專利名稱：一種(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法
技術領域：
本發明涉及一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。
背景技術：
(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯是制備羥甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)還原酶抑制劑如他汀類藥物的關鍵手性中間體。他汀類藥物是目前世界上最為暢銷的降膽固醇和降血脂藥物，因此，作為他汀類藥物關鍵手性中間體的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯具有較高的需求量和廣泛的應用范圍。目前，利用還原法生產4-氯-3-羰基丁酸乙酯的方法可以分為化學法和生物法， 其中生物法以其所具有的反應條件溫和、立體專一性強、轉化率高等特點被廣泛地研究和應用。在生物法過程所選取的還原酶中，又以NAD依賴型和可以以異丙醇作為氫供體者為最佳。因為NAD較NADP廉價，而異丙醇相較于葡萄糖，氧化后不會產生酸性物質，且不易造成反應液乳化，有利于下一步的提取過程。在該過程反應體系的選擇中，又以單一水相反應體系為較好。生產中大量使用有機溶劑，可能增加環境和安全風險。在單一水相反應體系獲得較高的底物濃度，是目前該項研究中的熱點。中國發明專利申請例如申請號200810124754. 2、201010213724. 6、 201110225388. I等公開了數種酮還原酶生產(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，然而這些方法采用的輔因子均為昂貴的NADP，并需要添加葡萄糖作為氫供體。其底物濃度雖然可以達到30 %，但是必須添加大量有機溶劑形成兩相體系，并且需要分批補料加入底物，操作繁瑣。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種改進的-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案一種(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑和氫供體的存在下發生不對稱還原反應生成(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯，特別是，所述生物催化劑為酮還原酶KRED102，所述氫供體為異丙醇，所述不對稱還原反應在pH為5. O 9. O的水相緩沖液中進行,并且反應體系中添加有聚乙二醇400 作為底物分散劑以及二價金屬離子作為酶活力增強劑。根據本發明的進一步實施方案反應起始時的反應體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度為I % 30% (w/v)，酮還原酶KRED102的濃度為O. 01% O. 8% (w/v)，異丙醇的濃度為1% -20%，聚乙二醇400的濃度為10% 70% (v/v)，所述二價金屬離子的濃度為 10 500mM。其中反應起始時的反應體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度優選為10 % 20% (w/v)例如為16% (w/v)，酮還原酶KRED102的濃度優選為O. 02% O. 1% (w/v)例如為O. 04% (w/v)，異丙醇的濃度優選為5% 10% (v/v)例如為8% (v/v)，聚乙二醇400的濃度為40% 60% (v/v)例如為50% (v/v)，二價金屬離子的濃度優選為O. 5 2mM例如為ImM，二價金屬離子可以以其無機鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽等形式引入到反應體系中。所述的水相緩沖溶液優選為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液。根據本發明的一個具體方面，所述制備方法的實施過程如下在反應容器中加入水相緩沖溶液，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯，異丙醇，酮還原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二價金屬離子的無機鹽，于溫度20°C 40°C下，攪拌反應，利用氣相色譜監測反應的轉化率，至轉化率達到80% 100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯產品。其中，反應溫度進一步優選為25°C 37°C。通過該實施過程獲得的(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯產品已經達到應用的要求，無需再進一步純化。優選地，所述的二價金屬離子為鈣離子或鎂離子，含有所述二價金屬離子的無機鹽為氯化鈣或氯化鎂。根據本發明，所用的原料4-氯-3-羰基丁酸乙酯、酮還原酶KRED102、聚乙二醇 400均可商購獲得。本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。由于以上技術方案的實施，本發明與已有技術相比具有如下優勢本發明方法通過添加廉價且來源廣泛的輔料，有效地改進了傳統酶催化生產過程中底物濃度低、酶反應耗時長等缺點，實現高效、低成本制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯； 并且，添加的輔料不會影響產物的分離和純化，底物和其它物質可一次投入，也無需使用其它機溶劑，操作簡單，特別適合在制藥工業中推廣應用。


圖I為實施例I中不加聚乙二醇400以及聚乙二醇400加入量分別為占反應體系總體積的10%、30%和50%的聚乙二醇400時，反應轉化率隨反應時間的變化圖；圖2為實施例2中不加鈣離子以及鈣離子加入量分別為O. ImM、ImM和5mM時，反應轉化率隨反應時間的變化圖。
具體實施例方式本發明提供的(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其是在pH為5. O
9.O的磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液中，加入O. I O. 8% (w/v)的酮還原酶KRED102作為生物催化劑，采用10% 70% (v/v)的聚乙二醇400作為底物分散劑，采用10 500mM 的鈣離子或其它二價金屬離子作為酶活力增強劑，不對稱還原濃度為I % 30% (w/v)的 4-氯-3-羰基丁酸乙酯，加入I. 2至I. 5當量的異丙醇作為氫供體，以80% 100%的轉化率，在2 24小時內生成目的產物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其反應式如下所示
權利要求
1.一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑和氫供體的存在下發生不對稱還原反應生成(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于所述生物催化劑為酮還原酶KRED102，所述氫供體為異丙醇，所述不對稱還原反應在pH為5. (T9. O的水相緩沖液中進行，并且反應體系中添加有聚乙二醇 400作為底物分散劑以及二價金屬離子作為酶活力增強劑。
2.根據權利要求I所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于反應起始時的反應體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度為19T30% (w/v)，酮還原酶 KRED102的濃度為O. 019Γ0. 8% (w/v)，異丙醇的濃度為1%_20%，聚乙二醇400的濃度為 10% 70% (v/v)，所述二價金屬離子的濃度為O. I 20禮。
3.根據權利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應起始時的反應體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度為109T20%(W/v)。
4.根據權利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應起始時的反應體系中，酮還原酶KRED102的濃度為O. 029Γ O. l%(w/v)。
5.根據權利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應起始時的反應體系中，異丙醇的濃度為59TlO%(v/v)。
6.根據權利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應起始時的反應體系中，聚乙二醇400的濃度為409Γ60%(ν/ν)。
7.根據權利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應起始時的反應體系中，二價金屬離子的濃度為O. 5^2 mM。
8.根據權利要求I或2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的水相緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液。
9.根據權利要求I或2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述制備方法的實施過程如下在反應容器中加入水相緩沖溶液，依次加入底物 4-氯-3-羰基丁酸乙酯，異丙醇，酮還原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二價金屬離子的無機鹽，于溫度20°C 40°C下，攪拌反應，利用氣相色譜監測反應的轉化率，至轉化率達到809^100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯產品。
10.根據權利要求9所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 所述的二價金屬離子為鈣離子或鎂離子，含有所述二價金屬離子的無機鹽為氯化鈣或氯化鎂。
全文摘要
本發明涉及一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑和氫供體的存在下發生不對稱還原反應生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，特別是，所述生物催化劑為酮還原酶KRED102，所述氫供體為異丙醇，所述不對稱還原反應在pH為5.0~9.0的水相緩沖液中進行，并且反應體系中添加有聚乙二醇400作為底物分散劑以及二價金屬離子作為酶活力增強劑。本發明方法通過添加廉價且來源廣泛的輔料，有效地改進了傳統酶催化生產過程中底物濃度低、酶反應耗時長等缺點，且操作簡單，特別適合在制藥工業中推廣應用。
文檔編號C12P7/62GK102605011SQ20121006934
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者唐圓圓, 李斌, 陶軍華, 鞠鑫 申請人:蘇州漢酶生物技術有限公司