專利名稱：一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法
技術領域：
本發明屬于微生物的篩選方法領域，特別涉及一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法。
背景技術：
有機氯化合物由于其突出的持久性、生物積累性和生物毒性等特征而受到全世界的廣泛關注。雖然目前很多國家已禁止了對有機氯農藥的使用，但它們仍廣泛的殘留于農業土壤、水體以及食物當中，對人類健康造成巨大的威脅。由于微生物能夠通過礦化、共代謝、濃縮等作用對有機氯農藥進行特異性降解的優勢明顯，微生物原位降解修復技術是當前有機氯污染土壤的主流。固氮藍藻主要是藍藻門念珠藻目(Nostocales)魚腥藻屬(Anabeana)和念珠藻屬 (Nostoc)的多種絲狀異型胞,能夠在固氮酶作用下從大氣中固定N2轉變為NH4+等生源氮素。固氮藍藻固氮作用主要應用于水稻田營養氮素的提供，對于水稻土肥力穩定，以及水稻生長和稻米產量增加具有重要的現實意義。近年來對固氮藍藻具有降解有機氯化合物能力的發現，使得固氮藍藻在稻田的應用具有顯著的“固氮”和“降解”雙重作用。因此對固氮藍藻原位修復水稻土的研究具有不可替代的優勢。一直以來，有關固氮藍藻的科學研究主要集中在固氮藻種的固氮活性測定及其生理生化機制分析，固氮調控基因及固氮酶結構表征等方面，有關藻種篩選的特別是抗逆性藻種的篩選研究還未深入，且針對固氮藍藻對土壤污染物的降解研究也僅限于實驗室的小試階段，實驗主要將培養于液體培養基中固氮藍藻暴露于污染物中，通過批次實驗來研究固氮藍藻對某種污染物的降解效率，降解半衰期，降解動力學等參數。該方法簡便易行，對掌握固氮藍藻的降解特異性及其降解機理有很好的作用，但該方法并不能很好的解決篩選和分離具有降解功能藻種的技術難題，以實現原位微生物修復的現實意義。目前已有的藻類篩選技術主要集中在對能源藻種的篩選以及通過微生物平板篩選、離體篩選以及基因克隆等技術手段實現。微生物平板篩選方法雖然能夠起到篩選的作用，但很難解決如固氮藍藻生長需氧量等條件，且篩選效率較低，很難在短時間內篩選出大量的目標藻種；離體篩選和基因克隆雖然目標性強，能夠快速篩選出所需的目標藻種，但其只有在前期鑒定出功能基因的基礎上才能實驗，且花費成本大，不利于原位技術的推廣應用。

發明內容
為了解決現有篩選方法中存在的難以滿足固氮藍藻生長需氧量條件、篩選效率較低等問題，本發明提供一種成本低，操作簡便，效率高，特異性強，利于工程推廣的具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法。本發明采用的技術方案是一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于所述方法包括以下步驟I)配置無氯培養基，加入瓊脂糖后滅菌，待冷卻至60°C加入多氯聯苯，混合均勻后倒入分離篩選裝置中相應的篩選區中，冷卻固定，作為篩選藻種的固體培養基；2)將采集至野外土壤中經過預培養的混合藻液進行離心分離，棄上清，用無氯培養基重懸細胞，混勻后得到所述混合藻液的濃縮液；3)將步驟2)中得到的混合藻液的濃縮液倒入步驟I)中的固體培養基上；4)將所述分離篩選裝置于培養室恒溫培養。本發明的具體原理為多氯聯苯的微生物降解的基本原理為脫氯或脫氯化氫，因此將混合藻液暴露于含有多氯聯苯的無氯固體培養基中，因固氮藍藻生長環境中缺乏生長所必須的氯離子，就會誘導具有潛在脫氯功能的固氮藍藻降解多氯聯苯脫氯或氯化氫，從而達到自身生長和多氯聯苯降解的目的，因此能夠脫氯的固氮藍藻藻種得以存活且長勢良好，藻種密度變大，無法脫氯的藻種難以存活或長勢較弱或長勢緩慢。本發明中使用的無氯培養基理論上只需不含氯離子，且能夠提供固氮藍藻生長所需的必要無機鹽即可；本發明是以其他形式鈣鹽代替氯化鈣，本發明優先選用磷酸二氫鈣； 本發明需將多氯聯苯均勻分散于固體培養基中，達到理想的篩選目的。本發明具體推薦一種具有降解功能固氮藍藻的分離篩選裝置，包括可拆卸的平板底座和平板盒蓋；所述的平板底座包括底板和桶體，所述底板和所述桶體通過卡扣固定連接；所述桶體內設有多個可拆卸的環形培養基擋板，將所述底板分割成不同大小的環形篩選區，所述培養基擋板通過卡扣固定在所述底板上；所述平板盒蓋上設有用于固定所述平板底座的固定裝置和與所述培養基擋板配合使用的環形培養基定型模具，頂部設有隔板裝置，所述培養基定型模具通過卡扣固定在所述平板盒蓋上；所述培養基擋板內設有卡槽，所述平板盒蓋上設有與所述卡槽相對應位置的固定體，所述固定體嵌入所述卡槽將所述培養基擋板和所述平板盒蓋固定相連。進一步，所述固定體是末端呈60°角的實心三角錐，所述卡槽是末端呈60°角的空心三角錐，所述固定體通過與所述卡槽鑲嵌固定所述培養基擋板和所述平板盒蓋。進一步,所述培養基擋板可根據不同的實驗需求選取內徑為20mm-75mm的圓環。進一步,所述培養基定型模具是半徑為17. 5mm_77. 5mm的圓環。進一步，所述隔板裝置內裝有可替換的隔菌透氣薄膜。進一步，本發明所述的裝置材料均為透明PVE材料。本發明中，上述分離篩選裝置的使用方法首先根據實驗需求設計實驗分組，選擇合適的培養基擋板，并通過卡扣將其安裝固定在平板底座上，形成具有環形的獨立小單元的篩選區。將加入瓊脂糖和多氯聯苯的已滅菌的固體培養基倒入相應的篩選區中冷卻固定。選擇和培養基擋板配套的培養基定型模具，并將其通過卡扣固定于平板盒蓋上，再將平板盒蓋通過固定裝置和固定體與平板底座相固定，形成密閉的空間。此時培養基定型模具伸入冷卻中的培養基中進行造模。隔板裝置中安裝有隔菌透氣的薄膜以達到隔絕細菌，提供氧氣的目的。待培養基冷卻后，將平板盒蓋小心拿起，卸下固定裝置和固定體。取預培養后的混合藻液，離心棄上清，用無氯培養基重懸混勻后均勻平鋪于已造模好的篩選區內，再次蓋上平板盒蓋，于指定條件下進行培養篩選。待實驗完成后，挑選適合的藻落進行后續培養，如需更換培養基，只需解開卡扣，卸下底板和平板盒蓋即可。
進一步，步驟I)中所述的無氯培養基中各物質的配方濃度為硝酸鈉I. 5g/L，七水合硫酸鎂O. 075g/L,乙二胺四乙酸二鈉O. 001g/L，三水磷酸氫二鉀O. 04g/L，磷酸二氫鈣 O. 057g/L，碳酸鈉O. 02g/L,檸檬酸O. 006g/L,檸檬酸鐵銨O. 006g/L, A5溶液lmL/L，所述A5 溶液中各物質的配方濃度為硼酸2. 86g/L，氯化錳I. 81g/L，七水合硫酸鋅O. 222g/L，五水合硫酸銅O. 079g/L，二水合鑰酸鈉O. 39g/L，六水合硝酸鈷O. 39g/L。進一步，步驟I)中所述的瓊脂糖的用量為O. 1-0. 7g，所述多氯聯苯的用量為 O. 01-0. 35mg。進一步，步驟I)中所述的固體培養基的用量為10_70mL。進一步，步驟2)中所述的預培養的混合藻液為1/2BG11培養基。進一步，步驟2)中所述的混合藻液的濃縮液的細胞密度為2X 106-107Cells/mL ； 所述的離心轉速為2500-4500rpm,離心時間為10_30min ;更進一步,優選的所述的混合藻液的濃縮液的細胞密度為5X106cells/mL，離心轉速為4000rpm，離心時間為lOmin。進一步，步驟4)中所述的恒溫培養條件為溫度25°C，濕度70%，光照 20001ux，光暗比 I I。本發明中技術人員應根據實際混合藻液的情況，合理選擇混合藻液的預培養方案，如藻密度較大則可直接進行篩選，如藻密度較少，則需進行預培養，本發明優先選擇 1/2BG11培養基為預實驗培養基,如混合藻液不適合在同一種培養基上培養，還需進行不同培養基的預培養篩選。本發明的有益效果體現在篩選效率高，能在短時間內篩選出大量的目標藻種，篩選成本低，利于實際應用推廣，操作簡便且特異性強，是目前關于固氮藍藻篩選較為有效的方法，具有廣泛的應用前景。


圖I是本發明使用的分離篩選裝置的平板盒蓋結構示意圖。圖2是本發明使用的分離篩選裝置的平板底座結構示意圖。圖3是本發明實施例2的篩選效果圖。
具體實施例方式實施例I一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于所述方法包括以下步驟I)配置無氯培養基，加入瓊脂糖后滅菌，待冷卻至60°C加入多氯聯苯，混合均勻后倒入分離篩選裝置中相應的篩選區中，冷卻固定，作為篩選藻種的固體培養基；2)將采集至野外土壤中經過預培養的混合藻液進行離心分離，棄上清，用無氯培養基重懸細胞，混勻后得到所述混合藻液的濃縮液；3)將步驟2)中得到的混合藻液的濃縮液倒入步驟I)中的固體培養基上；4)將所述分離篩選裝置于培養室恒溫培養。本發明的具體原理為多氯聯苯的微生物降解的基本原理為脫氯或脫氯化氫，因此將混合藻液暴露于含有多氯聯苯的無氯固體培養基中，因固氮藍藻生長環境中缺乏生長所必須的氯離子，就會誘導具有潛在脫氯功能的固氮藍藻降解多氯聯苯脫氯或氯化氫，從而達到自身生長和多氯聯苯降解的目的，因此能夠脫氯的固氮藍藻藻種得以存活且長勢良好，藻種密度變大，無法脫氯的藻種難以存活或長勢較弱或長勢緩慢。本發明中使用的無氯培養基理論上只需不含氯離子，且能夠提供固氮藍藻生長所需的必要無機鹽即可；本發明是以其他形式鈣鹽代替氯化鈣，本發明優先選用磷酸二氫鈣； 本發明需將多氯聯苯均勻分散于固體培養基中，達到理想的篩選目的。本發明具體推薦一種具有降解功能固氮藍藻的分離篩選裝置，特點是包括可拆卸的平板底座I和平板盒蓋2 ;所述的平板底座I包括底板11和桶體12，所述底板11和所述桶體12通過卡扣13固定連接；所述桶體12內設有三個可拆卸的環形培養基擋板15，將所述底板11分割成四個環形篩選區17，所述培養基擋板15通過卡扣14固定在所述底板11 上；所述平板盒蓋2上設有用于固定所述平板底座I的固定裝置21和四個與所述培養基擋板15配合使用的環形培養基定型模具23，頂部設有隔板裝置25，所述培養基定型模具23 通過卡扣24固定在所述平板盒蓋2上；所述培養基擋板15內設有卡槽16，所述平板盒蓋 2上設有與所述卡槽16相對應位置的固定體22，所述固定體22嵌入所述卡槽16將所述培養基擋板15和所述平板盒蓋2固定相連。進一步，所述固定體22是末端呈60°角的實心三角錐，所述卡槽16是末端呈 60°角的空心三角錐，所述固定體22通過與所述卡槽16鑲嵌固定所述培養基擋板15和所述平板盒蓋2。進一步，所述培養基擋板15可根據不同的實驗需求選取內徑為20mm-75mm的圓環。進一步,所述培養基定型模具23是半徑為17. 5mm-77. 5mm的圓環。進一步，所述隔板裝置25內裝有可替換的隔菌透氣薄膜。進一步，本發明所述的裝置材料均為透明PVE材料。本發明中，上述分離篩選裝置的使用方法首先根據實驗需求設計實驗分組，選擇合適的培養基擋板，并通過卡扣將其安裝固定在平板底座上，形成具有環形的獨立小單元的篩選區。將加入瓊脂糖和多氯聯苯的已滅菌的固體培養基倒入相應的篩選區中冷卻固定。選擇和培養基擋板配套的培養基定型模具，并將其通過卡扣固定于平板盒蓋上，再將平板盒蓋通過固定裝置和固定體與平板底座相固定，形成密閉的空間。此時培養基定型模具伸入冷卻中的培養基中進行造模。隔板裝置中安裝有隔菌透氣的薄膜以達到隔絕細菌，提供氧氣的目的。待培養基冷卻后，將平板盒蓋小心拿起，卸下固定裝置和固定體。取預培養后的混合藻液，離心棄上清，用無氯培養基重懸混勻后均勻平鋪于已造模好的篩選區內， 再次蓋上平板盒蓋，于指定條件下進行培養篩選。待實驗完成后，挑選適合的藻落進行后續培養，如需更換培養基，只需解開卡扣，卸下底板和平板盒蓋即可。進一步，步驟I)中所述的無氯培養基中各物質的配方濃度為硝酸鈉I. 5g/L，七水合硫酸鎂0. 075g/L,乙二胺四乙酸二鈉0. 001g/L，三水磷酸氫二鉀0. 04g/L，磷酸二氫鈣 0. 057g/L，碳酸鈉0. 02g/L,檸檬酸0. 006g/L,檸檬酸鐵銨0. 006g/L, A5溶液lmL/L,所述 A5溶液的配方為硼酸2. 86g/L，氯化錳I. 81g/L，七水合硫酸鋅0. 222g/L，五水合硫酸銅 0. 079g/L，二水合鑰酸鈉0. 39g/L，六水合硝酸鈷0. 39g/L。進一步，步驟I)中所述的瓊脂糖的用量為0. 1-0. 7g，所述多氯聯苯的用量為
6O. 01-0. 35mg。進一步，步驟I)中所述的固體培養基的用量為10_70mL。進一步，步驟2)中所述的預培養的混合藻液為1/2BG11培養基。進一步，步驟2)中所述的混合藻液的濃縮液的細胞密度為2X 106-107Cells/mL ； 所述的離心轉速為2500-4500rpm,離心時間為10_30min ;更進一步,優選的所述的混合藻液的濃縮液的細胞密度為5X106cells/mL，離心轉速為4000rpm，離心時間為lOmin。進一步，步驟4)中所述的恒溫培養條件為溫度25°C，濕度70%，光照2000lux， 光暗比I : I。本發明中技術人員應根據實際混合藻液的情況，合理選擇混合藻液的預培養方案，如藻密度較大則可直接進行篩選，如藻密度較少，則需進行預培養，本發明優先選擇 1/2BG11培養基為預實驗培養基,如混合藻液不適合在同一種培養基上培養，還需進行不同培養基的預培養篩選。實施例2本實施例所述底板11半徑為90mm ;所述桶體12高為20mm ;所述培養基擋板15 高度為20mm,寬度為5mm ;所述的卡槽16是寬度為Imm,深度為10mm、末端呈60°角的空心三角錐；所述固定裝置21的高度為20mm ;所述固定體22是深度為10mm，寬度為1mm、末端呈60°角的實心三角錐；所述的培養基定型模具23為高度和厚度分別為IOmm和7mm的圓環。附圖給出了本發明其中一種實施例，即設置了 3塊培養基擋板15和相應的4塊培養基定型模具23，將篩選區17劃分為寬度為15mm的4個隔離區進行后續實驗，但本發明的實施方式不限于此。選取3塊半徑分別為27. 5mm, 47. 5mm和67. 5mm的培養基擋板15,通過卡扣13使它們固定在平板底座I上，形成4個距離為15mm的環形獨立篩選區17，裝置效果如圖2所
/Jn ο先配置無氯BGll培養基200mL(硝酸鈉O. 3g，七水合硫酸鎂O. 015g,乙二胺四乙酸二鈉O. 0002g,三水磷酸氫二鉀O. 008g,磷酸二氫鈣O. 012g,碳酸鈉O. 004g,檸檬酸
O.0012g,檸檬酸鐵銨O. 0012g,硼酸O. 572mg,氯化錳O. 362mg,七水合硫酸鋅O. 0444mg,五水合硫酸銅O. 0158mg, 二水合鑰酸鈉O. 078mg,六水合硝酸鈷O. 078mg)，再加入瓊脂糖2g， 將所得的培養基滅菌后分成4份，待冷卻至60°C后，分別加入多氯聯苯1254溶液O. Img,
O.2mg,0. 4mg和lmg,由外而內倒入上述獨立篩選區17,選擇和培養基擋板15配套的培養基定型模具23，將其通過卡扣24固定于平板盒蓋2上，再將平板盒蓋2通過固定裝置21和固定體22和平板底座I相固定，形成密閉的空間，自然冷卻造模成型。隔板裝置25中安裝有隔菌透氣的薄膜以達到隔絕細菌，提供氧氣的目的。待培養基冷卻后，將平板盒蓋2小心拿起，卸下固定裝置21和固定體22。將5X 106celIs/mL混合藻液于4000rpm離心10分鐘,棄上清，用少量液體培養基重懸混勻后均勻平鋪于已造模的獨立篩選區17內，再次蓋上平板盒蓋2，置于恒溫氣候室倒置培養2周，培養條件25±2°C ;濕度70% ;光暗比I : I。經過2周的培養，不同濃度的4個獨立篩選區都有不同程度的藻類存活，但加入Img多氯聯苯1254篩選區藻類量最少，說明該裝置能夠實現耐受多氯聯苯藻類的篩選。比較有較多藻類存活的3個獨立篩選區，我們發現，隨著固體培養基中多氯聯苯1254濃度的增大，藻類的濃度明顯減少，說明隨著多氯聯苯濃度的增大，能夠耐受并降解多氯聯苯的藻數量都在減少，這也說明該裝置能夠實現具有降解多氯聯苯功能的固氮藍藻快速有效的分離篩選的目的。本說明書實施例所述的內容僅僅是對發明構思的實現形式的列舉，本發明的保護范圍的不應當被視為僅限于實施例所陳述的具體形式，本發明的保護范圍也及于本領域技術人員根據本發明構思所能夠想到的等同技術手段。
權利要求
1.一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)配置無氯培養基，加入瓊脂糖后滅菌，待冷卻至60°C加入多氯聯苯，混合均勻后倒入分離篩選裝置中相應的篩選區中，冷卻固定，作為篩選藻種的固體培養基；2)將采集至野外土壤中經過預培養的混合藻液進行離心分離，棄上清，用無氯培養基重懸細胞，混勻后得到所述混合藻液的濃縮液；3)將步驟2)中得到的混合藻液的濃縮液倒入步驟I)中的固體培養基上；4)將所述分離篩選裝置于培養室恒溫培養。
2.如權利要求I所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟I)中所述的無氯培養基中各物質的配方濃度為硝酸鈉I. 5g/L，七水合硫酸鎂0.075g/L，乙二胺四乙酸二鈉0. 001g/L，三水磷酸氫二鉀0. 04g/L，磷酸二氫鈣0. 057g/L, 碳酸鈉0. 02g/L，檸檬酸0. 006g/L，檸檬酸鐵銨0. 006g/L, A5溶液lmL/L。
3.如權利要求I所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟I)中所述的固體培養基的用量為10-70mL。
4.如權利要求I所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟I)中所述的培養基中瓊脂糖含量為0. 1-0. 7g ;所述多氯聯苯的用量為0.01-0. 35mg。
5.如權利要求I所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟2)中所述的預培養的混合藻液為1/2BG11培養基。
6.如權利要求I所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟2)中所述的混合藻液的濃縮液的細胞密度為2X 106-107cells/mL。
7.如權利要求I 6之一所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟2)中所述的離心轉速為2500-4500rpm，離心時間為10_30min。
8.如權利要求I所述的一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，其特征在于步驟4)中所述的恒溫培養條件為溫度25°C，濕度70%，光照20001UX，光暗比
全文摘要
本發明公開了一種具有多氯聯苯降解功能固氮藍藻的分離篩選方法，所述方法包括以下步驟1)配置無氯培養基，加入瓊脂糖后滅菌，待冷卻至60℃加入多氯聯苯，混合均勻后倒入分離篩選裝置中相應的篩選區中，冷卻固定，作為篩選藻種的固體培養基，將所述固體培養基置于平板上；2)將采集至野外土壤中經過預培養的混合藻液進行離心分離，棄上清，用無氯培養基重懸細胞，混勻后得到所述混合藻液的濃縮液；3)將步驟2)中得到的混合藻液的濃縮液倒入步驟1)中的固體培養基上；4)將所述分離篩選裝置于培養室恒溫培養。本發明篩選效率高，能在短時間內篩選出大量的目標藻種，篩選成本低，利于實際應用推廣。
文檔編號C12R1/89GK102586118SQ20121005494
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者張杭君, 胡賜明, 賈秀英, 韓麗, 黃黎明 申請人:杭州師范大學