專利名稱：一種用于檢測豬流感病毒的nasba方法
一種用于檢測豬流感病毒的NASBA方法技術領域
本發(fā)明屬于動物衛(wèi)生檢驗技術領域，涉及一種用于檢測豬流感病毒的NASBA方法。
背景技術：
豬流感(Swine influenza，SI)由流感病毒屬A型流感病毒中的豬流感病毒 (Swine influenza virus，SIV)引起，是集約化養(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的豬呼吸道疾病之一。該病典型臨床癥狀為發(fā)熱、厭食、體重減輕、精神萎靡、流涕、咳嗽以及呼吸困難等。 其單獨感染時病死率較低，但該病常與其他傳染病混合感染，如傳染性胸膜肺炎放線桿菌等，使病情加重，大大的提高了病死率。
常見的流感病毒的受體有兩種一種為唾液酸α-2，3半乳糖(SA α-2，3_Gal )， 另一種為唾液酸α-2，6半乳糖(3々(1-2，6-6&1)。不同流感病毒的HA受體特異性有所不同，多數(shù)禽流感病毒優(yōu)先結合SA α-2，3Gal，而人流感病毒則優(yōu)先結合SA α-2，6_Gal，豬流感病毒則對SAa-2，3-Gal與SA α _2，6_Gal均具有相同的結合能力。豬呼吸道上皮細胞表面同時存在人和禽流感病毒受體SAa-2，6-Gal和SAa_2，3_Gal，因此豬可被禽流感病毒和人流感病毒感染，同時SIV也具有感染人和禽的潛力。由此，豬成為了流感病毒基因重組或重配的“混合器”，不同亞型、不同宿主之間的A型流感病毒在豬體內(nèi)進行重組，產(chǎn)生各種新的病毒株。20世紀以來人類每次流感大流行爆發(fā)的前后都伴隨著SI的發(fā)生與流行，豬在流感病毒種間傳播鏈中所起的作用不容忽視。2009年甲型Hmi流感病毒的產(chǎn)生就是其中的一例，該毒株的產(chǎn)生導致了大量人群的死亡。所以加強對SIV的檢測不僅在獸醫(yī)界具有重要意義，對人流感的研究也有一定的意義，可以最大限度的降低人流感大流行再次爆發(fā)的可能性，對人類的生命安全具有長遠的公共衛(wèi)生學意義。
核酸序列依賴性擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一種分子生物學擴增新技術。是一種特異性等溫擴增RNA的技術，是基于一個等溫擴增酶系統(tǒng)，包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT)、RNaseH和T7RNA聚合酶。以RNA為模板，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和引物I的作用下合成cDNA，引物I的5'端帶有T7啟動子序列，然后引物II與cDNA鏈退火合成cDNA鏈的互補鏈，進而形成了含完整T7啟動子序列的雙鏈DNA。T7RNA聚合酶以此雙鏈DNA為模扳，合成大量拷貝的RNA片段。1991年，compton J首先介紹了該方法。與普通PCR不同的是，NASBA是由帶有T7啟動子序列的引物引導的、等溫的核酸擴增技術。反應在41°C進行，能在1- 內(nèi)將模板RNA擴增IO9倍，且不需特殊儀器，是一種快速、簡便、特異的擴增技術。
豬流感病毒是負鏈RNA病毒，病毒基因組由8個分節(jié)段的RNA組成，其中核蛋白 (NP)基因相對保守，通過對A、B、C三型流感病毒NP蛋白氨基酸序列比對結果表明A和B型流感病毒的NP蛋白具有很高的同源性。同時，來自不同宿主A型流感病毒株的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明NP基因相當保守，毒株之間最大氨基酸差別不超過11%。因此核蛋白經(jīng)常作為流感病毒型的分類和診斷的候選基因。本發(fā)明以豬流感病毒NP基因作為目的基因，建立NASBA快速檢測方法，用于豬流感病毒的診斷，提高我國豬流感診斷、疫情監(jiān)測和檢驗檢疫技術水平，為豬流感的防控提高技術支撐，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康、快速發(fā)展。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測豬流感病毒的NASBA。為實現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供如下的技術方案一對針對A型豬流感病毒NP基因的特異性擴增引物，其特征在于所述的擴增引物如 SEQ NO 1, SEQ NO 2 所示。
本發(fā)明進一步公開了采用SEQ NO 1, SEQ NO 2特異性擴增引物檢測豬流感病毒 NASBA的方法，其特征在于按如下的步驟進行(1)提取病毒RNA使用TRIZOL試劑提取RNA ；(2)NASBA擴增體系 將待檢樣品RNA 3μ1 ； 緩沖液4μ1 10mM/L dNTP 2μ1 20mM/L NTP 2μ1 DMSO μ 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 引物 NP-DET 2μ1(3)NASBA擴增程序在DNA擴增儀上65 °C加熱5min，41 V冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液，41 °C反應 90min ；4°C終止反應；(4)NASBA擴增產(chǎn)物鑒定1)將部分豬流感分離株的NASBA擴增產(chǎn)物稀釋10倍，作為模板進行反轉(zhuǎn)錄后；2)反轉(zhuǎn)錄體系:5XRT buffer 4μ ,2. 5mmol dOTWL、Random Primer Ιμ , Rnase inhibitor 0. 5PL、AMV μ 、10 倍稀釋的 NASBA 擴增產(chǎn)物 9. 5μ ；3)反轉(zhuǎn)錄程序?qū)⒎崔D(zhuǎn)錄反應管在PCR儀上按以下程序反應 30°C，10min，42°C，lh，99°C，5min，迅速降溫到 4°C ；(5)PCR擴增1)引物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)PCR 反應體系10XRT-PCR buffer 2μ , Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 9. 5μ 、水 3μ ；3)PCR擴增程序?qū)CR反應管放入在PCR儀上按以下程序反應95°C反應5min后； 940C 30s, 560C 30s, 72°C 30s，三個溫度循環(huán)反應；35個循環(huán)；72°C 10min,4°C終止反應。
4) PCR結果觀察用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察結果。
其中步驟(2)中所指的緩沖液為含40mM/LPH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl,12mM/L MgCl2, 5mM/L DTT 緩沖液。
其中步驟(3)中所指的酶混合液包含1 2U AMV, 0. 2 0. 5U RNaseH, 30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/mlBSA。
本發(fā)明更加詳細的制備方法如下 1材料1.1 病毒豬流感病毒A/Swine/Tianjin/ ΤΛ/2004(HlNl)(可由哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室的豬流感標準毒株A/Swine/ Coloraelo/1/77 (HlNl)代替)豬瘟弱毒(C 株，購自廣東永順生物制藥有限公司)，豬偽狂犬病病毒(MinA株，購自中國獸藥監(jiān)察所)， 豬細小病毒(PPV7909株，購自中國獸藥監(jiān)察所)。
1.2分子生物學試劑RNA提取試劑Trizol購自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、BSA購自Promega公司；dNTP、NTP購自上海生工生物工程有限公司。
1.3雞胚購自天津市某雞場。
1.4引物的設計與合成針對GENEBANK中已發(fā)表的豬流感病毒NP基因使用I^rimerpremierS. 0設計合成引物， 引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物如下 NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3' 2 方法2.1 提取病毒RNA病毒RNA的提取取豬流感病毒雞胚尿囊液200mL加入1. 5mL離心管中，加入 600μ1 Trizol液，震蕩混勻，室溫靜置5min，再加入200 μ 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min， 4°C 12000rpm離心IOmin ；取上清液到1. 5mL離心管中，加入800μ1含1%。DEPC的異丙醇，顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 40C 12000rpm離心lOmin，倒掉乙醇，室溫晾干，加入20 PlDEPC水溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.2 NASBA 擴增體系3μ1 待檢樣品 RNA和 4μ1 緩沖液、2μ1 10mM/L (1ΝΤΡ、2μ1 20mM/L ΝΤΡ、 μ1 DMS0、2Pl 引物ΝΡ-Τ7、2μ1引物NP-DET，加入到小離心管中。
2.3 NASBA 擴增程序在DNA擴增儀上65 °C加熱5min，41 V冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液，41 °C反應 90min ；4°C終止反應。
2. 4 NASBA擴增產(chǎn)物鑒定(1)將部分豬流感分離株的NASBA擴增產(chǎn)物稀釋10倍，作為模板進行反轉(zhuǎn)錄后。
(2)反轉(zhuǎn)錄體系 5X RT buffer 4μ ,2. 5mmoldNTP 4μ , Random Primer Ιμ , RNase inhibitor 0.5PL、AMV μ 、10 倍稀釋的 NASBA 擴增產(chǎn)物 9· 5μ 。
(3)反轉(zhuǎn)錄程序?qū)⒎崔D(zhuǎn)錄反應管在PCR儀上按以下程序反應 300C lOmin, 42°C lh, 99°C 5min，迅速降溫到 4°C。
(4) PCR 擴增1)引物即為NASBA擴增產(chǎn)物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)卩0 反應體系1(^肌-卩0 13肚作『2μ ,Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 9. 5μ 、水 3μ 。
3) PCR擴增程序?qū)CR反應管放入在PCR儀上按以下程序反應95°C反應5min 后；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，三個溫度循環(huán)反應；35個循環(huán)；72°C 10min,4°C終止反應。
4)PCR結果觀察用1%的瓊脂糖凝膠電泳(IOOmL瓊脂糖加入ΙΟμ ΕΒ)，在紫外燈下觀察結果。預期產(chǎn)物大小為391bp。見圖1。
本發(fā)明采用NASBA方法檢測豬流感病毒，完成如下的實驗 (1)特異性實驗1、提取豬流感病毒A/Swine/Tianjin/ ΤΛ/2004(HlNl)(可由哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室的豬流感標準毒株A/Swine/ Coloraelo/1/77 (HlNl)代替)、A/ Swine/Tianjin/ TJ3/2006 (H3N2)(可由哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室的豬流感標準毒株A/Swine/ Tennessee/26/77 (H3N2)代替)、豬瘟弱毒(C株，購自廣東永順生物制藥有限公司)，豬偽狂犬病病毒(MinA株，購自中國獸藥監(jiān)察所)，豬細小病毒 (PPV7909株，購自中國獸藥監(jiān)察所)的DNA或者RNA，使用豬流感病毒NASBA方法檢測。
2、提取病毒RNA病毒RNA的提取取豬流感病毒雞胚尿囊液200mL加入1.5mL離心管中，加入 600μ1 Trizol液，震蕩混勻，室溫靜置5min，再加入200 μ 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min， 4°C 12000rpm離心IOmin ；取上清液到1. 5mL離心管中，加入800μ1含1%。DEPC的異丙醇，顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 4°C 12000rpm離心lOmin，倒掉乙醇，室溫晾干，加入20 μ DEPC水溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 3、擴增反應(1)反應體系3μ1 待檢樣品 RNA (或 0ΝΑ)、4μ1 緩沖液、2μ1 10mM/L (1ΝΤΡ、2μ1 20mM/L ΝΤΡ、 μ1 DMS0、2Pl引物ΝΡ_Τ7、2μ1引物NP-DET，加入到離心管中。
(2)擴增過程65°C加熱5min，41°C冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液，41°C反應 90min ；4°C終止反應。
4、NASBA擴增產(chǎn)物鑒定將各菌(毒)株的NASBA擴增產(chǎn)物稀釋10倍，取9. 5 μ 作為模板進行反轉(zhuǎn)錄后， 采用引物NP-DET和ΝΡ-Τ7進行RT-PCR擴增，結果豬流感病毒TJl株和TJ3株擴增出了 391bp的目的片段，豬瘟弱毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒均未擴增出目的片段。說明該方法具有較高的特異性。見圖2。
(2)敏感性實驗1、將豬流感病毒A/Swine/Tianjin/ TJ/2004 (HlNl)(可由哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室的豬流感標準毒株A/Swine/ Coloraelo/1/77 (HlNl)代替)進行 KT1-IO-6的梯度稀釋，每個稀釋度均提取RNA，用NASBA方法進行檢測。
2、提取病毒RNA病毒RNA的提取取豬流感病毒雞胚尿囊液200mL加入1.5mL離心管中，加入 600μ1 Trizol液，震蕩混勻，室溫靜置5min，再加入200 μ 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min， 4°C 12000rpm離心IOmin ；取上清液到1. 5mL離心管中，加入800μ1含1%。DEPC的異丙醇，顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 4°C 12000rpm離心lOmin，倒掉乙醇，室溫晾干，加入20 μ DEPC水溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 3、擴增反應(I)NASBA反應體系各種成分分別為，4μ1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 ΞΑ、2μ1引物 ΝΡ-Τ7、2μ1 引物 NP-DET 和 3μ1 模板 RNA。
(2) NASBA擴增過程65°C加熱5min，4rC冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液， 41°C反應90min ；4°C終止反應。
4.NASBA擴增產(chǎn)物鑒定豬流感病毒TJ1株的檢測結果顯示，能夠檢測到10_5稀釋倍數(shù)的病毒液。(見圖3)(3)臨床樣品的檢測及對比實驗采集懷疑為豬流感病毒感染的豬鼻腔拭子5份放入運輸培養(yǎng)基中，送達實驗室后，劇烈震蕩，使病毒混合在運輸培養(yǎng)基中，取200μ1運輸培養(yǎng)基用于豬流感NASBA檢測，其余接種雞胚用于病毒分離。
1、臨床樣品的NASBA檢測 (1)提取病毒RNA病毒RNA的提取取豬流感病毒雞胚尿囊液200mL加入1.5mL離心管中，加入 600μ1 Trizol液，震蕩混勻，室溫靜置5min，再加入200 μ 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min， 4°C 12000rpm離心IOmin ；取上清液到1. 5mL離心管中，加入800μ1含1%。DEPC的異丙醇，顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 4°C 12000rpm離心lOmin，倒掉乙醇，室溫晾干，加入20 μ DEPC水溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> (2)擴增反應①反應體系取 3μ1 模板 RNA、4“1 BA、2μ1 Α、2μ1 ΝΑ、 μ1 DMS0、2Pl 引物 ΝΡ_Τ7、2μ1 引物NP-DET加入擴增管。
②擴增過程65°C加熱5min，41°C冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液，41°C反應 90min ；4°C終止反應。
(3 ) NASBA擴增產(chǎn)物鑒定在5份樣品中3樣品為陽性結果，其他樣品均為陰性。見圖4。
2、臨床樣品的病毒分離(1)方法將采集的臨床樣品用濾膜過濾后接種10日齡雞胚的羊膜腔和尿囊腔，每個樣品接種5個雞胚。將雞胚放入孵化器中培養(yǎng)96h，每天早晚兩次照蛋，棄去Mh內(nèi)死亡的雞胚。孵化后，采集未死亡雞胚的羊水和尿囊液，繼續(xù)傳代2次。將低3次傳代的雞胚羊水和尿囊液用血凝試驗和血凝抑制試驗，測定是否含有豬流感病毒。
(2)結果在5份樣品中3樣品含有豬流感病毒。
結論利用上述NASBA和病毒分離兩種實驗同時對臨床樣品進行檢查，兩種方法的符合率為100%，但NASBA方法較之病毒分離法可以更快的獲得結果，可用于臨床可疑的豬流感病毒樣品的快速檢測。


圖1 NASBA擴增產(chǎn)物PCR檢測結果；其中1 :DL2000，2 陽性樣品，3 水對照；
圖2特異性結果圖；其中1 豬瘟弱毒，2 豬偽狂犬病病毒，3 豬細小病毒，4 豬流感 病毒TJl株，5 豬流感病毒TJ3株，6 豬流感病毒TJ4株，M =IOObp DNA ladder ；
圖3敏感性實驗圖；其中1 =KT1稀釋毒液，2 :10_2稀釋毒液，3 :10_3稀釋毒液，4 :10_4 稀釋毒液，5 :10_5稀釋毒液，6 :10_6稀釋毒液；
圖4為臨床樣品檢測；其中Γ5 5份臨床樣品，6 陽性對照，7 陰性對照，M :DL2000 DNA Marker。
具體實施例方式
為了更充分地解釋本發(fā)明的實施方法，提供了用于檢測豬流感病毒NASBA-ELISA試 劑盒的實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中RNA提取試 劑Trizol購自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、BSA購自 Promega公司；dNTP、NTP購自上海生工生物工程有限公司。實施例1
(1)提取病毒RNA 取豬流感病毒雞胚尿囊液200mL加入1.5mL離心管中，加入 600μ1 Trizol液，震蕩混勻，室溫靜置5min，再加入200 μ 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5min， 4°C 12000rpm離心IOmin ；取上清液到1. 5mL離心管中，加入800μ1含1 %。DEPC的異丙 醇，顛倒混勻，12000rpm離心lOmin，棄上清液，加入500μ1含1 %。DEPC的70%的乙醇， 40C 12000rpm離心lOmin，倒掉乙醇，室溫晾干，加入20 PlDEPC水溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?2 ) NASBA 擴增體系 將待檢樣品RNA 3μ1
緩沖液 4μ1 (含 40mM/L PH8. 5 Tris-HCL, 70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2, 5mM/L DTT 緩 沖液)
lOmM/L dNTP 2μ1
20mM/L NTP 2μ1
DMSO μ
引物 ΝΡ-Τ72μ1
引物NP-DET 2μ1，加入到小離心管中；
(3)NASBA擴增程序
在DNA擴增儀上65°C加熱5min，4rC冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液(包含1 2U AMV，0.2 0.5U RNase H，30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/ml BSA)，41°C 反應 90min ； 4°C終止反應；
(4)NASBA擴增產(chǎn)物鑒定
1)將部分豬流感分離株的NASBA擴增產(chǎn)物稀釋10倍，作為模板進行反轉(zhuǎn)錄后；
2)反轉(zhuǎn)錄體系5XRT buffer 4μ ,2. 5mmol dNTP 4μ , Random Primer Ιμ , RNase inhibitor 0. 5μ , AMV μ , 10 倍稀釋的 NASBA 擴增產(chǎn)物 9. 5μ ；
3)反轉(zhuǎn)錄程序?qū)⒎崔D(zhuǎn)錄反應管在PCR儀上按以下程序反應 30°C，10min，42°C，lh，99°C，5min，迅速降溫到 4°C ；(5) PCR擴增1)引物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)PCR 反應體系10XRT-PCR buffer 2μ , Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 9. 5μ 、水 3μ ；3)PCR擴增程序?qū)CR反應管放入在PCR儀上按以下程序反應95°C反應5min后；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，三個溫度循環(huán)反應；35個循環(huán)；72°C 10min，4°C終止反應。
4) PCR結果觀察用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察結果。
權利要求
1.一對針對A型豬流感病毒NP基因的特異性擴增引物，其特征在于所述的擴增引物如 SEQ NO 1, SEQ NO 2 所示。
2.一種采用權利要求1所述的特異性擴增引物檢測豬流感病毒NASBA的方法，其特征在于按如下的步驟進行(1)提取病毒RNA使用TRIZOL試劑提取RNA ；(2)NASBA擴增體系 將待檢樣品RNA 3μ1 ； 緩沖液4μ1 10mM/L dNTP 2μ1 20mM/L NTP 2μ1 DMSO μ 引物 ΝΡ-Τ7 2μ1 引物 NP-DET 2μ1(3)NASBA擴增程序在DNA擴增儀上65°C加熱5min，41°C冷卻5min，迅速加入4μ1酶混合液，41 °C反應 90min ；4°C終止反應；(4)NASBA擴增產(chǎn)物鑒定1)將部分豬流感分離株的NASBA擴增產(chǎn)物稀釋10倍，作為模板進行反轉(zhuǎn)錄后；2)反轉(zhuǎn)錄體系5XRT buffer 4μ ,2. 5mmol dOTWL、Random Primer Ιμ , RNase inhibitor 0. 5PL、AMV μ 、10 倍稀釋的 NASBA 擴增產(chǎn)物 9. 5μ ；3)反轉(zhuǎn)錄程序?qū)⒎崔D(zhuǎn)錄反應管在PCR儀上按以下程序反應 30 0C，IOmin，42 °C，lh，99°C，5min，迅速降溫到 4°C ；(5)PCR擴增1)引物NP-DET 5 ‘ -GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3‘NP-T7 5' -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT -3'2)PCR 反應體系10XRT-PCR buffer 2μ , Mgcl2 μ , dNTP 2μ , NP-DET μ , ΝΡ-Τ7 μ , taq 0. 5μ 、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 9. 5μ 、水 3μ ；3)PCR擴增程序?qū)CR反應管放入在PCR儀上按以下程序反應:95 V反應5min后； 940C 30s, 560C 30s, 72°C 30s，三個溫度循環(huán)反應；35個循環(huán)；72°C 10min,4°C終止反應；4)PCR結果觀察用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察結果。
3.權利要求1所述的方法，其中步驟(2)中所指的緩沖液為含40mM/LPH8. 5 Tris-HCL,70mM /L KCl, 12mM/L MgCl2, 5mM/L DTT 緩沖液。
4.權利要求1所述的方法，其中步驟(3)中所指的酶混合液包含1 2UAMV,0. 2 0.5U RNaseH，30 50U T7 RNA 聚合酶，2 6μ1 lmg/mlBSA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測豬流感病毒的NASBA方法，主要包括提取病毒RNA；NASBA擴增體系；NASBA擴增程序；NASBA擴增產(chǎn)物鑒定；PCR擴增等步驟，本發(fā)明以豬流感病毒NP基因作為目的基因，建立NASBA快速檢測方法，用于豬流感病毒的診斷，該方法具有較高的特異性及敏感性，能夠檢測到10-5稀釋倍數(shù)的病毒液，可用于臨床可疑的豬流感病毒樣品的快速檢測。同時也為提高我國豬流感診斷、疫情監(jiān)測和檢驗檢疫技術水平，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康、快速發(fā)展。
文檔編號C12R1/93GK102534052SQ20121006926
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權日2012年3月16日
發(fā)明者任衛(wèi)科, 吳瑩, 崔尚金, 張國偉, 張榮升, 張莉, 李秀麗, 王志軍, 鄢明華, 高榮玲 申請人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所