zhì)芽抱桿菌Cfeci77w5· mucilaginosus) SM-Ol 為生產(chǎn)菌株，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到無氮固體培養(yǎng)基上;
(2)制備SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取步驟(I)中固體培養(yǎng)基上的SM-Ol菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有40-80 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為28-32°C，置搖床上以150-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-32 h至對數(shù)生長期，即得到SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(2)中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8%(w/w)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500 mL錐形瓶中裝40-80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28_32°C，在 150-200 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)60-84 h，得多糖發(fā)酵液。(4)多糖的分離提取取步驟(3)所得發(fā)酵液按體積稀釋2-4倍，將稀釋后的發(fā)酵液于冷凍離心機(jī)8000-12000rpm，4°C離心20_40min去除菌體，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積，加2-4倍體積95%乙醇并不斷攪拌，4°C靜置12-24h，4000-6000rpm，4°C，離心 10-20min得到沉淀，將沉淀用適量乙醇抽提3次，用等體積去離子水復(fù)溶沉淀，多糖溶液置4°C透析過夜，加入2-4倍體積95%乙醇不斷攪拌，4°C放置24h，4000-6000rpm，4°C離心 10-20min得沉淀，將沉淀于真空干燥機(jī)烘干或復(fù)溶后冷凍干燥得多糖。(5)多糖含量測定精確稱取Ig多糖發(fā)酵液，加3倍質(zhì)量95%乙醇不斷攪拌至沉淀完全，4°C靜置12-24h，4000-6000rpm，4°C離心10_20min得到沉淀，將所得沉淀于烘箱中 80 V烘干至恒重，稱重，每個(gè)樣品重復(fù)三次。其中步驟(I)中所述的固體培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖5-15 g/L ;尿素O. 1-1 g/L ；K2HPO4 O. 2-2 g/L ；MgS04 · 7H20 0. 2_2g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；CaCO3 l_5g/L ；瓊脂粉 10-20 g/L ；pH 7.0-7. 5，121°C高壓蒸汽滅菌20min;步驟(2)所述種子培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖 5-15 g/L ;尿素 O. 1-lg/L ；K2HPO4 O. 2-2 g/L ；MgS04 · 7H20 0. 2_2g/L ；NaCl
0.2-2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比同步驟(2)。本發(fā)明所述的膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeci77i/5·皿SM-Ol菌株所產(chǎn)多糖量高，并且能達(dá)到低投入高產(chǎn)出的要求，是一株極具開發(fā)研究價(jià)值的生產(chǎn)菌株。


圖I為膠質(zhì)芽孢桿菌在固體平板上的形態(tài)。圖2為膠質(zhì)芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中的形態(tài)。圖3為通過Neighbor-Joining法所構(gòu)建的基于膠質(zhì)芽孢桿菌(ZfeciJJrW1S muci laginosus ) SM-OI的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4為本發(fā)明的膠質(zhì)芽孢桿菌iBacillus muci laginosus )SM-01在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)多糖的過程曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I膠質(zhì)芽孢桿菌muci laginosus ) SM-OI的分離鑒定以及菌株的保藏
(I) 膠質(zhì)芽孢桿菌muci laginosus ) SM-OI的分離、篩選本發(fā)明中稱取I.0-2.0 g 土樣于250 mL三角瓶中，用10-50 mL生理鹽水懸浮，然后置于水浴鍋中，80°C處理10 min，冷卻后進(jìn)行梯度稀釋，取0.2 mL稀釋液涂布于無氮固體平板上進(jìn)行初篩。30°C條件下培養(yǎng)48 h后，選取菌落圈較大的單菌落進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。挑取單菌落接種到新鮮的液體種子培養(yǎng)基，30°C、150-200 r/min培養(yǎng)24 h，再以5% (v/v)的接種量接入裝液量為50 mL/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60h，精確稱取Ig發(fā)酵液， 95%こ醇沉淀法提純，將沉淀于80°C烘箱中烘干至恒重，稱量后計(jì)算多糖產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)菌株。(2)膠質(zhì)芽抱桿菌 CfeciBw1S muci laginosus ) SM-OI 的鑒定生理生化鑒定參照伯杰細(xì)菌鑒定手冊第8版。該菌株在無氮固體平板上培養(yǎng)48h后形成無色、透明、邊緣整齊的菌落，像半顆玻璃珠落在培養(yǎng)基上。菌落直徑約0.5-1 cm，表面光滑、濕潤而富有光澤，挑起時(shí)粘稠而難與培養(yǎng)基分離。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體為革蘭氏陽性菌，短桿狀，末端呈圓形，菌體進(jìn)入對數(shù)期后周圍開始形成ー層橢圓形莢膜，定中后期易形成芽孢，該菌在普通的LB及肉湯培養(yǎng)基上均無法生長。分子生物學(xué)鑒定在GenBank中與已知序列進(jìn)行BLAST比對后的結(jié)果采用CLUSTAL X ver. I. 81和MEGA ver. 3. I軟件,用neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯不，菌株SM-Ol與膠質(zhì)芽抱桿菌ifeciパ心SM/ciムAHZl (EU592042)的同源性達(dá)到99%，可知SM-Ol菌株與該菌株屬于同一個(gè)分枝。故結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定以及 16S rDNA序列分析的結(jié)果,判定菌株SM-Ol即為膠質(zhì)芽孢桿菌muci laginosus 0(3)菌株保藏挑取一環(huán)膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol菌株接種于無氮液體培養(yǎng)基中，28-32°C，150 r/min振蕩培養(yǎng)40-48h后，取0. 5 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入裝有0. 5mL的60%甘油保藏管中，-80°C冷凍保藏。該菌2012年2月16日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No. 5766。
實(shí)施例2膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol在500ml搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)糖。(I)制備膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取無氮固體培養(yǎng)基上的膠質(zhì)芽孢桿菌(ガSciJrJrW1S muci laginosus ) SM-Ol菌株一環(huán),
接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20_28h至對數(shù)期，即制得膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus )SM-01菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖5-15 g/L ；尿素0.トlg/L ；K2HPO4 0. 2-2 g/L ；MgS04 7H20 0. 2_2g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C條件下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵60 h得多糖發(fā)酵液。
實(shí)施例3膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus)在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)糖。(I)制備膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取無氮固體培養(yǎng)基上的膠質(zhì)芽孢桿菌mucilaginosus ) SM-Ol菌株一環(huán)，
接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-28 h至對數(shù)期，即制得膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖5-15 g/L ;尿素0. 1-lg/L ；K2HPO4 0. 2-2 g/L ；MgS04 7H20 0. 2_2g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C條件下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵20-28 h，菌體進(jìn)入對數(shù)期。(4) 5L發(fā)酵罐發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在30°C條件下，轉(zhuǎn)速為500r/min，通氣量為300VVm，發(fā)酵48h得多糖發(fā)酵液。
實(shí)施例4膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol在15L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)糖。(I)制備膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取無氮固體培養(yǎng)基上的膠質(zhì)芽孢桿菌muci laginosus ) SM-Ol菌株一環(huán)，
接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-28 h至對數(shù)期，即制得膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)蔗糖 5-15 g/L ;尿素 0. 1-lg/L ;K2HP04 0.2-2 g/L ;MgS04 7H20 0. 2_2g/L ; NaCl 0. 2-2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C條件下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵20_28h至對數(shù)期。(4)15L發(fā)酵罐發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys muci laginosus )SM-01菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的IOL發(fā)酵培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中，在30°C條件下，轉(zhuǎn)速為500r/min，通氣量為300VVm，發(fā)酵48h得多糖發(fā)酵液。
實(shí)施例5膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol在50L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)糖。(I)制備膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取無氮固體培養(yǎng)基上的膠質(zhì)芽孢桿菌muci laginosus ) SM-Ol菌株一環(huán)，
接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-28 h至對數(shù)期，即制得膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖5-15 g/L ;尿素0.トlg/L ；K2HP04 0. 2-2 g/L ；MgS04 7H20 0. 2-2g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C條件下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵20_24h至對數(shù)期。(4) 5L發(fā)酵罐發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在30°C條件下，轉(zhuǎn)速為500r/min，通氣量為300vvm，發(fā)酵20h得多糖發(fā)酵液。(5) 50L發(fā)酵罐發(fā)酵將上述5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)到對數(shù)期的細(xì)胞液培養(yǎng)物為種子以 1% (v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的30L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，在30°C條件下， 轉(zhuǎn)速為500r/min，通氣量為400VVm，發(fā)酵60h得多糖發(fā)酵液。
實(shí)施例6膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus )SM-01在500公斤發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)糖。(I)制備膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取無氮固體培養(yǎng)基上的膠質(zhì)芽孢桿菌(ガSciJrJrW1S muci laginosus ) SM-Ol菌株一環(huán),
接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20_28h至對數(shù)期，即制得膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus )SM-01菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖5-15 g/L ;尿素0.トlg/L ；K2HP04 0. 2-2 g/L ；MgS04 7H20 0. 2-2g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C條件下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵20-24 h至對數(shù)期。(4)500公斤發(fā)酵罐發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌muci laginosus ) SM-OI 菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以3%。(v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的350公斤發(fā)酵培養(yǎng)基的500公斤發(fā)酵罐中，在30-31°C條件下，通氣量為25Nm3/h，轉(zhuǎn)速為100_150r/min，，發(fā)酵 72h。
實(shí)施例7膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol在It發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)糖。(I)制備膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取無氮固體培養(yǎng)基上的膠質(zhì)芽孢桿菌(ガSciJrJrW1S muci laginosus ) SM-Ol菌株一環(huán),
接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-24 h至對數(shù)期，即制得膠質(zhì)芽孢桿菌{Bacillus muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為蔗糖5-15 g/L ;尿素0.トlg/L ；K2HP04 0. 2-2 g/L ；MgS04 7H20 0. 2-2g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；CaCO3 3_8g/L，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。(3)搖瓶發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌(ifeciBys muci laginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C條件下，置于搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵20-24 h至對數(shù)期。
(4) It發(fā)酵罐發(fā)酵將上述膠質(zhì)芽孢桿菌mucilaginosus) SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以1%。(v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的700公斤發(fā)酵培養(yǎng)基的It 發(fā)酵罐中，在30-32°C條件下，通氣量為30Nm3/h，轉(zhuǎn)速為100_150r/min，，發(fā)酵84h。
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)多糖的菌株，該菌株為膠質(zhì)芽孢桿菌，又名硅酸鹽細(xì)菌UaciJAz1S SM/ciI,該菌于2012年2月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5766。
2.一種利用膠質(zhì)芽孢桿菌SM-Ol發(fā)酵生產(chǎn)微生物多糖的方法，其特征為按以下步驟生產(chǎn)斜面種子培養(yǎng)采用保藏號為CGMCC No. 5766的膠質(zhì)芽孢桿MiBacillus 為生產(chǎn)菌株，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到無氮固體培養(yǎng)基上；搖瓶種子培養(yǎng)挑取步驟(I)中固體培養(yǎng)基上的SM-Ol菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有 40-80 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為28-32°C，置搖床上以150-200 r/min 的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)20-32 h至對數(shù)生長期，即得到SM-Ol菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；發(fā)酵罐培養(yǎng)將步驟(2)中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以4-8% (w/w)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500 mL錐形瓶中裝40-80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28-32°C，在 150-200 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)60-84 h，得多糖發(fā)酵液；多糖的分離提取取步驟(3)所得發(fā)酵液按體積稀釋2-4倍，將稀釋后的發(fā)酵液于冷凍離心機(jī)SOOO-I^OOOrpnufC離心20_40min去除菌體,取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積，加2-4倍體積95%乙醇并不斷攪拌，4°C靜置12-24h，4000-6000rpm，4°C，離心10_20min 得到沉淀，將沉淀用適量乙醇抽提3次，用等體積去離子水復(fù)溶沉淀，多糖溶液置4°C透析過夜，加入2-4倍體積95%乙醇不斷攪拌，4°C放置24h，4000-6000rpm, 4°C離心10_20min得沉淀，將沉淀于真空干燥機(jī)烘干或復(fù)溶后冷凍干燥得多糖；其中步驟(I)中所述的固體培養(yǎng)基的成分及配比為(g/L):蔗糖5-15 ;尿素0. 1-1 ； K2HPO4 0. 2-2 ；MgS04 · 7H20 O. 2-2 ；NaCl O. 2-2 ；CaCO3 1-5 ；瓊脂粉 10-20，pH 7. 0-7. 5， 121°C高壓蒸汽滅菌20min;步驟(2)所述種子培養(yǎng)基的成分及配比為(g/L):蔗糖5_15 ;尿素 0. 1-1 ;K2HP04 0. 2-2 ;MgS04 · 7H20 O. 2-2 ;NaCl 0· 2-2 ;CaC03 3-8，121°C 高壓蒸汽滅菌 20min ;步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比同步驟(2)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株高產(chǎn)多糖的膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)SM-01菌株及利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖的方法，該菌株于2012年2月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.5766。膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)SM-01菌株在蔗糖含量為10g/L的培養(yǎng)基中，多糖的產(chǎn)量最高可達(dá)6g/L，轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)60%。
文檔編號C12R1/07GK102586151SQ201210054829
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者史勁松, 李會, 李恒, 李潔, 竇文芳, 許正宏 申請人:江南大學(xué)