專利名稱：用于檢測aml-evi1融合基因相對表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實時突光定量PCR技術,能夠對人類慢性髓細胞性白血病(chronic myelognous leukemia,CML)患者體內AMLl- EVIl融合基因表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提高檢測精度。
背景技術：
白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病。在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制，臨床表現為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據白血病細胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類。急性白血病病情進展迅速，自然病程僅有數周至數月。一般可根據白血病細胞系列歸屬分為急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)兩大類。而慢性白血病常見的有慢性粒細胞性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。由于白血病類型不同，治療方案及預后亦不盡相同。慢性髓細胞性白血病，簡稱慢粒(chronic myelognous leukemia , CML),是臨床上一種起病及發展相對緩慢的白血病。病程從數月到數年不等，臨床上該病可分為3期慢性期、加速期和急變期(CML-BC)，初診時大部分患者為慢性期，一般在確診2-5年內由慢性期進展到加速期，最后發展到急變期(CML-BC)，急變后化療有效率不超過30%，中位生存期1-13個月，預后極差。CML-BC期可涉及所有系的造血細胞，而不同急變類型的預后及治療原則不盡相同，此時細胞形態學和組織化學難以完全確定急變類型，需輔以免疫分型加以鑒別，結合細胞遺傳學和分子生物學檢查，有助于急變類型的診斷、治療和預后的判斷。Nueifora等報道的t (3 ;21)中，21號染色體上的AMLl在runt區和轉錄激活區之間斷裂并分別與MDSl和EVIl形成了 AMLl / MDSl和AMLl / EVIl融合基因。在AMLl /EVIl轉錄本中，AMLl的第5個外顯子被連接到EVIl的第2個非翻譯外顯子，導致了一個長的復合多肽的產生，它包含了 AMLl的runt區和幾乎全部EVII。AMLl / EVIl編碼一個180kD的融合蛋白，含3個DNA結合區。近年來，許多臨床和實驗觀察都顯示，慢粒急變期，除bcr / abl融合基因外，60%-80%還呈現某些新的細胞或分子遺傳學改變。其中AMLl /EVIl融合基因也是慢粒急性變的重要機制之一。EVIl與AMLl基因融合產生的AMLl / EVIl融合蛋白具有雙重的功能，一方面阻斷分化；另一方面則刺激增殖，這分別依賴于AMLl上的結構域和EVIl的第2個鋅指結構域。眾多報道顯示，慢粒急變EVIl陰性的患者中，可能部分患者EVIl基因產生了融合，使用EVIl特異性的引物則檢測不出。若使用更敏感的方法同時檢測AMLI / EVIl融合基因可能會提高慢粒急性變的預測性。目前臨床上已經將AML1-EVI1融合基因作為動態評估患者病情及預后的手段之一。常用的檢測技術有熒光原位雜交技術(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法盡管結果較為直觀，但是試驗過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費時費力，且結果需經驗豐富的專業人士來判讀，結果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點定量，無法對起始模板量進行準確的估算。此外，由于砷劑及全反式維甲酸的應用，APL治療效果得到很大的提高，微小殘留病是其復發的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、污染控制好的方法來對AMLl-EVI I融合基因mRNA殘留進行檢測。RQ-PCR米用Taqman探針突光定量技術,綜合生物學、酶學和突光化學于一體，從擴增到結果分析均在PCR反應管封閉狀態下進行，解決了 PCR產物污染而導致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結果用拷貝數表示，實現了對PCR產物的準確定量，易于統一標準，與定性PCR技術相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關系好，操作簡單，自動化程度高、防污染，有較大的線性范圍等優點。能夠滿足AML1-EVI1融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認為是目前首選檢測方法，用于評價治療效果、預測預后。實時熒光定量PCR中常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR GreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于AMLl-EVII的基因檢測
發明內容
鑒于現有技術中檢測AMLl- EVIl融合基因的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測白血病AMLl- EVIl融合基因相對表達量。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了一種用于檢測白血病AMLl- EVIl融合基因相對表達量的試劑盒。用于檢測AMLl- EVIl融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于
檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物AMLl-EVII-F, AMLl-EVI 1-R,探針 AML1-EVII-Probe，檢測內參基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探針 abl-Probe ;其中，
AMLl-EVII-F: GACCATCACTGTCTTCAAMLl-EVI1-R: AGTCTTCGCAGCGATAT
AMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。進一步地，檢測用上下游引物和探針的比例優選為AML1-EVI1_F AMLl-EVII-R AMLl-EVIl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。參照用上下游引物和探針的比例優選為abl-F abl-R abl-Probe的摩爾比為 2 : 2 : I。所述陽性對照品為含有AML1-EVI1基因的溶液；所述陰性對照品為無AMLl- EVIl基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit為Τ0Υ0Β0公司生產的qPCR用cDNA試劑盒產
品OTHUNDERBIRD qPCR MIX為TOYOBO公司生產的定量PCR試劑，產品規格為QPS-101。
使用本發明的試劑盒，將實時熒光PCR技術結合采用Tapman探針，可以對AMLl-EVIl融合基因的表達水平進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節約檢測時間。采用雙標準曲線法，通過構建AMLl- EVIl和內參基因abl的標準定量曲線，精確定量樣本的內參基因拷貝數和AMLl- EVIl拷貝數，相比于以往的免疫組化方法和現今的ΔΔ CT法，該試劑盒具有精度高，結果便于判讀等優點。加之該試劑盒將反應體系所需的引物、探針進行合理配比和優化，使擴增效率和速率等實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環節，大大提升了實驗效率。該試劑盒經測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助于臨床上慢性髓細胞性白血病(chronic myelognous leukemia,CML)患者體內AMLl-EVIl融合基因的微量殘留檢測，對于及時干預治療避免血液學復發、調整治療方案、評價治療效果、預測預后、預防臨床復發都具有重要意義。


圖I :AML1-EVI1型陽性結果示意圖。圖2 :AML1-EVI1型陰性結果示意圖。
具體實施例方式實施例I
本發明的用于檢測AML1-EVI1融合基因相對表達量的試劑盒，包括
紅細胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
無水乙醇；
檢測體系 PCR 反應液ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO 公司);THNDERBIRD ProbeqPCR Mix (2X )、AML1-EVI1 上、下游引物各 0. 8uM,AMLl-EVII 探針 0. 4 uM ；abl 上、下游引物各 O. 8uM、abl-probe (探針)0. 4uM ；
其中AML1-EVI1-F: GACCATCACTGTCTTCA ；
AMLl-EVI1-R: AGTCTTCGCAGCGATAT ；
AMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRA ；abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
陽性對照品含AML1-EVI1基因組溶液；陰性對照品不含AML1-EVI1基因組溶液。實施例2
本發明試劑盒的使用方法
(I)抽提血液中的組織RNA:在潔凈的I. 5ml的離心管中加入Iml紅細胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細胞；再次加入0. 5ml紅細胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細胞；向細胞中加入ImlTRIzol，反復吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min ;加入0. 2ml氯仿，震蕩均勻；HOOOrpm40C離心lOmin，吸取上清層轉移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫干燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉淀。(2)參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝 X=23ul反應液X (8份內參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+η份標本+1份陽
性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
(4)加樣加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質。(5)檢測檢測在實時熒光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件95°C預變性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環，突光信號于58°C 35 sec時米集。(6)結果判斷將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上，系統根據標準曲線和CT值自動計算出拷貝數。I)內參陽性時，檢測結果才認為有效；
2)陽性判斷標準，Ct〈36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗證；Ct >38，為陰性。實施例3
采用本發明核酸檢測試劑盒檢測臨床標本
取送檢的慢性髓細胞性白血病(CML)患者抗凝血標本共80例，按實施例2所述方法提取基因組RNA、配制試劑并檢測。每份標本加入檢測體系PCR反應液中2ul。同時做陽性，陰性，空白對照，內參基因/目的基因的標準曲線各一份。一臺96孔的熒光PCR儀可同時檢測38份樣品，每個樣本2次重復，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時間僅為100分鐘。實驗結果與特檢實驗室的報告結果相比較，確定樣品檢測的準確率。部分陽性結果如下表
權利要求
1.用于檢測AMLl-EVIl融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于 檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物AMLl-EVII-F, AMLl-EVI 1-R,探針 AML1-EVII-Probe，檢測內參基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探針 abl-Probe ;其中，AMLl-EVII-F: GACCATCACTGTCTTCAAMLl-EVII-R: AGTCTTCGCAGCGATATAMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRAabI-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于AMLl-EVII-F AMLl-EVI I-R AMLl-EVIl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。
3.如權利要求I所述的試劑盒,其特征在于abl-F: abl-R : abl-Probe的摩爾比為2: 2 : I0
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述陽性對照品為含有AMLl-EVIl基因的溶液；所述陰性對照品為無AMLl- EVIl基因的溶液。
全文摘要
本發明公開了用于檢測AML1-EVI1融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、檢測目的基因用上下游引物AML1-EVI1-F，AML1-EVI1-R，探針AML1-EVI1-Probe，檢測內參基因Abl用引物為abl-F，abl-R，探針abl-Probe。本發明試劑盒能夠對慢性髓細胞性白血病(chronicmyelognousleukemia，CML)患者體內AML1-EVI1融合基因表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提高檢測精度。
文檔編號C12Q1/68GK102776282SQ20121023367
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者周曉犢, 徐建成, 王淑一 申請人:武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司