專利名稱：一種檢測高度近視的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測高度近視的試劑盒，具體地說檢測與高度近視疾病相關ZNF644基因變異的試劑盒。
背景技術：
高度近視(high myopia,HM)又稱為病理性近視、惡性近視，是指屈光度在-6. OOD以上的近視，有眼軸延長、眼后極部的變形改變，鞏膜變薄、脈絡膜萎縮變薄等病理性改變，并伴有弱視、青光眼、白內障、玻璃體混濁、視網膜脫離等多種并發癥。高度近視是ー種致盲性眼病，其病因、發病機制非常復雜。高度近視有家族性并有明顯的遺傳傾向，且患病率高，有種族差異。在我國，高度近視是常染色體隱性遺傳，表現為 兒童學齡(前)期出現近視，近視度數進行性増加，眼底視網膜脈絡膜病變逐年加重。到目前為止，對高度近視的治療方法很有限且效果不顯著。光學矯正如戴眼鏡或接觸鏡矯正近視眼的屈光缺陷，雖然有助于暫時恢復正常或接近正常的視力，卻不能有效地控制近視進展；針對部分高度近視伴有黃斑病變所采用的玻璃體手術與激光治療，以及通過手術控制眼軸延長延緩眼底病變出現的時間并減輕其病變程度，是臨床上最常采用的干預方法，這些治療手段能使術后視力提高或保持穩定，屈光度穩定或減少，眼軸增長趨于緩慢，對功能性改變有輕度改善作用，但這些治療并不能對所有患者有效，且手術存在一定的風險性，手術并發癥主要有術后視網膜脫離和渦靜脈、睫狀動脈損傷，其遠期效果也還尚待考證。另外有報道通過藥物控制眼軸增長和高度近視的病理改變，但仍處于實驗階段，還有待進一步研究。因此，早期診斷發現，及早干預，延緩病程，減少病人的視カ喪失是非常重要的。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了ー種新的試劑盒。本發明提供了一種檢測高度近視的試劑盒，包括任選的用于檢測ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的ー個或者多個基因位點變異的試齊 。所述的1901位變異為A — G變異，2156位變異為A — G變異，2180位變異為C — G變異，2238位變異為G — A變異，4138位變異為C — G變異，4718位為G — A變異。上述試劑盒中的試劑為測序用試劑。該測序用試劑包括引物I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ；和/或引物2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和/或引物3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ；和/或引物4 TGAATTGGGAGTTTTGATGT和/或引物5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。上述試劑盒中的試劑為限制性內切酶酶切方法用試劑、限制性片段長度多態方法用試劑、SnaPshot用試劑、基因芯片用試劑。上述試劑盒還包括任選的用于擴增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的ー個或者多個基因位點的基因片段的試劑。該試劑為引物對A:上游弓I 物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT；和/或引物對B:上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；和/或引物對C :上游引物CCCCACAAGACTTGCATAGA下游引物CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。本發明上述試劑盒含有本發明特異性擴增目的片段的PCR引物對和特異性測定目的基因的堿基的引物，以及用于PCR擴增和進行測序的試劑盒的常規組件、試劑、緩沖液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。用本發明上述試劑盒檢測待檢樣品，確定ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位六個SNP位點的多態性，樣品沒有限制，如體液(血液、腹水和尿液)、組織細胞(如肝組織)等，通過提取和純化這些樣品均可制備基因組DNA。本發明還提供了一種檢測高度近視的試劑盒，包括任選的用于檢測ZNF644基因編碼的蛋白質的第587位變異、第672位變異、第680位變異、第699位變異中的一個或者多個氨基酸變異的試劑。所述的第587位變異是第587位I — V變異，第672位變異是672位S — G變異，第680位變異是672位R — G變異，第699位變異是699位C — Y變異。所述的試劑為檢測氨基酸序列用試劑。本發明又提供了 ZNF644基因在制備檢測高度近視的試劑中的用途。所述用途是指ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的ー個或者多個基因位點變異在制備檢測高度近視的試劑中的用途。所述的1901位變異為A —G變異，2156位變異為A — G變異，2180位變異為C — G變異，2238位變異為G — A變異，4138位變異為C — G變異，4718位為G — A變異。上述用途中所述的試劑為測序用試劑。該測序用試劑包括所述的測序用試劑包括引物I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ；和/或引物2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和/或引物3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ；和/或引物4 : TGAATTGGGAGTTTTGATGT ；和/或引物5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。
、
上述用途中所述的試劑為限制性內切酶酶切方法用試劑、限制性片段長度多態方法用試劑、SnaPshot用試劑、基因芯片用試劑。上述用途中的試劑還包括任選的用于擴增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個基因位點的基因片段的試劑。所述的試劑為弓丨物對A:上游弓I 物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG
下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT ；和/或引物對B: 上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA；和/或引物對C :上游引物C : CCCCACAAGACTTGCATAGA下游引物C : CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。本發明還提供了 ZNF644基因編碼的蛋白質在制備檢測高度近視的試劑中的用途。所述用途是指ZNF644基因編碼的蛋白質的第587位變異、第672位變異、第680位變異、第699位變異中的一個或者多個氨基酸變異在制備檢測高度近視的試劑中的用途。所述的第587位變異是第587位I — V變異，第672位變異是672位S — G變異，第680位變異是672位R — G變異，第699位變異是699位C — Y變異。所述的試劑為檢測氨基酸序列用試劑。待檢樣品組織可以是待檢者的肝組織、胎盤、視網膜或者視網膜色素上皮細胞。本發明公開了 ZNF644基因的上述多態性位點與高度近視的相關性，提供了ー種預測病理性近視易感性的方法，該方法可用于高度近視的早期篩查、輔助診斷，為易患者實施早期預防和治療提供依據，具有良好的市場應用前景。


圖I高度近視家系(951)的家系圖譜圖2高度近視家系(951)的家系(III :2)的臨床眼底照片圖3PCR產物直接測序檢測2156位A — G突變的序列圖譜圖4PCR產物直接測序檢測1901位A — G突變的序列圖譜圖5PCR產物直接測序檢測2180位C — G突變的序列圖譜圖6PCR產物直接測序檢測2238位G — A突變的序列圖譜圖7PCR產物直接測序檢測4138位C — G突變的序列圖譜圖8PCR產物直接測序檢測4718位G — A突變的序列圖譜圖9散發高度近視患者的臨床眼底照片圖10ZNF644基因在人體肝組織、胎盤、視網膜和視網膜色素上皮細胞中的表達情況。
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容作進ー步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例I樣本收集和基因組DNA的提取
家系及病例樣本均來自由四川省醫學科學院·四川省人民醫院人類疾病基因研究四川省重點實驗室承擔的國家自然科學基金(課題號30900809，81170883)、國家杰出青年基金(81025006)、973項目子課題(2011CB504604)以及四川省科技廳課題(2010SZ0138)收集的樣本。高度近視家系(951)成員共計30人(20人存活)，其中高度近視患者10人(6人存活)；散發高度近視患者300例，平均年齡33. 6± 12. 6歲，其中男性占46. 3%，正常對照600例(入選標準為40歲以上，長期從事近距離工作，屈光度> -I. 0D)，平均年齡55. 8±9. 2歲，其中男性占47. 8% (表I)。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這ー研究也得到了倫理委員會批準。表I散發高度近視病例和正常対照的基本臨床資料
臨床資料正常対照高度近視患者
人數600300
年齡55·8±9·233·6±12·6**
男性比例287(47.8%)139(46. 3% )
屈光度(D)-0·27±0·53-10. 36±4· 03**
眼軸(rnn)23·91±1·9827·95±2·02**注**，P<0.01。每人采集EDTA抗凝血樣5 10ml，酚-氯仿法提取基因組DNA，具體步驟為在抗凝劑EDTA存在下,將收集的5ml人外周血在3000rpm離心分離30分鐘除去血清；接著加入O. 2% NaCl溶液，使總體積為30ml ;輕輕振蕩溶液5_6次，并使其放置于冰上15分鐘；此后，在3000rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物；用O. 2%的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進行洗滌；在如此獲得的沉淀物中，加入IOmM Tris-HCl (pH8. O)和IOmM EDTA(4ml),以懸浮該沉淀物；將10% SDS,25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16 μ I和20 μ I,接著上下顛倒懸液輕輕混合；然后,在37°C過夜溫育懸液；過夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物；以3000rpm離心分離10分鐘除去水層；將水層與4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘，除去水層；最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC (pH5. 2)，兩倍量的冷無水こ醇，使DNA沉淀；用70%的こ醇洗滌以獲得基因組DNA。將所得的基因組DNA溶解于TE中，定量測定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液濃度校正至30ng/ μ 1，置_20°C冰箱保存。實施例2ZNF644基因2156位A — G突變位點的檢測一、檢測方法I、提取高度近視家系(951)存活成員的的血液基因組DNA2、ZNF644基因2156位A — G突變位點的檢測(I) PCR 擴增
以步驟I得到的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO. I 2所示引物對A(上游引物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ;下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT)為引物，采用天根公司的PCRmix試劑盒進行PCR擴增。體系2XPCRmix10 μ 1，上下游引物(5pm)各 I μ 1，模板 DNA (30ng/μ I) I μ 1，ddH20 7 μ I ο程序95°C變性5分鐘；95°C 30秒、52°C退火30秒、72°C延伸I分鐘，35個循環；72°C延伸7分鐘，12°C保溫。擴增產物是如SEQ ID NO. 3 4所示的序列(879bp)ACCAGGAGAGAAGACAGAAGttgatggaggaaattcgtgaattgaaagaacttcaggatgaaggaaga agtgcacgattacagtgtcctcagtgtgtgtttggtaccaattgccctaaaacatttgtgcaacatgctaaaacccatgaaaaagataaaaggtactactgctgtgaagagtgtaacttcatggcagtgacagaaaatgaattggaatgccatcgaggcattgcacatggggcagtggtaaaatgccctatggtcacttctgatattgcccagagaaaaacacaaaaaaagactttcatgaaagactctgtagtaggatcatccaaaaaatcagctacctacatatgtaagatgtgtccttttactacttcagccaaaagtgttttaaaaaagcacacggagtacttgcatteatcatcatgtgttgattcatttggtagtcctcttggacttgataaaagaaaaaatgacatccttgaagaacctgtagatagtgatagcactaaaacattaactaaacaacagtcaaccacatttccaaagaactctgctttaaaacaagatgtgaagcgaacatttggatcaacctcacaatca A/G gtagtttttcaaaaattcataagcggccacacagaatacagaaagctcggaaaagcattgcccaatcaggtgtaaacatgtgcaatcaaaacagctctcctcataagaatgttacaattaaaagcagcgttgaccaaaaacctaagtatttccatcaagcagcaaaagaaaagtctaatgccaaggcaaatagccactatttgtatagacacaaatatgaaaactataggatgatcaaaaaatcaggtgaatcATATCCTGTGCATTTCAAAA(2) PCR產物純化取步驟(I)的PCR產物5 μ 1，加入USB公司ExoSAP_IT(US PCR純化試劑)1μ I。程序37°C 20 分鐘，75 °C 15 分鐘，12 °C 保溫。(3)測序反應以步驟(2)的產物為模板，以SEQ ID NO. 5所示的序列(引物I)CCCTATGGTCACTTCTGATA為引物，采用ABI公司DNA片段測序試劑盒測序。反應體系純化好的PCR產物1μ l，5XBufferly 1，測序引物(2ρπι)0·5μ I(或5pm O. 2μ I)，seq-RPlOO O. 5 μ 1，ddH20 2 μ I (或 2· 3 μ I)。程序96で 15 秒，50で 10 秒，600C 4分鐘，30個循環；12°C保溫。(4)測序反應產物純化每個反應加入70%こ醇25 μ 1，避光靜置15分鐘，4000轉/分鐘離心30分鐘，吸棄上清液，沉淀靜置20分鐘晾干，加入9 μ I上機緩沖液溶解，上機測序。(5)上機測序分析采用ABI 3130XL測序儀進行測序分析。ニ、檢測結果2156位A — G突變的測序圖譜如圖3所示，根據測序圖和951家系成員基本情況繪制表2 表2951家系成員基本情況及ZNF644基因測序結果
權利要求
1.一種檢測高度近視的試劑盒，其特征在于包括任選的用于檢測ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個位點變異的試劑。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的1901位變異為A—G變異，2156位變異為A — G變異，2180位變異為C — G變異，2238位變異為G — A變異，4138位變異為C — G變異，4718位為G — A變異。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑為測序用試劑、限制性內切酶酶切方法用試劑、限制性片段長度多態方法用試劑、Snapshot用試劑或者基因芯片用試劑。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的測序用試劑包括引物 I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ； 和 / 或引物 2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和 / 或引物 3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和 / 或引物 4 TGAATTGGGAGTTTTGATGT ； 和 / 或引物 5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于還包括任選的用于擴增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個基因位點的基因片段的試劑。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的用于擴增的試劑包括 引物對A: 上游引物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG 下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和/或引物對B: 上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT 下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA ； 和/或引物對C : 上游引物CCCCACAAGACTTGCATAGA 下游引物CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。
7.一種檢測高度近視的試劑盒，其特征在于包括任選的用于檢測ZNF644基因編碼的蛋白質的第587位變異、第672位變異、第680位變異、第699位變異中的一個或者多個氨基酸變異的試劑。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的第587位變異是第587位I— V變異，第672位變異是672位S — G變異，第680位變異是680位R — G變異，第699位變異是699位C —Y變異。
9.ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個基因位點變異在制備檢測高度近視的試劑中的用途。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于所述的1901位變異為A— G變異，2156位變異為A — G變異，2180位變異為C — G變異，2238位變異為G — A變異，4138位變異為C — G變異，4718位為G — A變異。
11.根據權利要求10所述的用途，其特征在于所述的試劑為測序用試劑、限制性內切酶酶切方法用試劑、限制性片段長度多態方法用試劑、Snapshot用試劑或者基因芯片用試劑。
12.根據權利要求11所述的用途，其特征在于所述的測序用試劑包括 引物 I :ACCAGGAGAGAAGACAGAAG ；和 / 或引物 2 CCCTATGGTCACTTCTGATA ；和 / 或引物 3 TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和 / 或引物 4 TGAATTGGGAGTTTTGATGT 和 / 或引物 5 :CCCCACAAGACTTGCATAGA。
13.根據權利要求9所述的用途，其特征在于還包括任選的用于擴增包含ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個基因位點的基因片段的試劑。
14.根據權利要求13所述的用途，其特征在于所述的用于擴增的試劑包括 引物對A:上游弓 I 物ACCAGGAGAGAAGACAGAAG下游引物TTTTGAAATGCACAGGATAT ； 和/或引物對B: 上游引物TGAATTGGGAGTTTTGATGT 下游引物CCCATTTTCCTGCTTTAGTA ； 和/或引物對C : 上游引物CCCCACAAGACTTGCATAGA 下游引物CCTGTCCTGTAAGCATGTCA。
15.ZNF644基因編碼的蛋白質的第587位變異、第672位變異、第680位變異、第699位變異中的一個或者多個氨基酸變異在制備檢測高度近視的試劑中的用途。
16.根據權利要求15所述的用途，其特征在于所述的第587位變異是第587位I— V變異，第672位變異是672位S — G變異，第680位變異是680位R — G變異，第699位變異是699位C —Y變異。
全文摘要
本發明提供了一種檢測高度近視的試劑盒，包括任選的用于檢測ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個位點變異的試劑。還提供了ZNF644基因1901位，2156位，2180位，2238位，4138位，4718位中的一個或者多個位點變異在制備檢測高度近視的試劑中的用途。本發明提供的試劑盒可以預測待檢樣本對高度近視的易感性，可用于早期監控、檢測高度近視的高危人群，實施早期預防和治療，減少其視力損害。
文檔編號C12Q1/68GK102732607SQ201210057779
公開日2012年10月17日 申請日期2012年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者劉小琦, 尹燁, 楊旭, 楊正林, 石毅, 蔣濤, 金鑫, 魯芳 申請人:四川省醫學科學院(四川省人民醫院), 深圳華大基因科技有限公司