專利名稱：黃姑魚物種特異性標記引物及黃姑魚成分的分子溯源方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和食品安全領域，公開了一種食品中黃姑魚成分的溯源方法，及黃姑魚物種特異性標記引物序列。
背景技術：
食品溯源制度，也叫可追蹤系統，是食品安全管理一項重要手段，最初由歐盟為應對“瘋牛病”問題于1997 年開始逐步建立。在漁業方面的溯源主要有魚種鑒定溯源、地域溯源、生產方式溯源(野生或養殖，有機生產或集約化生產)、加工方式溯源(烘焙、油炸、輻照)等方面，因此食品鑒偽作為食品溯源的一個內容，通過對食品成分的鑒定，以及對食品標簽的核實，進而可以有效預防食品造假，從真正意義上保障消費者權益。當發生食物中毒或者過敏時，對嘔吐物等殘渣進行快速成分檢測，便于物種鑒定溯源，以及時確定是哪種食物出現問題。魚糜制品營養價值高，攜帶食用方便，原料來源豐富，不受魚種、大小的限制，可以將商品價值低但營養價值高的魚類資源，充分合理地利用。近十年來，我國冷凍魚糜、魚糜制品的生產及其出口量逐年增加，已成為重要的水產加工品種之一，2008年全國魚糜制品產量有819122t。但是，在魚糜加工中，物種的原始可識別形態特征消失，這使得物種的鑒別變得相對困難。生產商常常是采用一些與原材料成分相似的成分進行替代，比如以低價魚產品代替高附加值產品出售，一方面大大損害了消費者的利益，另一方面也造成了不正當的商業競爭。為杜絕此類現象的發生，國際上很多國家都制定了標簽法，規定在海洋食品標簽中明確海洋食品的種類和來源。由于食物產品標簽容易丟失、記錄出差、標記圖案模糊不清以及標簽容易人為改換等方面的缺點，使得標簽上的欺詐性錯誤描述是一個普遍存在的問題。因此，迫切需要一些靈敏的和可靠的檢測方法來鑒定加工海洋食品的物種來源。現代分子生物學技術因其易分型、重復性好、檢測手段簡單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認為的最具發展潛力和應用價值的快速溯源技術，其中物種的特異性鑒定PCR對樣品的需要量很少，靈敏度高、結果可靠、操作簡便，對特定物種的檢測效果良好，已被廣泛應用于豬、牛、鴕鳥、雞等的畜禽類的物種鑒定。但是目前利用物種特異性分子標記對魚糜制品等海洋深加工食品，以及對嘔吐物進行全程監測鑒定以達到對原料魚追溯的研究尚未見報道。本研究采用普通PCR方法，用一對黃姑魚的特異性引物對加工過程以及食用過程中的黃姑魚成分進行鑒定。該方法特異性強，靈敏度高，具有很高的應用價值，可為質檢部門和檢驗檢疫部門提供技術支持。

發明內容
本發明旨在提供一種黃姑魚的分子溯源和鑒定方法。本發明還提供了黃姑魚物種特異性標記引物，用于鑒定和溯源黃姑魚的成分。這種黃姑魚物種特異性標記引物，DNA序列如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示；即 上游引物序列為5'-aacctcacccttccttgtcct-31 ；下游引物序列為5'-atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'。采用該引物，可對黃姑魚成分進行溯源鑒定，包括以下步驟(I)取樣品，提取基因組DNA，得到模板DNA ；(2)采用上述黃姑魚物種特異性標記引物，PCR擴增模板DNA，擴增產物為193bpDNA片段的，鑒定結果為樣品中含有黃姑魚成分。PCR擴增產物可用凝膠電泳來檢測。優選的，步驟⑵中所述的PCR擴增條件為93 95°C預變性3. 5 5min ；32 36個循環91 95°C變性28 32s，55 57°C退火42 50s，70 73°C延伸56 65s ；然后再70 73°C延伸9 12min。更優選的PCR擴增條件為94°C預變性4min ；35個循環94°C變性30s，56°C退火45s，72。。延伸 Imin ;然后再 72°C延伸 IOmin0本發明所涉及黃姑魚的物種特異性標記引物和分子溯源方法，能對黃姑魚從原料到制品進行成分的鑒定和溯源；甚至可以對嘔吐物以及從消費者消化器官中采集的殘渣中DNA進行快速檢測；鑒定方法簡便、快速、準確。本發明可用作水產品中黃姑魚成分的鑒定及溯源，以便在食品安全事件中果斷采取措施，盡可能縮小召回范圍，最大限度地降低風險和經濟損失。本發明分析海水魚、淡水魚、禽畜肉及植物的線粒體12S rDNA基因序列，通過比較和優化條件，設計出一對針對黃姑魚的特異性PCR引物。提取黃姑魚和常用于魚糜制品原料的DNA，用該引物進行PCR擴增，證實該引物有特異性。再用該對引物對黃姑魚原料、黃姑魚魚糜、黃姑魚魚丸等各個加工階段的產品進行PCR擴增，檢測發現有很高的靈敏度。用該引物PCR擴增后所得到的黃姑魚的分子標記DNA片段大小為193bp。運用該對引物對黃姑魚魚丸加工的各個階段進行PCR檢測，都得到了 193bp的目標片段，且所設計的引物可以檢出黃姑魚比例僅占O. 5%的魚糜混合物，結果表明此對引物對黃姑魚DNA鑒定具有很高的特異性和靈敏度，從而達到了對黃姑魚進行特異性分子追溯的目的。


圖I為魚丸中常見原料物種基因組DNA提取電泳圖譜，其中，M = AHindIIImarker ；1 :黃姑魚；2 :大黃魚；3 :海鰻；4 :帶魚；5 :白鰱；6 :草魚；7 :鳙魚；8 :雞肉；9 :豬肉；10 :玉米淀粉；11 :小麥淀粉。圖2為黃姑魚魚糜各階段產品基因組DNA提取電泳圖譜，其中，M = AHindIIImarker ；1 :黃姑魚原料；2 :黃姑魚魚糜；3 :加鹽黃姑魚魚糜；4 :加工成型魚丸；5 :經沸水蒸煮魚丸；6 :經油炸的熟制魚丸；7 :經口腔咀嚼后采集魚丸碎片；8 :含胃液的魚丸嘔吐物。圖3為黃姑魚特異性引物對不同魚糜原料進行PCR擴增的電泳圖譜，其中，M :IOObp DNAladder N :陰性對照I :黃姑魚；2 :大黃魚；3 :海鰻；4 :帶魚；5 :白鰱；6 :草魚；7 :鳙魚；8 :雞肉；9 :豬肉；10 :玉米淀粉；11 :小麥淀粉。圖4為黃姑魚特異性引物對不同比例混合魚糜進行PCR擴增的電泳圖譜，其中，M :IOObp plus DNA ladder ；N :陰性對照；1 :黃姑魚魚糜0% +大黃魚魚糜100% ;2 :黃姑魚魚糜O. 5% +大黃魚魚糜99. 5% ;3 :黃姑魚魚糜1% +大黃魚魚糜99% ；4 :黃姑魚魚糜3% +大黃魚魚糜97% ；5 :黃姑魚魚糜5% +大黃魚魚糜95% ；6 :黃姑魚魚糜10% +大黃魚魚糜90% ；7 :黃姑魚魚糜100% +大黃魚魚糜0%。圖5為黃姑魚特異性引物對不同加工階段的黃姑魚產品進行PCR擴增的電泳圖譜，其中，M 100bp plus DNAladder ；N :陰性對照；1 :黃姑魚原料；2 :黃姑魚魚糜；3 :加鹽黃姑魚魚糜；4 :加工成型魚丸；5 :經沸水蒸煮魚丸；6 :經油炸的熟制魚丸；7 :經口腔咀嚼后采集魚丸碎片；8 :含胃液的魚丸嘔吐物。
圖6為實施例6對黃姑魚原料、黃姑魚魚糜、加鹽黃姑魚魚糜、加工成型魚丸(水發魚丸配方)、經沸水蒸煮魚丸、經油炸的熟制魚丸、經咀嚼后采集魚丸碎片及魚丸嘔吐物(含胃液)八個階段的樣品進行DNA提取及PCR擴增的電泳圖譜。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明。PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；DK_8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；凝膠成像系統，購自美國伯樂Bio-RAD(美國)；瓊脂糖購自上?；蚩萍加邢薰?進口分裝)。實施例I黃姑魚物種特異性引物的設計根據常用于常用魚糜原料的12S rDNA序列，設計出黃姑魚物種特異性引物Forward 5' -aacctcacccttccttgtcct-3'；Reverse 5' -atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'；目的片段約193bp，引物由上海生物工程公司合成。 實施例2魚糜制品的加工(I)取原料魚(黃姑魚、大黃魚、帶魚、白鰱、草魚、鳙魚、鰻魚等)，去頭、去內臟后清洗，采肉，漂洗，精濾，脫水后，將配料擂潰，得到魚糜；(2)取魚糜制成水發魚丸和油炸魚丸；配方I (水發魚丸)冷凍魚糜lkg、精鹽2%、味精I %、鳥苷酸+肌苷酸O. I %、玉米淀粉10 %、蔗糖4 %、山梨醇4 %、多磷酸鹽O. 3 %、蛋清5 %、黃酒2mL、清水適量。配方2 (油炸魚丸)冷凍魚糜lkg、精鹽2%、味精I %、鳥苷酸+肌苷酸O. I %、玉米淀粉10 %、蔗糖4%、山梨醇4%、多磷酸鹽O. 3 %、蛋清5 %、黃酒2mL、豬油脂3 %、蒜泥、姜汁適量、清水適量。將冷凍魚糜按配比與其他原料混合成型，分段加熱(40°C，20min ；75°C,3min)后冷卻。實施例3常用于魚糜制品中原料DNA的提取
大黃魚(Pseudosciaenacrocea)、黃姑魚(Nibea albiflora)、帶魚(Coiliaspp)、白鏈(Hypophthalmichthysmolitrix)> 草魚(Ctenopharyngodon idellus)、鋪魚(Aristichthysnobilis)(購自上海蘆潮港水產市場)，獲魚(Muraenesox cinereus)、雞肉(Gallus gallus domestica)、豬肉(Sus domesticus)、玉米(Zea mays L.)淀粉、小麥(Triticum aestivumLinn.)淀粉。其中魚類DNA提取采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，植物類DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒，禽畜類DNA提取采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按說明書提取所有樣品基因組DNA，以上試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。
并用同樣方法提取不同加工階段的黃姑魚產品的基因組DNA :黃姑魚原料、黃姑魚魚糜、加鹽黃姑魚魚糜、加工成型魚丸(水發魚丸配方)、經沸水蒸煮魚丸、經油炸的熟制魚丸、經咀嚼后采集魚丸碎片及魚丸嘔吐物(含胃液)。實施例4所提取原料基因組DNA的質量鑒定從NCBI中檢索到真核生物18SrDNA的部分序列，用Primer 5. O軟件設計引物Forward 5; -attacccatttccgacac-3'；Reverse :5' -tctcccgagatccaacta-3'；目的片段約230bp，引物由上海生物工程公司合成。擴增在型號為TC_24/H(b)的PCR儀上進行。擴增條件為每次擴增采用25 μ L體系，反應混合液含有2 μ L模板DNA，
O.25 μ L Taq酶(lU/yL，購自 TAKARA公司)，2.5yL 10XPCR buffer,2y L MgCl2(25mmol/L)，2 μ L dNTP (2. 5mmol/L)，弓丨物各 O. 3 μ L (25mol/L)。反應條件為95°C預變性5min，35個循環(95°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸2min)，然后72°C延伸IOmin。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后在紫外光下凝膠成像。魚丸中常用物種黃姑魚、大黃魚、海鰻、帶魚、白鰱、草魚、鳙魚、肌肉、豬肉、玉米淀粉及小麥淀粉基因組DNA鑒定的電泳圖譜如圖I ;不同加工階段的黃姑魚產品的基因組DNA鑒定的電泳圖譜如圖2所示；魚丸中常用物種18Sr RNA PCR產物擴增結果電泳圖譜如圖3所示。從電泳圖譜可見，各原料基因組的DNA模板經上述方法擴增后，均產生約230bp的片段。說明提取的模板DNA質量均滿足PCR擴增的要求。實施例5黃姑魚特異性片段PCR擴增反應利用實施例I的黃姑魚物種特異性引物對實施例3得到的各原料基因組DNA序列進行擴增Forward :5' -aacctcacccttccttgtcct-3'；Reverse :5' -atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'；目的片段約193bp，擴增在型號為TC_24/H(b)的PCR儀上進行。擴增條件為每次擴增采用25 μ L體系，反應混合液含有2 μ L模板DNA，O. 25 μ L Taq酶(IU/ μ L，購自TAKARA公司)，2.5yL 10XPCR buffer,2y L MgCl2 (25mmol/L), 2 μ L dNTP (2· 5mmol/L)，引物各O. 3μ L(25mol/L)。反應條件為94°C預變性 4min，35 個循環(94°C, 30s ；56°C,45s ；72°C,lmin)，然后 72°C延伸 IOmin0PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后在紫外光下凝膠成像。結果如圖4所示，只有黃姑魚基因組的DNA序列在擴增后產生約193bp的特異性片段。PCR產物經測序，長度為193bp，序列為aacctcacccttccttgtccttccgcctatataccgccgtcgtcagcttaccttgtgaaagactaatagtaagcgaaattggtacagccctaaacgccaggtcgaggtgtagcgtatggaaggggaagaaatgggctacattctctaatatagagaac acggatgacgtgttgaaacacgcctgaaggaggat ;艮P SEQ ID No. 3。
實施例6黃姑魚物種特異性PCR擴增的靈敏度分析用上述實施例5的方法檢測(I)黃姑魚魚糜與大黃魚魚糜以不同比例混合
黃姑魚魚糜與大黃魚魚糜比例分別以黃姑魚魚糜重量比例(m/m)為0%、0. 5%、1%,3%,5%,10%,100%充分混合，隨機采樣，用實施例3方法進行DNA提取，并用實施例5的方法進行PCR擴增。電泳圖譜如圖5所示。從電泳結果可見，用該特異性引物及特異性PCR擴增方法，在含有黃姑魚成分的魚糜中可檢測出193bp的特異性片段，而在大黃魚魚糜中不出現該特異性片段，而且隨著黃姑魚含量的增長，擴增條帶也逐漸變亮。(2)黃姑魚從原料至食用各階段采樣在制作黃姑魚魚丸以及食用階段，實驗選取了黃姑魚原料、黃姑魚魚糜、加鹽黃姑魚魚糜、加工成型魚丸(水發魚丸配方)、經沸水蒸煮魚丸、經油炸的熟制魚丸、經咀嚼后采集魚丸碎片及魚丸嘔吐物(含胃液)八個階段的樣品進行DNA提取及PCR擴增。電泳圖譜如圖6所示，證明本發明的黃姑魚特異性引物，可對從原料到各食用階段的樣品進行檢測和追溯。PCR產物測序，目的片段長度193bp，序列為SEQ ID No. 3。
權利要求
1.一種黃姑魚物種特異性標記引物，其特征在于，DNA序列如SEQ ID No. I和SEQ IDNo2所示； 上游引物序列為5' -aacctcacccttccttgtcct-31 ； 下游引物序列為5' -atcctccttcaggcgtgtttcaa-3'。
2.黃姑魚成分的分子溯源方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取樣品，提取基因組DNA，得到模板DNA; (2)采用權利要求I所述黃姑魚物種特異性標記引物，PCR擴增模板DNA，擴增產物為193bp DNA片段的，鑒定結果為樣品中含有黃姑魚成分。
3.權利要求2所述黃姑魚成分的分子溯源方法，其特征在于，步驟(2)中所述的PCR擴增條件為 93 95°C預變性3. 5 5min ；32 36個循環91 95°C變性28 32s，55 57°C退火42 50s，70 73°C延伸56 65s ;然后再70 73°C延伸9 12min。
4.權利要求2所述黃姑魚成分的分子溯源方法，其特征在于，步驟(2)中所述的PCR擴增條件為 94°C預變性4min ;35個循環94°C變性30s，56°C退火45s，72°C延伸Imin ;然后再72°C延伸IOmin0
5.權利要求2所述黃姑魚成分的分子溯源方法，其特征在于，用凝膠電泳檢測步驟(2)所得的PCR擴增產物。
全文摘要
本發明涉及分子生物學和食品安全領域，公開了一種黃姑魚物種特異性標記引物和黃姑魚成分的快速溯源方法，以便在食品安全事件中及時采取措施，最大限度地降低風險和經濟損失。引物序列為5′-aacctcacccttc cttgtcct-3′；和5′-atcctccttcaggcgtgtttcaa-3′。檢測方法為提取基因組DNA，特異PCR擴增產物的獲得，產物為193bp DNA片段的，鑒定結果為樣品中含有黃姑魚成分。此對引物對黃姑魚DNA鑒定具有很高的特異性和靈敏度；本方法能對黃姑魚從原料到制品，甚至是消費者消化器官中采集樣品的DNA進行快速檢測，可用作水產品中黃姑魚成分的鑒定及分子溯源。
文檔編號C12N15/11GK102618636SQ201210054388
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者汪之和, 潘迎捷, 王錫昌, 趙勇, 趙文秀 申請人:上海海洋大學