專利名稱：一種編碼堿性β-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種編碼堿性β -葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶(beta-glucosidase, EC3. 2. I. 21)又稱 β -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，廣泛存在于微生物到脊椎動(dòng)物的各種生物中。它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，如水楊苷(salicin)、纖維ニ糖(cellobiose)、纖維三糖(cellotriose)、纖維四糖(cellotetrose)和對(duì)硝基苯_β _D_葡萄糖苷(pNPG)等，在食品風(fēng)味物質(zhì)的釋放和纖維素降解中具有重要作用(SesteloA. B. F，Poza M.，VillaΤ·し· β-blucosidase activity in a Lactobaciilusplantarum wine strain. World Journal of Microbiology&Biotechnology,2004, 20 :633 637)。能源短缺是本世紀(jì)面臨的重大問題之一。纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是地球上含量最豐富的碳水化合物，也是數(shù)量最大的ー種可再生資源。對(duì)于纖維素的利用，是解決能源危機(jī)、糧食短缺和環(huán)境污染的重要途徑。β -葡萄糖苷酶是纖維素酶復(fù)合酶系發(fā)揮協(xié)同作的關(guān)鍵酶，對(duì)纖維素酶系的整體水解活性有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，可以通過提高纖維素酶系中β_葡萄糖苷酶的活性來改善整個(gè)纖維素酶系的功用(Bhat Κ.Μ.，Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications.Biotechnol Adv，1997，15 :583 620)。因此，對(duì)β -葡萄糖苷酶進(jìn)行深入研究是十分必要的，也越來越引起人們的關(guān)注。目前，已有上百個(gè)微生物葡萄糖苷酶基因得到克隆，許多微生物來源的葡萄糖苷酶基因已獲得異源表達(dá)(韓笑、陳介南、王義強(qiáng)、何鋼、劉海波、譚力，葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展。生物技木通報(bào)，2008，3:8 13)。目前，研究得較多的是酵母(yeast)和木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)等霉菌(Dan S.，Marton丄·，Dekel M. , Bravdo BA. ,He S. , Withers b. G. , Shoseyov 0. Cloning, expression,characterization, and nucleophile identmcation 01 family 3, Aspergillus nigerbeta-glucosidase. J. Biol. Chem.，2000，275 :4973 4980)。但是，由于木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素，另是纖維素酶活力較低，尤其是β_葡萄糖苷酶活力很低，致使纖維ニ糖在反應(yīng)體系中積累而影響酶解效率，因而其應(yīng)用范圍受到限制。大部分葡萄糖苷酶的最適pH都在3. 5 5. 5酸性范圍，也有少數(shù)的β -葡萄糖苷酶其pH在堿性范圍。葡萄糖苷酶除了在降解纖維素方面有著重要作用外，在其他領(lǐng)域應(yīng)用也越來越廣泛，尤其是在醫(yī)藥、食品、生物轉(zhuǎn)化中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[Michael E. H. ,Mark F. R.，Charles E. ,Cellulase for commodity products from cellulosic biomass. Curr. 0pm.Biotechnol. , 1999,10(4) :358 364]。在水果、蔬菜、茶葉等食料和中草藥中，許多風(fēng)味前體物質(zhì)和藥理活性成分主要以糖苷形式存在，需要β-葡萄糖苷酶這種風(fēng)味酶將其轉(zhuǎn)化為苷元或其他形式的高生理活性物質(zhì)發(fā)揮作用(金鳳燮，莊子瑜，魚紅閃，等.特異的中草藥配糖體苷酶微生物及其發(fā)酵與酶學(xué)特性.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25 (12) :1863 1870)。同吋，β -葡萄糖苷酶還具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移活性(孟憲文、宋小紅、陳歷俊等，葡萄糖苷酶的研究進(jìn)展。中國(guó)乳業(yè)，2009，10 :42 44)，可用于低聚龍膽糖的生產(chǎn)(劉玲玲、朱松、朱婷等，重組β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)龍膽低聚糖的エ藝條件優(yōu)化。微生物學(xué)報(bào)，2009，49 (5) :597 602)和紅景天苷等糖苷類活性物質(zhì)的酶法合成(劉磷、梅樂和、柳行等，酶催化制備P-羥基苯こ基β-D-葡萄糖苷過程強(qiáng)化。高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2009，23 (I) :87 91 ;王夢(mèng)亮、李萬麗，固定化β -葡萄糖苷酶催化合成紅景天甙的研究。生物技術(shù)，2009，19 (I) 68 70)。本發(fā)明人以葡萄糖苷酶為關(guān)鍵詞查找國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共檢出294項(xiàng)發(fā)明專利。其中有19項(xiàng)發(fā)明專利是描述編碼β-葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用，而其他275項(xiàng)是與葡萄糖苷酶在各種領(lǐng)域上的應(yīng)用有夫。在這19項(xiàng)與編碼β-葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用相關(guān)的發(fā)明專利中只有一項(xiàng)是描述堿性β_葡萄糖苷酶，專利申請(qǐng)人南開大學(xué)；、專利號(hào)ZL200510116748.9 ;發(fā)明名稱ー種嗜熱堿性β _葡萄糖苷酶及其編碼基因。該發(fā)明涉及ー種葡萄糖苷酶及其編碼基因。該酶具有在高溫、堿性條件下保持較高酶活性的特點(diǎn)，其最適反應(yīng)溫度約為70°C，最適反應(yīng)pH值約為8. 0，該酶能催化水解β -葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，在食品、醫(yī)藥、紡織、能源等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這個(gè)堿性β_葡萄糖苷酶是從嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2 (CGMCC No. 1228)克隆到的，從專利的說明書附圖的圖3中可以看出該堿性β -葡萄糖苷酶在ρΗΙΟ. O時(shí)的酶活性只有最高時(shí)的25%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供了ー種編碼堿性葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用，這個(gè)堿性β -葡萄糖苷酶在PH值10時(shí)，其酶活性仍保留有較高的酶活性。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種堿性β -葡萄糖苷酶基因，其序列的保守區(qū)外源DNA是由2277個(gè)堿基組成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF), Pbgl基因的起始密碼為ATG，終止密碼子為TAG，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。SEQ ID NO. I為Iatg agaaacc atacttcaga cacgatcaat aagacagtag aaaccgttcg atacgtaaaa60aatcccggcg gccccacgct gggctacagc gaggaatcgg gcgtgggcat catcgagcag 120gacggcttgt tcttcaagga tttaagccgt gacggcaagc tggacaaata cgaggactgg 180cggctgtcgc cggaggagcg ggcgaaagac ctggcctcga aaatgacggt cgagcagatt 240gccggtctga tgctgtacag ccgtcatcag tcgatccccg ccctcagtac cggctggttt 300gcaggcacgt acagcgggaa aacgtatgaa gagagcggag cgaagccttg ggaactgacc 360gatgagcaga tcgcattttt gaccaaggac catgtgcggc acgtgctcgt aaccacggtg 420gaaagtccgg aagttgcggc gcgctggaac aacaaaatcc aggcgtttgc cgaaggcacc 480gggcttggca ttccggcgaa caacagctcc gatccccgcc acgcttcgga ttcaagctcc 540gaattcaacg cgggtgcggg cggccatatc tccatgtggc ccgagacgct cggcctagca 600gctacttttg atcccgagat cacgaagaag ttcgggatga tcgcttcccg ggaatatcgc 660gcgttagggc ttgctaccgc cctgtctccg caaatcgata tcgccacgga gccgcgctgg 720ttccggttta acggcacgtt cggcgaagat tcgaagctcg ccgccgatct ggcccgcgct 780
tatgtcgacg gcttccagac ttccgaaggc gaacgggaaa tcgcggacgg ttggggttat 840gacagcgtca atgcgatggt gaagcattgg ccgggaggcg gatcgggcga agccggaagg 900gacgcccact acagctgcgg gaagtatgcg gtgtatccgg gcaacaactt tgacgaacat 960ctggtgcctt ttgttgacgg ggcattcaag ctggacggca aaacagggaa ggcgtcggcc 1020gtcatgccgt attacacgat ctccttcggc caggacaccg taaacggcga aaatgtcggc 1080aactcctata actcgtacct gattaaggat ttgctgcgcg ggaaatacgg gtatgacggc 1140gtcgtatgca cggactggat gatcacggcc gacgtttccg gcgccaagga ttcttttctg 1200agcggaaaac catggggcgt ggaggatttg accgtggccg agcgccatta caagctgctg 1260·
atggcgggcg ttgaccaatt cggcggcaac aatgagatcg agccggtgtt ggaggcttac 1320aagatcgggg ttcgcgaaca cggcgaagcc tatatgcggg aacgcttcga gcaatcggcc 1380gtccggctgc tgaaaaatat gttccgcctc ggcttgtttg aaaatccgta cctcgatcca 1440caggaaagcg ccaagctggt cgggaacccc gaatttatgc gggaaggtta cgaagcacag 1500ctaaaatcga tcgtcatgct caaaaacaaa aacggggtgc tcccgcttcg cgcgaaaagc 1560aaagtttaca tccccaaacg ttttctcccg ccgggaaaag actggttcgg ccatccgacg 1620ccggagagct atgattatcc ggtcaacctg gaggtcgtct cgaaatattt cgaagtcacc 1680gaccaaccgg acgaagcgga tttcggcctt gtctttatcg catcaccgaa gtccggcacc 1740ggctacagcc aggaggacga ggagcagggc gggaacggtt atgtgccgat cagcctgcaa 1800tacaagccgt atacggcgga gcatgcccgg gaagtcagcc tggccggcga tgaacacggg 1860aacgaaccgc gaaaccgttc ttataaagga aaaaccgtca ttccgcacaa tacgacggat 1920ttaaacatgg tgctggagac gaaggaaaaa atgaaaggca aacccgtcat tgtctcgatg 1980ctattgagca atcccacggt cgtttcggag tttgaagcgg aagtggatgc catcctggcg 2040aacttcggcg ttcaggatca ggcgatcatg gatgtattga cgggggcggc ggagccgtcc 2100gggctgctgc cgatgcaaat gcccgcccat atgcgcaccg tcgaagagca gctggaagat 2160gtcgcgcacg atatggaatg ccatgtcgat tcggacaatc atgtatatga ctttgccttc 2220gggttgaact ggagcggcgt gatcgaggat gagcgaacca agaaataccg tagaagc: TAG 2280以上所述基因編碼的堿性β -葡萄糖苷酶，由759個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。SEQ ID NO. 2 為Met Arg Asn His Thr Ser Asp Thr lie Asn Lys Thr Val Glu ThrI5 10 15Val Arg Tyr Val Lys Asn Pro Gly Gly Pro Thr Leu Gly Tyr Ser1620 25 30Glu Glu Ser Gly Val Gly lie lie Glu Gln Asp Gly Leu Phe Phe3135 40 45Lys Asp Leu Ser Arg Asp Gly Lys Leu Asp Lys Tyr Glu Asp Trp4650 55 60Arg Leu Ser Pro Glu Glu Arg Ala Lys Asp Leu Ala Ser Lys Met6165 70 75Thr Val Glu Gln lie Ala Gly Leu Met Leu Tyr Ser Arg His Gln7680 85 90
Serlie Pro Ala Leu Ser Thr GlyTrp Phe AlaGly Thr Tyr Ser91 95 100105GlyLys Thr Tyr Glu Glu Ser GlyAla Lys ProTrp Glu Leu Thr106 110 115120AspGlu Gin lie Ala Phe Leu ThrLys Asp HisVal Arg His Val121 125 130135LeuVal Thr Thr Val Glu Ser ProGlu Val AlaAla Arg Trp Asn136 140 145150AsnLys lie Gin Ala Phe Ala GluGly Thr GlyLeu Gly lie Pro151 155 160165AlaAsn Asn Ser Ser Asp Pro ArgHis Ala SerAsp Ser Ser Ser166 170 175180GluPhe Asn Ala Gly Ala Gly GlyHis lie SerMet Trp Pro Glu181 185 190195ThrLeu Gly Leu Ala Ala Thr PheAsp Pro Glulie Thr Lys Lys196 200 205210PheGly Met lie Ala Ser Arg GluTyr Arg AlaLeu Gly Leu Ala211 215 220225ThrAla Leu Ser Pro Gin lie Asplie Ala ThrGlu Pro Arg Trp226 230 235240PheArg Phe Asn Gly Thr Phe GlyGlu Asp SerLys Leu Ala Ala241 245 250255AspLeu Ala Arg Ala Tyr Val AspGly Phe GinThr Ser Glu Gly256 260 265270GluArg Glu lie Ala Asp Gly TrpGly Tyr AspSer Val Asn Ala271 275 280285MetVal Lys His Trp Pro Gly GlyGly Ser GlyGlu Ala Gly Arg286 290 295300AspAla His Tyr Ser Cys Gly LysTyr Ala ValTyr Pro Gly Asn301 305 310315AsnPhe Asp Glu His Leu Val ProPhe Val AspGly Ala Phe Lys316 320 325330LeuAsp Gly Lys Thr Gly Lys AlaSer Ala ValMet Pro Tyr Tyr331 335 340345Thrlie Ser Phe Gly Gin Asp ThrVal Asn GlyGlu Asn Val Gly346 350 355360AsnSer Tyr Asn Ser Tyr Leu lieLys Asp LeuLeu Arg Gly Lys361 365 370375TyrGly Tyr Asp Gly Val Val CysThr Asp TrpMet lie Thr Ala
376 380385390Asp Val SerGly Ala Lys AspSer Phe LeuSer Gly Lys Pro Trp391 395400405Gly Val GluAsp Leu Thr ValAla Glu ArgHis Tyr Lys Leu Leu
406 410414420Met Ala GlyVal Asp Gln PheGly Gly AsnAsn Glu lie Glu Pro421 425430435Val Leu GluAla Tyr Lys lieGly Val ArgGlu His Gly Glu Ala436 440445450Tyr Met Arg Glu Arg Phe GluGln Ser AlaVal Arg Leu Leu Lys451 455460465Asn Met PheArg Leu Gly LeuPhe Glu AsnPro Tyr Leu Asp Pro466 470475480Gln Glu SerAla Lys Leu ValGly Asn ProGlu Phe Met Arg Glu481 485490495Gly Tyr GluAla Gln Leu LysSer lie ValMet Leu Lys Asn Lys496 500505510Asn Gly ValLeu Pro Leu ArgAla Lys SerLys Val Tyr lie Pro511 515520525Lys Arg PheLeu Pro Pro GlyLys Asp TrpPhe Gly His Pro Thr526 530535540Pro Glu SerTyr Asp Tyr ProVal Asn LeuGlu Val Val Ser Lys541 545550555Tyr Phe GluVal Thr Asp GlnPro Asp GluAla Asp Phe Gly Leu556 560565570Val Phe lieAla Ser Pro LysSer Gly ThrGly Tyr Ser Gln Glu571 575580585Asp Glu GluGln Gly Gly AsnGly Tyr ValPro lie Ser Leu Gln586 590595600Tyr Lys ProTyr Thr Ala GluHis Ala ArgGlu Val Ser Leu Ala601 605610615Gly Asp GluHis Gly Asn GluPro Arg AsnArg Ser Tyr Lys Gly616 620625630Lys Thr Vallie Pro His AsnThr Thr AspLeu Asn Met Val Leu631 635640645Glu Thr LysGlu Lys Met LysGly Lys ProVal lie Val Ser Met646 650655660Leu Leu SerAsn Pro Thr ValVal Ser GluPhe Glu Ala Glu Val661 665670675
Asp Ala He Leu Ala Asn Phe Gly Val Gln Asp Gln Ala He Met676680685690Asp Val Leu Thr Gly Ala Ala Glu Pro Ser Gly Leu Leu Pro Met
691695700705Gln Met Pro Ala His Met Arg Thr Val Glu Glu Gln Leu Glu Asp706710715720Val Ala His Asp Met Glu Cys His Val Asp Ser Asp Asn His Val721725730735Tyr Asp Phe Ala Phe Gly Leu Asn Trp Ser Gly Val He Glu Asp736740745750Glu Arg Thr Lys Lys Tyr Arg Arg Ser751755759以上所述的堿性β -葡萄糖苷酶同源性最高的是乳酸類芽孢桿菌154 (Paenibacillus lactisl54)的糖基水解酶家族3的功能域蛋白質(zhì)(glycosidehydrolase family 3 domain protein)，兩者的相似性=731/759 (96 % );同源性=746/759(98% )。以上所述的堿性β -葡萄糖苷酶基因Pbgl表達(dá)載體及用于轉(zhuǎn)化基因Pbgl的宿主。以上所述的堿性β -葡萄糖苷酶基因Pbgl，是從廣西南寧篩選到的克氏類芽孢桿菌GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)的基因組文庫中克隆得到的堿性葡萄糖苷酶基因 Pbgl。以上所述的堿性β -葡萄糖苷酶基因Pbgl，在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因生產(chǎn)β -葡萄糖苷酶，其酶活性最佳pH值8. 0，pH值6或pH值10時(shí)酶活性均達(dá)到最高酶活性的58%。以上所述的克隆表達(dá)采用的引物是上游引物5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAGAAACCATACTTCAGACACG-3，；下游引物5 ’ -GACAAGCTTTCAGCTTCTACGGTATTTCTTG-3，。以上所述的堿性β -葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組產(chǎn)物Pbgl能夠分解纖維ニ糖，應(yīng)用于纖維寡糖為原料降解成葡萄糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本堿性葡萄糖苷酶基因Pbgl，在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因生產(chǎn)葡萄糖苷酶Pbgl，其酶活性適應(yīng)酸堿范圍pH值5-10，最佳pH值8.0，pH值10時(shí)酶活性仍保留有最高酶活性的58%，優(yōu)于已有的堿性β_葡萄糖苷酶的活性，提高了其應(yīng)用價(jià)值。


圖I :是篩選含有β -葡萄糖苷酶基因Pbgl重組菌株的七葉苷選擇平板圖。圖2 :是β -葡萄糖苷酶純化物的SDS-PAGE圖。圖3 :是β -葡萄糖苷酶活性與pH值關(guān)系圖。圖4 :是β -葡萄糖苷酶水解纖維ニ糖的HPLC圖。
圖中說明圖I中是含有β_葡萄糖苷酶基因Pbbgl重組的菌株能夠在七葉苷選擇平板上形成黒色圏；圖2中β_葡萄糖苷酶純化物的分子量為84kDa;圖3中β -葡萄糖苷酶的最適pH為8. O ;圖4中的A和B分別是葡萄糖和纖維ニ糖的標(biāo)樣，C是β -葡萄糖苷酶能將纖維ニ糖水解成葡萄糖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施方法是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系XLl-blue、載體pUC19 (購(gòu)自大連TaKaRa公司);表達(dá)載體pSE380購(gòu)自Stratagene公司，購(gòu)自TaKaRa、MBI的限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑。下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述 I、克氏類芽孢桿菌GX-4基因組文庫的構(gòu)建克氏類芽孢桿菌GX-4 (Paenibaci I Ius cookii GX-4)的基因組DNA是按照BioFlux 公司的細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒 Biospin Bacteria Genomic DNAExtractionKit(目錄號(hào)BSC12S1)的使用說明來提取的。克氏類芽孢桿菌GX-4 (Paenibacillus cookii GX-4)的基因組文庫構(gòu)建是按照Epicentre 公司的文庫制備試劑盒 CopyControl Fosmid Library Production Kit (目錄號(hào)CCF0S110)的使用說明書來進(jìn)行的。構(gòu)建好的克氏類芽孢桿菌GX-4 (Paenibacilluscookii GX-4)的基因組文庫涂布到在含氯霉素12. 5μ g/mL，LA培養(yǎng)基每IOOml含蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCl O. 5g，瓊脂粉I. 5g的LA平板上。結(jié)果共獲得約4231個(gè)轉(zhuǎn)化子。2、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl序列的測(cè)定將在含氯霉素12. 5 μ g/mL的LA平板上得到的轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)菌落到含有氯霉素 12. 5 μ g/mL,蛋白胨 lg/1 OOmL,酵母粉 O. 5g/100mL, NaCl O. 5g/100mL,七葉苷O. 12g/100mL，檸檬酸鐵銨O. 5g/100mL，瓊脂粉I. 5g/100mL培養(yǎng)基的LA選擇平板上，將平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小吋。結(jié)果篩選到八個(gè)能產(chǎn)黒色透明圈的克隆，本發(fā)明只涉及其中一個(gè)克隆，進(jìn)ー步提取該克隆的質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切后，將獲得的DNA片段與經(jīng)BamHI酶切的去磷酸化的pUC19質(zhì)粒進(jìn)行連接。再CaCl2轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue中，在含氨芐青霉素100 μ g/mL、七葉苷O. 12g/100mL和檸檬酸鐵銨O. 5g/100mL的LA選擇平板上篩選亞克隆轉(zhuǎn)化子。結(jié)果共獲得約50個(gè)產(chǎn)生黑色圈的亞克隆轉(zhuǎn)化子。進(jìn)ー步提取其中6個(gè)亞克隆轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI完全酶切后，進(jìn)行O. 7%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果這6個(gè)亞克隆轉(zhuǎn)化子都能酶切下ー個(gè)2. 7kb的載體片段外，還給出另外一條DNA片段，大小為5.8kb。于是，對(duì)其中ー個(gè)亞克隆子進(jìn)行測(cè)序，并命名為pUC-Pbgl。pUC-Pbgl送交華大基因公司測(cè)定DNA核苷酸序列。3、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的核苷酸序列分析米用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi. nlm. nih. gov)上的軟件如 ORF f inder (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf.html), Blast (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)對(duì) DNA 序列進(jìn)行分析。β-葡萄糖苷酶基因序列的保守區(qū)外源DNA是由2277個(gè)堿基組成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF), Pbgl基因的起始密碼為ATG,終止密碼子為TAG，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。4、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl編碼的產(chǎn)物Pbgl的氨基酸序列分析β -葡萄糖苷酶基因Pbgl編碼ー個(gè)含759個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQID NO. 2所示，用DNAStar軟件預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為84206. 29道爾頓。用簡(jiǎn)單組件結(jié)構(gòu)研究工具(SimpleModular Architecture Research Tool,SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析 β _ 葡萄糖苷酶 Pbgl 的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果是自N端的第157-403位和542-746位氨基酸為家族3糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。5、β -葡萄糖苷酶基因Pbgl的克隆和表達(dá) 使用上游引物5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAGAAACCATACTTCAGACACG-3，和下游引物5’ -GACAAGCTTTCAGCTTCTACGGTATTTCTTG-3，，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增葡萄糖苷酶基因Pbgl，用限制性內(nèi)切酶Pag I和HindIII酶切β -葡萄糖苷酶基因Pbgl后，與經(jīng)NcoI和HindIII酶切的表達(dá)載體pSE380進(jìn)行連接。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XLl-blue中(轉(zhuǎn)化方法為CaCl2法)，涂布到含氨芐青霉素100 μ g/mL的LA平板上。挑取轉(zhuǎn)化得到的單菌落到含氨芐青霉素100 μ g/mL、七葉苷0. 12g/100mL和檸檬酸鐵銨
0.5g/100mL的LA選擇培養(yǎng)基平板上，將平板置于37°C恒溫箱培養(yǎng)6小吋，然后進(jìn)行氯仿熏蒸破胞，把平板置于37°C恒溫箱使表達(dá)的Pbgl酶與七葉苷和檸檬酸鐵銨反應(yīng)2 3小吋。觀察選擇平板。然后進(jìn)一步提取能形成黑色圈的克隆子的質(zhì)粒DNA，并將其命名為pSE-Pbgl，用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII酶切pSE-Pbgl后，進(jìn)行0. 7 %瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果pSE-Pbgl除有ー個(gè)5. 3kb的DNA片段外，還有一條大小約為I. Ikb的DNA片段。將含有質(zhì)粒pSE-Pbgl重組大腸桿菌XLl-blue菌株接種到600mL含氨芐青霉素100 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待0D_為0. 4時(shí)，加入IPTG使其終濃度為
0.5mmol/L, 37°C誘導(dǎo) 10 小時(shí)。IlOOOrpm 離心 3min，收集菌體，用 4mL pH7. 0100mmol/L 的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000rpm離心20min,取上清進(jìn)行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4mL上清液加入ImL 50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。在柱子里加入含有50mmoI/LNaH2P04，300mmol/LNaCl, 20mmol/L咪唑，pH 8. O的沖洗緩沖液lmL，緩慢攪拌，收集流出物。重復(fù)沖洗步驟4次。加入含有50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8. 0 的洗脫緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。6、β -葡萄糖苷酶的最適pH的測(cè)定β -葡萄糖苷酶以對(duì)硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物進(jìn)行最適pH測(cè)定反應(yīng)取10 μ I稀釋10倍的純酶液，分別在116 μ I的50mmol/L磷酸氫ニ鈉-檸檬酸緩沖液，pH 4. 6 8. O ;50mmol/L Tris-鹽酸緩沖液,pH 8. O 9. O ;50mmol/L甘氛酸-氧氧化鈉緩沖液，pH 9. O 10. O中與10 μ I 25mmol/L pNPG 50°C作用15分鐘，反應(yīng)時(shí)間到后用70 μ I lmol/L碳酸氫鈉終止反應(yīng)。在410nm波長(zhǎng)中檢測(cè)生成物的量。測(cè)定的結(jié)果是β -葡萄糖苷酶的最適pH是8. O,并且在pH6. 4或pH10. O時(shí)還有最聞時(shí)的58%以上的酶活力。
7、β -葡萄糖苷酶水解纖維ニ糖的測(cè)定β -葡萄糖苷酶以纖維ニ糖為底物、在ρΗ8. O的50mmol/L磷酸氫ニ鈉-檸檬酸緩沖液和50°C下作用30分鐘。反應(yīng)時(shí)間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。Pbgl的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。HPLC條件儀器AgilentllOO色譜儀；色譜柱氨基柱；流動(dòng)相こ腈水=70 30;流速LOmL/min ;檢測(cè)器RID折光檢測(cè)器。HPLC檢測(cè)的結(jié)果顯示Pbgl能夠?qū)⒗w維ニ糖水解葡萄糖。以纖維ニ糖為底物的Pbgl 的酶活是 92. 4U/mg。序列表〈110〉廣西大學(xué)〈120〉ー個(gè)編碼堿性葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用
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<160>2<170>PatentIn Version 3. 3<210>1<211>2280<212>DNA〈213〉克氏類芽抱桿菌 GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)〈220〉<221>gene〈222>(1). · · (2080)〈223〉〈400〉Iatgagaaacc atacttcaga cacgatcaat aagacagtag aaaccgttcg atacgtaaaa d0aatcccggcg gccccacgct gggctacagc gaggaatcgg gcgtgggcat catcgagcag 120gacggcttgt tcttcaagga tttaagccgt gacggcaagc tggacaaata cgaggactgg 180cggctgtcgc cggaggagcg ggcgaaagac ctggcctcga aaatgacggt cgagcagatt 240gccggtctga tgctgtacag ccgtcatcag tcgatccccg ccctcagtac cggctggttt 300gcaggcacgt acagcgggaa aacgtatgaa gagagcggag cgaagccttg ggaactgacc 360gatgagcaga tcgcattttt gaccaaggac catgtgcggc acgtgctcgt aaccacggtg 420gaaagtccgg aagttgcggc gcgctggaac aacaaaatcc aggcgtttgc cgaaggcacc 480gggcttggca ttccggcgaa caacagctcc gatccccgcc acgcttcgga ttcaagctcc 540gaattcaacg cgggtgcggg cggccatatc tccatgtggc ccgagacgct cggcctagca 600gctacttttg atcccgagat cacgaagaag ttcgggatga tcgcttcccg ggaatatcgc 660gcgttagggc ttgctaccgc cctgtctccg caaatcgata tcgccacgga gccgcgctgg 720ttccggttta acggcacgtt cggcgaagat tcgaagctcg ccgccgatct ggcccgcgct 780tatgtcgacg gcttccagac ttccgaaggc gaacgggaaa tcgcggacgg ttggggttat 840gacagcgtca atgcgatggt gaagcattgg ccgggaggcg gatcgggcga agccggaagg 900gacgcccact acagctgcgg gaagtatgcg gtgtatccgg gcaacaactt tgacgaacat 960ctggtgcctt ttgttgacgg ggcattcaag ctggacggca aaacagggaa ggcgtcggcc 1020
gtcatgccgt attacacgat ctccttcggc caggacaccg taaacggcga aaatgtcggc 1080aactcctata actcgtacct gattaaggat ttgctgcgcg ggaaatacgg gtatgacggc 1140gtcgtatgca cggactggat gatcacggcc gacgtttccg gcgccaagga ttcttttctg 1200agcggaaaac catggggcgt ggaggatttg accgtggccg agcgccatta caagctgctg 1260atggcgggcg ttgaccaatt cggcggcaac aatgagatcg agccggtgtt ggaggcttac 1320aagatcgggg ttcgcgaaca cggcgaagcc tatatgcggg aacgcttcga gcaatcggcc 1380gtccggctgc tgaaaaatat gttccgcctc ggcttgtttg aaaatccgta cctcgatcca 1440
caggaaagcg ccaagctggt cgggaacccc gaatttatgc gggaaggtta cgaagcacag 1500ctaaaatcga tcgtcatgct caaaaacaaa aacggggtgc tcccgcttcg cgcgaaaagc 1560aaagtttaca tccccaaacg ttttctcccg ccgggaaaag actggttcgg ccatccgacg 1620ccggagagct atgattatcc ggtcaacctg gaggtcgtct cgaaatattt cgaagtcacc 1680gaccaaccgg acgaagcgga tttcggcctt gtctttatcg catcaccgaa gtccggcacc 1740ggctacagcc aggaggacga ggagcagggc gggaacggtt atgtgccgat cagcctgcaa 1800tacaagccgt atacggcgga gcatgcccgg gaagtcagcc tggccggcga tgaacacggg 1860aacgaaccgc gaaaccgttc ttataaagga aaaaccgtca ttccgcacaa tacgacggat 1920ttaaacatgg tgctggagac gaaggaaaaa atgaaaggca aacccgtcat tgtctcgatg 1980ctattgagca atcccacggt cgtttcggag tttgaagcgg aagtggatgc catcctggcg 2040aacttcggcg ttcaggatca ggcgatcatg gatgtattga cgggggcggc ggagccgtcc 2100gggctgctgc cgatgcaaat gcccgcccat atgcgcaccg tcgaagagca gctggaagat 2160gtcgcgcacg atatggaatg ccatgtcgat tcggacaatc atgtatatga ctttgccttc 2220gggttgaact ggagcggcgt gatcgaggat gagcgaacca agaaataccg tagaagctga 2280<210>2<211>759<212>PRT〈213〉克氏類芽抱桿菌 GX-4(Paenibacillus cookii GX-4)<400>2Met Arg Asn His Thr Ser Asp Thr lie Asn Lys Thr Val Glu Thr151015Val Arg Tyr Val Lys Asn Pro Gly Gly Pro Thr Leu Gly Tyr Ser16202530Glu Glu Ser Gly Val Gly lie lie Glu Gln Asp Gly Leu Phe Phe31354045Lys Asp Leu Ser Arg Asp Gly Lys Leu Asp Lys Tyr Glu Asp Trp46505560Arg Leu Ser Pro Glu Glu Arg Ala Lys Asp Leu Ala Ser Lys Met61657075Thr Val Glu Gln lie Ala Gly Leu Met Leu Tyr Ser Arg His Gln76808590Ser lie Pro Ala Leu Ser Thr Gly Trp Phe Ala Gly Thr Tyr Ser
91 95100105Gly Lys ThrTyr Glu GluSer Gly Ala LysPro Trp Glu Leu Thr106 110115120Asp Glu GlnIle Ala PheLeu Thr Lys AspHis Val Arg His Val121 125130135Leu Val ThrThr Val GluSer Pro Glu ValAla Ala Arg Trp Asn136 140145150Asn Lys IleGln Ala PheAla Glu Gly ThrGly Leu Gly Ile Pro151 155160165Ala Asn AsnSer Ser AspPro Arg His Ala Ser Asp Ser Ser Ser166 170175180Glu Phe AsnAla Gly AlaGly Gly His IleSer Met Trp Pro Glu181 185190195Thr Leu GlyLeu Ala AlaThr Phe Asp ProGlu Ile Thr Lys Lys196 200205210Phe Gly MetIle Ala SerArg Glu Tyr Arg Ala Leu Gly Leu Ala211 215220225Thr Ala LeuSer Pro GlnIle Asp Ile Ala Thr Glu Pro Arg Trp226 230235240Phe Arg PheAsn Gly ThrPhe Gly Glu AspSer Lys Leu Ala Ala241 245250255Asp Leu AlaArg Ala TyrVal Asp Gly PheGln Thr Ser Glu Gly256 260265270Glu Arg GluIle Ala AspGly Trp Gly TyrAsp Ser Val Asn Ala271 275280285Met Val LysHis Trp ProGly Gly Gly SerGly Glu Ala Gly Arg286 290295300Asp Ala HisTyr Ser CysGly Lys Tyr Ala Val Tyr Pro Gly Asn301 305310315Asn Phe AspGlu His LeuVal Pro Phe ValAsp Gly Ala Phe Lys316 320325330Leu Asp GlyLys Thr GlyLys Ala Ser Ala Val Met Pro Tyr Tyr331 335340345Thr Ile SerPhe Gly GlnAsp Thr Val AsnGly Glu Asn Val Gly346 350355360Asn Ser TyrAsn Ser TyrLeu Ile Lys AspLeu Leu Arg Gly Lys361 365370375Tyr Gly TyrAsp Gly ValVal Cys Thr AspTrp Met Ile Thr Ala376 380385390
Asp Val SerGly Ala Lys AspSer Phe LeuSer Gly Lys Pro Trp391 395400405Gly Val GluAsp Leu Thr ValAla Glu ArgHis Tyr Lys Leu Leu406 410414420Met Ala GlyVal Asp Gln PheGly Gly AsnAsn Glu lie Glu Pro421 425430435Val Leu GluAla Tyr Lys lieGly Val ArgGlu His Gly Glu Ala
436 440445450Tyr Met Arg Glu Arg Phe GluGln Ser AlaVal Arg Leu Leu Lys451 455460465Asn Met PheArg Leu Gly LeuPhe Glu AsnPro Tyr Leu Asp Pro466 470475480Gln Glu SerAla Lys Leu ValGly Asn ProGlu Phe Met Arg Glu481 485490495Gly Tyr GluAla Gln Leu LysSer lie ValMet Leu Lys Asn Lys496 500505510Asn Gly ValLeu Pro Leu ArgAla Lys SerLys Val Tyr lie Pro511 515520525Lys Arg PheLeu Pro Pro GlyLys Asp TrpPhe Gly His Pro Thr526 530535540Pro Glu SerTyr Asp Tyr ProVal Asn LeuGlu Val Val Ser Lys541 545550555Tyr Phe GluVal Thr Asp GlnPro Asp GluAla Asp Phe Gly Leu
556 560565570Val Phe lieAla Ser Pro LysSer Gly ThrGly Tyr Ser Gln Glu571 575580585Asp Glu GluGln Gly Gly AsnGly Tyr ValPro lie Ser Leu Gln586 590595600Tyr Lys ProTyr Thr Ala GluHis Ala ArgGlu Val Ser Leu Ala601 605610615Gly Asp GluHis Gly Asn GluPro Arg AsnArg Ser Tyr Lys Gly616 620625630Lys Thr Vallie Pro His AsnThr Thr AspLeu Asn Met Val Leu631 635640645Glu Thr LysGlu Lys Met LysGly Lys ProVal lie Val Ser Met646 650655660Leu Leu SerAsn Pro Thr ValVal Ser GluPhe Glu Ala Glu Val661 665670675Asp Ala lieLeu Ala Asn PheGly Val GlnAsp Gln Ala lie Met
676 680 685690Asp ValLeu Thr Gly AlaAla Glu Pro Ser Gly LeuLeu Pro Met691 695 700705Gln MetPro Ala His MetArg Thr Val Glu Glu GlnLeu Glu Asp706 710 715720Val AlaHis Asp Met GluCys His Val Asp Ser AspAsn His Val721 725 730735、Tyr AspPhe Ala Phe GlyLeu Asn Trp Ser Gly ValHe Glu Asp736 740 745750Glu ArgThr Lys Lys TyrArg Arg Ser751755759
權(quán)利要求
1.ー個(gè)編碼堿性β-葡萄糖苷酶基因，其特征在干具有序列表中SEQ ID NO. I核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的堿性葡萄糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在干葡萄糖苷酶的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種表達(dá)載體,其特征在于它含有權(quán)利要求I所述的基因
4.ー種宿主細(xì)胞，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.一種堿性葡萄糖苷酶適合在降解纖維寡糖的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)編碼堿性β-葡萄糖苷酶基因和應(yīng)用，本堿性β-葡萄糖苷酶基因Pbgl含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，并提供了所述基因編碼堿性β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，該序列如SEQ ID NO.2所示。本堿性β-葡萄糖苷酶的活性適應(yīng)酸堿范圍pH值5-10，最佳pH值8.0，當(dāng)pH值10時(shí)酶活性仍保留有最高酶活性的58％，優(yōu)于已有的堿性β-葡萄糖苷酶的活性，提高了其應(yīng)用價(jià)值，適合在分解纖維寡糖中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102719458SQ20121006751
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者龐浩, 杜麗琴, 王子龍, 霍云龍, 韋宇拓, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)