專利名稱：一種利用issr分子標記技術鑒定狼尾草屬牧草的方法
技術領域：
本發明屬于牧草種質資源鑒定領域，具體涉及一種利用分子標記技術鑒定牧草的方法。
背景技術：
狼尾草屬(Pennisetum Rich.)牧草為一年生或多年生禾本科牧草,是優質的牧草資源。其中象草(P. purpureum)具有高產、營養價值豐富并喜高溫多雨等特點,美洲狼尾草 (P. americanum)品質優,適口性好,美洲狼尾草(父本)與象草(母本)的種間三倍體雜種雜交狼尾草兼具父本與母本的優點，并有適應性強、供草期長的特點，作為草食動物優良的青飼料，在養殖生產中發揮著重要的作用。隨著研究的深入，優質狼尾草的引種和選育就顯得越來越重要，然而由于狼尾草屬種內種間反復雜交，導致遺傳分化越來越多樣，新老品種繁多，品種間的形態學差異越來越小，且不同地域經常交換，造成同名異物或同物異名現象，單靠傳統的形態學鑒定方法已經很難區分如此眾多的品種，隨著分子生物學技術的迅猛發展，從DNA分子的角度準確可靠地對品種進行基因鑒定成為可能，現階段已被廣泛應用。DNA分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA 水平遺傳多態性的直接反映。與其他幾種遺傳標記一形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，分子標記具有較多的優越性在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；不受外界環境影響；大多數分子標記為共顯性，有利于選擇隱性性狀；分子標記揭示來自DNA的變異；檢測手段簡單、迅速?，F在DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用于物種品種鑒定、未緣關系鑒別、遺傳育種、基因定位、基因克隆等方面。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats,簡單序列重復)分子標記是 Zietkeiwitcz等于1994年發展起來的,屬于DNA分子標記技術的一種。其基本原理是利用生物基因組中廣泛存在的簡單重復序列SSR(Simple Sequence Repeat)設計引物,無需預先克隆和測序，在PCR反應中，對與引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行擴增。所擴增的Inter SSR區域的多個條帶通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨。與SSR標記相比，ISSR引物可在不同種間通用，不像SSR標記引物具有較強的種特異性；與RAPD標記相比，穩定性高，獲得的信息量大；與PFLP相比，具有檢測方便、快捷等優點。目前，ISSR分子標記技術被廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化及分子生態學研究中。由于ISSR分子標記快速、簡便、可靠、重復性好，并且ISSR-PCR擴增產物多態性高，因此可用于植物品種鑒定。ISSR-PCR可擴增出大量特異性DNA片段，這些特異性片段的組合可作為某一品種區別于其他品種的獨特標記，也有人稱之為“指紋”。通過檢測樣品是否具有特有的“指紋”，可以有效的進行品種鑒定。Charter利用ISSR分子標記區分鑒定了可可豆種質，魏臻武在苜?；蚪MISSR分析的基礎上，構建了苜蓿基因組DNA指紋圖譜， 作為苜蓿品種鑒定的依據。但至今國內外未見應用ISSR分子標記方法區分鑒定狼尾草屬牧草的報道。狼尾草屬牧草種子和幼苗形態相近，不易區分，應用ISSR分子標記方法鑒定狼尾草屬牧草，一方面可彌補傳統鑒定方法的不足，另一方面可促進引種、選育過程的規范化、標準化。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種利用ISSR分子標記技術鑒定狼尾草屬牧草的方法。
為了實現本發明目的，本發明的一種利用ISSR分子標記技術鑒定狼尾草屬牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835其核苷酸序列分別為
UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG ；
UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。
所述ISSR分子標記所用引物還可包括UBC817或UBC843，其核苷酸序列分別為
UBC817-CACACACACACACACAA ；
UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。
所述鑒定方法的具體步驟為
(I)提取狼尾草屬DNA，構建DNA池；
(2)利用ISSR-PCR反應擴增狼尾草屬DNA ；
(3)構建狼尾草屬DNA電泳模式圖；。
(4)鑒定狼尾草屬牧草。
步驟(I)所述狼尾草屬牧草的DNA池分別由每種材料的三個單株的DNA等量混
合稀釋而成，DNA終濃度為10ng/yL。步驟(2)所述ISSR-PCR反應引物及核苷酸序列為 UBC815 ((CT) 8G)、UBC835 ((AG) 8YC)。步驟(2)所述ISSR-PCR反應體系及程序25 μ L體系Taq酶2U、10 X Taq Buffer 2. 5 μ L、25mM/L 的 Mg2+L 5 μ L、2. 5mM/L 的 4 種 dNTP 混合物 I. 2 μ L、IOng/ μ I 的引物 I. 5 μ L、IOng/ μ I DNA 模板 I. 5 μ L、ddH20 補足 25 μ L ；;擴增程序94°C預變性 3min, 94°C 變性45s, 50 60°C退火45s, 72°C延伸45s,循環38次，72°C再延伸IOmin0步驟(3)中用1%瓊脂糖凝膠，O. 5XTBE緩沖液為介質電泳檢測擴增結果，根據電泳圖繪制電泳模式圖。所述繪制電泳模式圖，以最終ISSR-PCR擴增產物多態性好、品種區分度高的電泳圖譜為基礎，選取條帶清晰的多態性位點繪制電泳模式圖，可直觀的區分狼尾草屬7種牧草。本發明還提供了上述方法在鑒定狼尾草屬牧草中的應用。所述狼尾草屬牧草優選為雜交狼尾草一號、雜交狼尾草二號、雜交狼尾草三號、象草、雜交狼尾草、紫光狼尾草、闊葉狼尾草。本發明有效解決了狼尾草屬牧草在引種、選育、生產中單靠形態無法進行品種區分的困難。ISSR分子標記快速、簡便、可靠、穩定性高、DNA需要量少，可減輕傳統品種區分所帶來的工作量。本發明大大改善了品種在生產推廣過程中，以劣充優，魚龍混雜，以假亂真的問題。建立起的ISSR-PCR產物電泳模式圖可直觀的顯示種(品種)之間基因的差異性，保證生產科研中種(品種)真實性、一致性，快速有效的鑒定其身份，也可為新品種的登記提供有力的證據，可確保其在生產上的大力推廣。


圖I引物UBC815擴增結果；圖2引物UBC835擴增結果；圖3引物UBC815擴增電泳模式圖；圖4引物UBC835擴增電泳模式圖；圖5引物UBC817擴增結果；圖6引物UBC843擴增結果；圖7引物UBC817擴增電泳模式圖；圖8引物UBC843擴增電泳模式圖。其中，I代表雜交狼尾草一號，2代表雜交狼尾草二號,3代表雜交狼尾草三號,4代表象草，5代表雜交狼尾草，6代表紫光狼尾草，7代表闊葉狼尾草。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I篩選狼尾草屬的ISSR分子標記(I)以搜集到的狼尾草屬主要的2個種及其雜交種的7份材料為對象，分別為雜交狼尾草一號、雜交狼尾草二號、雜交狼尾草三號、象草、雜交狼尾草、紫光狼尾草、闊葉狼尾草；(2)幼苗培養選取各品種均勻一致的種子各100粒，溫室條件下，培養20d，形成的正常幼苗作為試驗材料；(3)采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根試劑公司)進行單株幼苗的總 DNA提取，每種材料隨機選取三單株，采用O. 8%瓊脂凝膠電泳檢測并用核酸蛋白分析儀測定DNA樣品的濃度見表1，制備每種材料的DNA池，使DNA終濃度為IOng/ μ L ；表I樣品DNA濃度測定結果
權利要求
1.一種利用ISSR分子標記技術鑒定狼尾草屬牧草的方法，其特征在于，ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835，其核苷酸序列分別為UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG ；UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述ISSR分子標記所用引物還可包括 UBC817或UBC843，其核苷酸序列分別為UBC817-CACACACACACACACAA ；UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)提取狼尾草屬DNA，構建DNA池；(2)利用ISSR-PCR反應擴增狼尾草屬DNA；(3)構建狼尾草屬DNA電泳模式圖；(4)鑒定狼尾草屬牧草。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述狼尾草屬牧草的DNA池分別由每種材料的三個單株的DNA等量混合稀釋而成，DNA終濃度為IOng/ μ L。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述ISSR-PCR反應所用引物為 UBC815 和 UBC835。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述ISSR-PCR反應體系及程序為 25 μ L 體系Taq 酶 2U、10XTaq Buffer 2· 5 μ L、25mM/L 的 Mg2+L 5 μ L、2. 5mM/L 的 4 種 dNTP 混合物 I. 2 μ L、IOng/ μ I 的引物 I. 5 μ L、IOng/ μ I 的 DNA 模板 I. 5 μ L、ddH20 補足 25 μ L ； 擴增程序94°C預變性3min，94°C變性45s，50 60°C退火45s，72。。延伸45s，循環38次， 72°C再延伸 IOmin0
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中用1%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE緩沖液為介質電泳檢測擴增結果，根據電泳圖繪制電泳模式圖。
8.如權利要求I 7任意一項所述的方法在鑒定狼尾草屬牧草中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述狼尾草屬牧草為雜交狼尾草一號、雜交狼尾草二號、雜交狼尾草三號、象草、雜交狼尾草、紫光狼尾草、闊葉狼尾草。
全文摘要
本發明屬于牧草種質資源鑒定領域，具體涉及一種利用ISSR分子標記技術鑒定狼尾草屬牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835，其核苷酸序列分別為UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG；UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。本發明填補了應用ISSR分子標記方法區分狼尾草屬牧草種(品種)的空白，本發明最終繪制的區分試驗所用7份狼尾草屬牧草材料的電泳模式圖，可作為區分鑒定這7份材料的依據。本發明擺脫了傳統形態學鑒定的不可靠因素，快速、準確的區分7份狼尾草屬牧草材料，作為種、品種、品系審定的可靠依據，確保種質在生產上的大力推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586449SQ20121005748
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者于曉丹, 劉斯佳, 張蘊薇, 李洪超, 楊富裕, 毛培勝, 王樂 申請人:中國農業大學