專利名稱：中國北方大腸癌患者hMSH2基因的新突變及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及中國北方Lynch syndrome大腸癌患者的hMSH2基因的一種新的突變類型。屬于分子檢測領域。
背景技術：
hMSH2基因是大腸癌患者的致病基因之一。自Fishel等人1993年在Lynchsyndrome大腸癌患者中發現了 hMSH2基因突變后，國內外很多文獻報道了 hMSH2基因在Lynch syndrome大腸癌中的突變位點。但hMSH2基因在中國北方Lynch syndrome大腸癌患者中的突變無人報道，尤其是在一例Lynch syndrome大腸癌患者中新發現的突變(在 c. 1127后插入7個堿基(AACAACA)并在c. 1129后缺失三個堿基(AAG))在國內外均未見報道。

發明內容
本發明在已報道hMSH2基因突變基礎上更豐富了 hMSH2基因在大腸癌患者中的突變譜。為大腸癌患者的分子診斷和治療提供了理論基礎。本發明的發明人在14例Lynch syndrome大腸癌患者中開展hMLHl基因外顯子l-19、hMSH2基因外顯子l-16、k-ras基因12和13密碼子、Braf基因11、15外顯子和PI3K基因9、20外顯子的突變篩檢，在I例Lynch syndrome大腸癌患者中發現了 hMSH2基因外顯子7的一種新的突變類型。而該病例未攜帶其它與Lynch syndrome大腸癌有關的基因突變。在現有研究的基礎上，本發明公開了一種分離的突變hMSH2基因或其片段，其特征在于突變hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號為NM_0002511所示的序列基礎上發生以下突變在c. 1127后插入7個堿基AACAACA并在c. 1129后缺失三個堿基AAG。(cDNA堿基位置的命名是從ATG開始)。所述的突變hMSH2基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。本發明還提供了一種用于擴增權利要求I或2所述的突變hMSH2基因或其片段的引物。優選的，所述的引物序列如下所示上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。進一步的，本發明還提供了一種用于檢測所述的突變hMSH2基因或其片段的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括以上所述的引物。優選的，所述的試劑盒中包括的引物序列如下所示上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。更進一步的，本發明提出了所述的引物在制備診斷或檢測中國北方大腸癌患者hMSH2基因試劑中的應用。及所述的試劑盒在制備診斷或檢測中國北方大腸癌患者hMSH2基因試劑中的應用。本發明的是通過以下技術方案實現的(I)采用經典的飽和酚氯仿的方法提取組織樣本DNA。(2)設計需要擴增的hMSH2基因外顯子7的引物。
(3)配制25 μ I PCR擴增體系，并進行PCR擴增。(4)瓊脂糖凝膠電泳配制I %瓊脂糖凝膠稱取Ig瓊脂糖粉，加入到I. O X TBE電泳液中。PCR產物在100V的條件下電泳30-40分鐘。電泳結束后于紫外燈下觀察結果。若在目的片段大小的位置出現條帶則PCR成功，可以進行下一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳。(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳①制備玻璃板架將兩塊玻璃板平放，玻璃板之間的三邊插入膠條，三周用夾子夾緊，斜放在架子上。②配制濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠用500ml量筒量取243. 8ml雙蒸水至IOOOml大燒杯中；用IOOml和500ml量筒分別稱取40ml 10XTBE、192ml 30%聚丙烯酰胺至已加入雙蒸水的大燒杯中，分別用移液管和移液器吸取4ml 10%過硫酸胺、200 μ ITEMED至大燒杯中，用玻璃棒充分攪拌混勻。③加樣將上述配好的混合液用玻璃棒引流至已經夾好的玻璃板之間，插入梳子。將制好的聚丙烯酰胺膠連帶玻璃板夾固定在電泳槽上，倒入約400mLl X TBE0將準備好的電泳槽連接到電泳儀上，300伏預電泳30分鐘。將變性buffer與PCR產物按照5 : I的比例至10 μ I體積混勻離心。98°C變性10分鐘，將變性后的PCR產物迅速冰浴。將PCR產物用微量加樣器加入上樣孔。④電泳將電泳槽放入4°C冰箱。300伏電泳5分鐘，150伏電泳過夜。⑤染色第二天停止電泳。取下玻璃板，棄掉電泳液，將兩玻璃板分離，將聚丙烯酰胺膠剝離出來。將剝離出來的凝膠放在盛有固定液的托盤里，放在搖床上固定10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。再將凝膠轉移至盛有染色液的托盤里，染色10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。然后將凝膠轉移至盛有顯色液的托盤里，直至條帶清晰可見。最后將凝膠裝入10#封口袋中，在凝膠成像系統的白光下照相，保存圖片并記錄結果。(7)將聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶出現異常者的PCR產物送至華大基因公司用ABI3730XL測序儀測序。測序結果序列和NCBI基因數據庫中提供的原始序列用Chromas2. 22 軟件(Technelysium Pty. Ltd.，QLD, Australia)進行比對分析。本發明的有益效果在于，本發明是首次在1/14例Lynch syndrome大腸癌患者中檢測到hMSH2基因外顯子7的移碼突變。該突變位點在國內外均未見報道。


圖I為一例Lynch syndrome大腸癌患者的外顯子7的SSCP結果圖；圖2為該病例外顯子7的測序結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例I(I)飽和酚氯仿法提取組織樣本DNA ①將Lynch syndrome大腸癌患者的術后切除的直腸癌組織組織樣本用液氮研磨，在研磨好的組織粉末中加入4ml TES緩沖液，10% SDS溶液250 μ l,20mg/ml蛋白酶K溶液50μ 1，充分混勻，使聚集的白細胞分散開；56°C恒溫水浴2小時。 ②加入等體積的飽和酚，反復緩慢地顛倒離心管，混合兩相成乳狀液。③5000rpm，4°C, 15 分鐘離心。④用大口徑吸管吸取粘稠的水相(上層)，移至另一潔凈離心管中。⑤重復步驟②，③，④。 ⑥加入等體積氯仿-異戊醇(體積比為24 I)溶液，反復緩慢地顛倒離心管，混合兩相成乳狀液。重復步驟③，④。⑦重復步驟⑥兩次，第二次的水相(上層)轉移至IOOml小燒杯中。⑧加入2. 5倍體積的在_20°C預冷的無水乙醇，邊加邊輕搖，有DNA纖維狀沉淀析出，置于冰上15 30分鐘；用吸頭(最好將口熔封)撈出DNA，移到裝有lml70%乙醇的
I.5ml離心管中，漂洗。⑨12000rpm，4°C, 10分鐘離心，小心移去乙醇液；再用70%乙醇漂洗一次，棄乙
醇，置室溫，使乙醇揮發。⑩用適量TE溶液(400-800ul)溶解DNA，4°C冰箱保存。(短期保存可用水溶解DNA)。(2)設計hMSH2基因各外顯子的引物，該突變位點在外顯子7中，其引物序列如下上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。(3)配制25 μ I PCR擴增體系如下HG buffer 12. 5 μ I, dNTP2 μ 1，上下游引物各
O.8 μ I, Supper Taq 酶 O. 5 μ I, DNAO. 8 μ I,雙蒸水 7· 6 μ I。(4)在型號為ΑΒΙ9700的PCR擴增儀上進行PCR擴增，擴增程序如下95°C 5分鐘，以以下程序擴增35個循環95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，72 °C延伸7分鐘，4°C保存。(5)瓊脂糖凝膠電泳配制I %瓊脂糖凝膠稱取Ig瓊脂糖粉，加入到I. O X TBE電泳液中。用10 μ I微量移液器吸取2μ I 6X loading buffer于0.5ml EP管中，再吸取4μ I PCR產物于O. 5mlEP管中，離心后加到瓊脂糖膠孔中，IOOV電泳30-40分鐘。電泳結束后于紫外燈下觀察結果。若在目的片段大小的位置出現條帶則PCR成功，可以進行下一步的聚丙烯酰胺凝膠電泳。(6)聚丙烯酰胺凝膠電泳①制備玻璃板架將兩塊玻璃板平放，玻璃板之間的三邊插入膠條，三周用夾子夾緊，斜放在架子上。
②配制濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳相關試劑40%聚丙烯酰胺取116g丙烯酰胺、4g雙丙烯酰胺、加超純水至1000ml，攪拌溶解。10 X T BE 緩沖液取 121. 15gTris Base,55. 65g硼酸，加 20ml 500mMEDTA (PH8. O)，加超純水至1L，混勻。10 %過硫酸胺取IOg過硫酸胺加超純水至IOOml，混勻。12%聚丙烯酰胺膠的配制用500ml量筒量取243. 8ml雙蒸水至IOOOml大燒杯中；用IOOml和500ml量筒分別稱取40ml 10XTBE、192ml 30%聚丙烯酰胺至已加入雙蒸水的大燒杯中，分別用移液管和移液器吸取4ml 10%過硫酸胺、200 μ ITEMED至大燒杯中，用玻璃棒充分攪拌混勻。③加樣將上述配好的混合液用玻璃棒引流至已經夾好的玻璃板之間，插入梳子。這期間要不斷觀察，出現漏液立即補充。一到兩個小時后，拔掉上方的梳子及下方的玻璃條，將玻璃板周圍的夾子去掉，電泳槽底部倒入約300mL I X TBE，把玻璃板夾在電泳槽上，將玻璃板底部的氣泡趕出，在電泳槽上端兩塊玻璃板之間倒入約400mLl X TBE。將準備好的電泳槽連接到電泳儀上，同時用IOml注射器沖洗梳子孔，將電泳槽放在4°C冰箱中，300伏預電泳30分鐘。準備樣品。在0.5ml離心管中加入變性buffer 6 μ 1，然后加入PCR產物
I.8μ 1，離心。當預電泳至30分鐘后，將離心好的樣品放入PCR儀中，98°C變性10分鐘。將變性后的PCR產物從PCR儀中迅速移至冰浴。將PCR產物用微量加樣器加入上樣孔。④電泳將電泳槽放入4°C冰箱。300伏電泳5分鐘，150伏電泳過夜。⑤染色第二天停止電泳。取下玻璃板，棄掉電泳液，將兩玻璃板分離，將聚丙烯酰胺膠剝離出來。配制固定液，染色液和顯色液，配方如下固定液無水乙醇100ml、冰乙酸4ml,加一蒸水至800ml,混勻。染色液硝酸銀I. 6g，加入甲醛4 μ 1，加一蒸水至800ml，混勻。顯色液氫氧化鈉128，加入甲醛4 4 I，加超純水至800ml，混勻。將剝離出來的凝膠放在盛有固定液的托盤里，放在搖床上固定10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。再將凝膠轉移至盛有染色液的托盤里，染色10分鐘，用一蒸水漂洗2次，每次5分鐘。然后將凝膠轉移至盛有顯色液的托盤里，直至條帶清晰可見。最后將凝膠裝入10#封口袋中，在凝膠成像系統的白光下照相，保存圖片并記錄結果。本發明的攜帶新突變的大腸癌病例外顯子7的SSCP結果圖，如圖I所示。(7)將聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶出現異常者的PCR產物送至華大基因公司用ABI3730XL測序儀測序。測序結果序列和NCBI基因數據庫中提供的原始序列用Chromas2. 22 軟件(Technelysium Pty. Ltd. ,QLD,Australia)進行比對分析。該病例外顯子7測序結果如圖2所示，突變hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號為NM_0002511所示的序列的c. 1127后插入7個堿基AACAACA并在c. 1129后缺失三個堿基AAG。
權利要求
1.一種分離的突變hMSH2基因或其片段，其特征在于突變hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登錄號為NM_0002511所示的序列基礎上發生以下突變在c. 1127后插入7個堿基AACAACA并在c. 1129后缺失三個堿基AAG。
2.如權利要求I所述的分離的突變hMSH2基因或其片段，其特征在于所述的突變hMSH2基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。
3.一種用于擴增權利要求I或2所述的突變hMSH2基因或其片段的引物。
4.如權利要求3所述的引物，其特征在于所述的引物序列如下所示上游 F :5’ -TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3’ ；下游 R :5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。
5.一種用于檢測權利要求I或2所述的突變hMSH2基因或其片段的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括權利要求3或4所述的引物。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中包括權利要求4所述的引物，所述的引物序列如下所示上游 F :5’ -TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3’ ；下游 R :5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。
7.權利要求3或4所述的引物在制備診斷或檢測中國北方大腸癌患者hMSH2基因試劑中的應用。
8.權利要求5或6所述的試劑盒在制備診斷或檢測中國北方大腸癌患者hMSH2基因試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了中國北方大腸癌患者hMSH2基因的新突變及其用途，它涉及中國北方Lynch syndrome大腸癌患者的hMSH2基因的一種新的突變類型。本發明在1/14例Lynch syndrome大腸癌患者中發現一種新的突變，即在GeneBank登錄號為NM_0002511所示的序列基礎上發生以下突變在c.1127后插入7個堿基AACAACA并在c.1129后缺失三個堿基AAG。本發明在已報道hMSH2基因突變基礎上更豐富了hMSH2基因在大腸癌患者中的突變譜。為大腸癌患者的分子診斷和治療提供了理論基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102634521SQ20121005768
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者朱琳, 梁靜, 王帆, 胡付蘭, 趙亞雙 申請人:哈爾濱醫科大學