專利名稱：一種利用固定化酵母細胞制備梔子藍色素的方法
技術領域：
本發明涉及一種天然色素的制備方法，具體地講，是指利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法。
背景技術：
目前，世界各國的天然色素開發品種已達百種，我國已批準使用的達40多種，但大多數屬紅、黃色，我國天然藍色素的產量也不高。桅子藍色素是以茜草科植物山桅的果實為原料，采用生物工程技術制得的一種安全無毒的食用天然色素，它耐熱、耐光、耐酸堿，PH 適用范圍廣，易溶解于水和低醇，可替代化學合成藍色素單獨使用，也可以與紅、黃類色素調配成綠、紫、棕等色調混合使用，在國外被廣泛應用于食品、制藥及化妝品等產品的著色。 我國于1999年在制定新增食品添加劑的使用衛生標準時將其列入，用于蛋白質、糖和淀粉等食品著色。目前國內對桅子藍色素的分離提純工藝研究較少。我國是世界上食品需求量最大的國家，作為食品添加劑等重要組成部分的天然食用色素的需求量與日俱增。同時，我國也是桅子產量最多的國家之一，以桅子為發酵工業原料，通過微生物的生物轉化生產天然藍色素，不僅能充分該利用資源，而且符合我國天然色素開發的趨勢和需要。現有技術中生產桅子藍的方法主要采用桅子苷、氨基酸和產β -葡萄糖苷酶的酵母菌，將產β -葡萄糖苷酶的酵母菌的酵母直接投入到桅子苷溶液和氨基酸溶液中，桅子苷經β-葡萄糖苷酶水解后生成的桅子甙元與谷氨酸反應生成桅子藍色素溶液，由于酵母中不僅存在β -葡萄糖苷酶，還存在其他物質，將其直接與桅子苷溶液和氨基酸溶液中，會引入雜質，而且酵母與產品難分離；另一方面酶離開了酵母細胞直接裸露在液體中，降低了酶的活性，因此，采用該方法得到的桅子藍的質量和純度均不理想。

發明內容
本發明克服了現有技術中的不足，提供一種能夠提高桅子藍的質量和純度的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法。本發明的技術方案如下
一種利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，包括如下步驟
a)將產葡萄糖苷酶的酵母菌株按總重量3%_7%接種于培養基上發酵得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液用海藻酸鈉溶液進行包埋，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到氯化鈣溶液中形成固定化酵母細胞；
b)將桅子苷溶液、氨基酸溶液以及固定化酵母細胞攪拌混合，得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液濃縮，濃縮液經噴霧干燥得到桅子藍粉末。作為改進，步驟a)中將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到1 -4mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為20— 37°C，固化時間為10-1 ； 將固定化小球置于0. 01-0. lmol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為l-5h。作為改進，b)步驟中加入醋酸緩沖液調節PH至3-6，反應溫度為40_50°C，攪拌速度為100-200r/min，攪拌時間為3_8h。作為改進，b)步驟中桅子苷溶液與氨基酸溶液等體積混合后，取混合液與固定化酵母細胞以質量比4:1的比例攪拌混合。作為改進，步驟a)中的培養基為YPDL液體培養基，發酵溫度為^°C、發酵時間為 72小時。作為改進，b)步驟中桅子苷溶液的質量濃度為5%-10%、氨基酸溶液的質量濃度為 3%-7% 。作為改進，步驟b)中桅子苷溶液所采用的桅子苷的制備方法如下
a)取桅子粉末，加入其質量10-50倍的水溶解，制備成桅子溶液；
b)將桅子溶液過濾后，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中， 用體積濃度為20—30%的乙醇洗脫，將洗脫液濃縮、冷凍干燥后得到桅子苷制品。作為改進，上述海藻酸鈉溶液的質量濃度為2%_6%。 作為改進，步驟c)中的乙醇溶液的體積濃度為50%-70%。作為改進，上述氨基酸選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酸鈉、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、 谷氨酸鈉中的一種。本發明采用的固定化酵母細胞方法，將產β -葡萄糖苷酶的酵母菌株不經處理直接固定化，將固化后的產葡萄糖苷酶的酵母菌株加入溶液中，使用完后直接將固化后的產β -葡萄糖苷酶的酵母菌株過濾，克服了傳統的以流離酵母發酵導致的酵母與產品難分離，易流失等問題，保持了酶在細胞內的原始狀況，增加了酶的穩定性，且具有生長周期短、抗污染能力強等優勢，節約了成本，提高了桅子藍的質量和純度。
具體實施例方式本發明所用的培養基的配置方法如下
YPDL液體培養基取葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母浸粉lg，加蒸餾水至IOOml后于121°C 滅菌20min制得。YEPD固體培養基取葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母浸粉lg，瓊脂2g，加蒸餾水至 IOOml后于121°C滅菌20min制得。本發明所述的“產葡萄糖苷酶的酵母菌株”是利用市售的釀酒酵母發酵培養篩選出的，篩選方法如下
a)取市售釀酒酵母2g，溶解于IOmL蒸餾水中，用接種環于YEPD固體培養基上劃板， 于37 °C恒溫培養過夜；
b)取單菌落接種于5mLYPDL培養基上于^°C、180r/min搖床中培養72小時得到發酵
液；
c)取步驟b)中的發酵液ImL置于4°C低溫保存，再向剩余發酵液中加入7%桅子苷溶液和5%氨基酸溶液各4mL，用醋酸緩沖溶液調節溶液pH為5，置于45°C的恒溫鍋中反應2h， 若溶液變藍說明此酵母單菌落可以產β-葡萄糖苷酶；
d)若酵母單菌落可以產β-葡萄糖苷酶，則取步驟c)中于4°C低溫保存的ImL發酵液用接種環于YEPD固體培養基上劃板，于37°C恒溫培養過夜得到產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株；
本發明所述的“產葡萄糖苷酶的酵母菌株”指的是步驟d)中得到的產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株。實施例1
a)將3mL產β-葡萄糖苷酶酵母菌株接種于裝有IOOmLYPDL液體培養基的三角瓶中， 于^°C、180r/min搖床中發酵培養72小時得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液加入到21 海藻酸鈉溶液中充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到lmol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為20°C，固化時間為IOh ；將固定化小球置于0. 01mol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為Ih ；將制備的固定化酵母細胞置于4°C下保存備用；
b)稱取IOOg桅子粉末溶于IL蒸餾水中，過濾，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中，用體積濃度為20%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到桅子苷粉末；配制質量濃度5%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液2L和3%精氨酸溶液2L混合后， 取混合液4 Kg,混合液中加入固定化酵母細胞lKg，用醋酸緩沖液調節溶液pH為3. 2后，置于40°C的恒溫鍋中以lOOr/min的攪拌速率反應lh，得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用蒸餾水洗至滴出液為無色液體后再用體積濃度為50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，噴霧干燥得到桅子藍粉末。色價為108，純度為90%。實施例2
a)將5mL產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接種于裝有IOOmLYPDL液體培養基的三角瓶中，于、180r/min搖床中發酵培養72小時得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液加入到 4%海藻酸鈉溶液中充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到3mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為30°C，固化時間為15h ；將固定化小球置于0. 05mol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為池；將制備的固定化酵母細胞置于4°C下保存備用；
b)稱取200g桅子粉末溶于5L蒸餾水中，過濾，將濾液中加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中，用體積濃度為40%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到桅子苷粉末；配制質量濃度7%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液3L和3%甘氨酸溶液3L混合后， 取混合液6 Kg，往混合液中加入固定化酵母細胞1. ^(g，用醋酸緩沖液調節溶液pH為4. 5 后，置于15°C的恒溫鍋中以180r/min的攪拌速率反應池；得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用蒸餾水洗至滴出液為無色液體后再用體積濃度為60%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，噴霧干燥得到桅子藍粉末。色價為112，純度為89%。實施例3
a)將7mL產β -葡萄糖苷酶酵母菌株接種于裝有IOOmLYPDL液體培養基的三角瓶中， 于^°C、180r/min搖床中發酵培養72小時得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液加入到6% 海藻酸鈉溶液中充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到4mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為37°C，固化時間為18h ；將固定化小球置于0. lmol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為證；將制備的固定化酵母細胞置于4°C下保存備用；
b)稱取200g桅子粉末溶于IOL蒸餾水中，過濾，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中，用體積濃度為30%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到桅子苷粉末；配制質量濃度10%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液4L和3%谷氨酸鈉溶液4L混合， 取混合液8 Kg,往混合液中加入固定化酵母細胞^ig,用醋酸緩沖液調節溶液pH為3后，置于50°C的恒溫鍋中以200r/min的攪拌速率反應證；得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用蒸餾水洗至滴出液為無色液體后再用體積濃度為70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮， 噴霧干燥得到桅子藍粉末。色價為123，純度為92%。實施例4
a)將7mL產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接種于裝有IOOmLYPDL液體培養基的三角瓶中，于、180r/min搖床中發酵培養72小時得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液加入到 7%海藻酸鈉溶液中充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到2mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為35°C，固化時間為15h ；將固定化小球置于0. 08mol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為池；將制備的固定化酵母細胞置于4°C下保存備用；
b)稱取200g桅子粉末溶于IOL蒸餾水中，過濾，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中，用體積濃度為25%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到桅子苷粉末；配制質量濃度7%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液4L和5%苯丙氨酸溶液4L混合， 取混合液8Kg，往混合液中加入固定化酵母細胞^ig,用醋酸緩沖液調節溶液pH為5后，置于45°C的恒溫鍋中以150r/min的攪拌速率反應池；得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用蒸餾水洗至滴出液為無色液體后再用體積濃度為55%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，噴霧干燥得到桅子藍粉末。色價為107，純度為87%。實施例5
a)將5mL產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接種于裝有IOOmLYPDL液體培養基的三角瓶中，于、180r/min搖床中發酵培養72小時得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液加入到 5%海藻酸鈉溶液中充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到2mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為25°C，固化時間為他；將固定化小球置于0. 02mol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為證；將制備的固定化酵母細胞置于4°C下保存備用；
b)稱取200g桅子粉末溶于5L蒸餾水中，過濾，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中，用體積濃度為25%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到桅子苷粉末；配制質量濃度8%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液3L和5%蘇氨酸溶液3L混合，取混合液6Kg，往混合液中加入固定化酵母細胞1. ^(g，用醋酸緩沖液調節溶液pH為4后，置于 20°C的恒溫鍋中以150r/min的攪拌速率反應4h ；得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用蒸餾水洗至滴出液為無色液體后再用體積濃度為55%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，噴霧干燥得到桅子藍粉末。色價為109，純度為88%。
實施例6
a)將3mL產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接種于裝有IOOmLYPDL液體培養基的三角瓶中，于、180r/min搖床中發酵培養72小時得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液加入到 2%海藻酸鈉溶液中充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到2mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l_2mm的固定化小球，固化溫度為35°C，固化時間為12h ；將固定化小球置于0. 03mol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為4h ；將制備的固定化酵母細胞置于4°C下保存備用；
b)稱取IOOg桅子粉末溶于IL蒸餾水中，過濾，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中，用體積濃度為35%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到桅子苷粉末；配制質量濃度6%的桅子苷溶液，取桅子苷溶液2L和5%亮氨酸液2L混合，取混合液4 Kg,往混合液中加入固定化酵母細胞lKg，用醋酸緩沖液調節溶液pH為6后，置于 30°C的恒溫鍋中以120r/min的攪拌速率反應池；得到桅子藍溶液；
c)將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用蒸餾水洗至滴出液為無色液體后再用體積濃度為40%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，噴霧干燥得到桅子藍粉末。色價為106，純度為85%。
權利要求
1.一種利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于包括如下步驟a)將產葡萄糖苷酶的酵母菌株按總重量3%_7%接種于培養基上發酵得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液用海藻酸鈉溶液進行包埋，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到氯化鈣溶液中形成固定化酵母細胞；b)將桅子苷溶液、氨基酸溶液以及固定化酵母細胞攪拌混合，得到桅子藍溶液；將桅子藍溶液加入到由大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液濃縮，濃縮液經噴霧干燥得到桅子藍粉末。
2.根據權利要求1所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于步驟a)中將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到1 -4mol/L氯化鈣溶液中固化，形成直徑為l-2mm的固定化小球，固化溫度為20— 37°C，固化時間為10-1 ；將固定化小球置于 0. 01-0. lmol/L的氯化鈣溶液中硬化形成固定化酵母細胞，硬化時間為IH
3.根據權利要求1所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于b) 步驟中加入醋酸緩沖液調節PH至3-6，反應溫度為40-50°C，攪拌速度為100-200r/min，攪拌時間為3-他。
4.根據權利要求1或2或3所述所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法， 其特征在于b)步驟中桅子苷溶液與氨基酸溶液等體積混合后，取混合液與固定化酵母細胞以質量比4:1的比例攪拌混合。
5.根據權利要求4所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于步驟a)中的培養基為YPDL液體培養基，發酵溫度為^°C、發酵時間為72小時。
6.根據權利要求5所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于b) 步驟中桅子苷溶液的質量濃度為5%-10%、氨基酸溶液的質量濃度為3%-7%。
7.根據權利要求1所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于步驟b)中桅子苷溶液所采用的桅子苷的制備方法如下a)取桅子粉末，加入其質量10-50倍的水溶解，制備成桅子溶液；b)將桅子溶液過濾后，將濾液加入到由聚苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂組成的柱中， 用體積濃度為20—30%的乙醇洗脫，將洗脫液濃縮、冷凍干燥后得到桅子苷制品。
8.根據權利要求1所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于所述海藻酸鈉溶液的質量濃度為2%-6%。
9.根據權利要求1所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于步驟c)中的乙醇溶液的體積濃度為50%-70%。
10.根據權利要求1或5所述的利用固定化酵母細胞制備桅子藍色素的方法，其特征在于所述氨基酸選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酸鈉、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、谷氨酸鈉中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用固定化酵母細胞制備梔子藍色素的方法，包括如下步驟a)將產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株接種于培養基上發酵得到菌液，菌液經離心后，取下層菌液用海藻酸鈉溶液進行包埋，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，將海藻酸鈉-酵母菌懸液逐滴滴入到氯化鈣溶液中形成固定化酵母細胞；b)將梔子苷溶液、氨基酸溶液、固定化酵母細胞攪拌混合，得到梔子藍溶液；c)將梔子藍溶液加入到大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂組成的柱中，用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液濃縮，濃縮液經噴霧干燥得到梔子藍粉末。本發明將酵母菌發酵液不經處理直接固定化，克服了傳統的以流離酵母發酵導致的酵母與產品難分離，易流失等問題，提高了梔子藍的純度。
文檔編號C12N11/10GK102559796SQ201210057789
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者卜素, 盧錦峰, 季紅峰, 居榮華, 李忠, 馬飛飛 申請人:南京林業大學