專利名稱：一株高效利用乳糖生產燃料乙醇的釀酒酵母工程菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是一株緩解葡萄糖阻遏又提高了抗逆性的高效利用乳糖的釀酒酵母工程菌。
背景技術：
乳清是指在制造干酪或干酪素時，分離出絮凝物后剩下的極稀薄的液體，是工業生產干酪及干酪素的副產品，每生產It的干酪產生9t乳清，含有牛奶中55%的營養，但是由于乳清具有很高的BOD (生物耗氧量)和COD (化學耗氧量)，所以對環境造成很大的負擔。目前，全球乳清產量約為16億噸，而只有其中的50%得到處理，用于食品、飼料等方面， 剩下的約8億噸沒有得到有效利用，被排泄到自然界中，不但造成環境的污染，而且還造成該資源的巨大浪費。乳清中除了含有20%乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，約占乳清5%左右，是產生高BOD和COD的主要原因。如何利用乳清中的乳糖，從而減低乳清對環境的污染一直是乳制品行業關注的問題。乳清的利用主要有以下幾個方向用于食品行業、用于飼料行業、用于醫藥行業。但是隨著全球能源危機的加劇，以及世界糧食安全問題等因素，乳清成為新的生產燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生產燃料乙醇成為一個全新的熱點。目前國外利用乳清生產燃料乙醇已有40多年的歷史，所使用的菌種主要有克魯維酵母和釀酒酵母?？唆斁S酵母雖然能夠利用乳糖，但是該屬酵母酒精產率低，抗逆性差， 菌體生長量大，不適用于生產乙醇。釀酒酵母雖然是生產乙醇的最佳首選，但是野生型釀酒酵母不能夠利用乳糖為唯一碳源，所以如何改造釀酒酵母，使其可以發酵乳糖產乙醇，一直是科研人員的研究熱點。目前國外的解決方法主要分為以下幾種一、是利用原生質體融合技術，對釀酒酵母及克魯維酵母進行融合，篩選即可以利用乳糖又能高效產乙醇的突變株； 二、是采用基因工程手段，把外源基因導入到釀酒酵母體內，使得釀酒酵母具有分解乳糖的能力，從而解決其不能利用乳糖的問題。目前導入最多的外源的基因為克魯維酵母的LAC4 基因(編碼乳糖分解酶)和LAC12基因(編碼乳糖通透酶)。但是上述兩種方法均存在生長緩慢，酒精耐性低等問題。在釀酒酵母中，胞內海藻糖含量的提高可以改善其抗逆性，胞內海藻糖在中性海藻糖分解酶作用下分解，因此阻斷或敲除中性海藻糖酶基因可以提高胞內海藻糖含量。又因為乳糖在乳糖分解酶作用下首先分解成為半乳糖和葡萄糖，在釀酒酵母中，葡萄糖的存在會嚴重抑制半乳糖的利用，該現象被稱為葡萄糖阻遏。葡萄糖存在時，會激活葡萄糖阻遏蛋白復合物，復合物會抑制半乳糖利用所需酶基因的轉錄。因此，阻斷葡萄糖阻遏蛋白復合物的合成可以降低葡萄糖阻遏現象。在釀酒酵母中中性海藻糖分解酶是由NTHl和NTH2基因編碼，其中起主要作用的是NTHl編碼的蛋白。而葡萄糖阻遏蛋白復合物是由三個蛋白組成的復合物，其中只有由 MIGl編碼的Migl蛋白同半乳糖利用所需酶基因結合，抑制其轉錄。目前，國內外還未見有過表達LAC4和LAC12基因同時敲除NTHl和MIGl基因的報道。

發明內容
本發明的目的是解決野生型釀酒酵母不能夠利用乳糖為唯一碳源，而經基因工程改造的釀酒酵母存在生長抑制和抗逆性低的問題，提供一株能夠高效利用乳糖生產燃料乙醇的釀酒酵母工程菌株。本發明首先提供了一株可以利用乳糖的釀酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiae AY-510B24M，該菌株于2012年03月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院，菌種保藏號CGMCC No 5843。本發明所述利用乳糖釀酒酵母工程菌株的構建如下I)將PGKl (磷酸甘油酸激酶)啟動子和終止子與PUC19質粒連接得到pUC_PGKl ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段NTHl連接到第I步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-NTHl ；3)將編碼乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的質粒中的PGKl啟動子和終止子之間，得到 PUC-PGK1-NTH1-LAC4 ；4)將sh ble基因連接到第3步得到的pUC-PGKl-NTHl_LAC4上，得到質粒 pUC-PGKI-NTHI-LAC4-sh ble ；5)將來源于釀酒酵母的同源片段MIGl連接到第I步得到的pUC_PGKl上，得到 pUC-PGKl-MIGl ；6)將編碼乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的質粒中的PGKl啟動子和終止子之間，得到 PUC-PGK1-MIG1-LAC12 ；7)將kan基因連接到第6步得到的pUC-PGKl-MIGl_LAC12上，得到重組質粒 pUC-PGKI-MIGl-LAC12-kan ；8)將構建的兩個過表達質粒pUC-PGKl-NTHl-LAC4_sh ble 以及 pUC-PGKl-MIGl-LAC12-kan分別用Nsil、NheI酶切，用醋酸鋰轉化法將兩個質粒共同插入釀酒酵母a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株；9)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選得到可以利用乳糖的工程菌(雙倍體)。本發明同時提供了一段專門用于鑒定所述利用乳糖的釀酒酵母工程菌的特異性基因序列，該基因序列是以L4-U和L4-D為引物，以所述利用乳糖釀酒酵母工程菌菌株基因組為模板，擴增片段測序為一特異性序列，如序列表序列I所示。乳清發酵將以上構建的利用乳糖釀酒酵母工程菌接入20mL葡萄糖培養液中， 30°C過夜培養12h ;將菌液全部轉至200mL乳清培養液中，30°C靜置培養發酵。發酵期間每隔24h震蕩取樣，并記錄失重；發酵結束后，停止培養并稱重；測定發酵液的殘糖濃度、酒精濃度和菌體干重表征其綜合性能，結果見表I。 本發明的優點和積極效果本發明選用強啟動子PGKl過表達編碼乳糖通透酶的LAC12基因以及編碼乳糖分解酶的LAC4基因，同時敲除MIGl和NTHl基因，獲得了一株去除了葡萄糖阻遏、具有高耐性的高效利用乳糖的釀酒酵母工程菌AY-510B24M(CGMCC No 5843)。本發明所獲得的可以利用乳糖的釀酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiaeAY-510B24M (保藏號CGMCC No 5843)與初始的釀酒酵母菌(受體菌Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1364)相比能夠在乳清濃度為120g/L(乳糖含量為60g/L)的培養基中生長、發酵產乙醇；發酵周期為168h，乳清中乳糖利用率為99. 7% ;乳糖對無水乙醇得率為35.7% (相當于理論得率的69. 9%);同時緩解了葡萄糖對半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同時利用。


圖I是質粒pUC-PNLZ和pPMLK的驗證電泳圖。圖2是陽性重組釀酒酵母單倍體的驗證。圖3是乳糖利用型釀酒酵母工程菌的構建路線圖。圖4是工程菌與親本雙糖中發酵情況比較，其中㈧受體菌，⑶為工程菌。本發明所述的乳糖利用型釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具體為 AY-510B24M，已于2012年03月05日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區北辰西路I號院)，保藏號為CGMCC No 5843。
具體實施例方式本發明所使用的釀酒酵母雙倍體菌體是可以采用任何來源的釀酒酵母雙倍體菌株。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例I :高效利用乳清生產燃料乙醇的釀酒酵母基因工程菌的構建(I)基因工程菌株的構建I)將PGKl啟動子和終止子與PUC19質粒連接得到pUC-PGKl ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段NTHl連接到第I步得到的pUC_PGKl上，得到 pUC-PGKl-NTHl ；3)將編碼乳糖分解酶LAC4基因插入到第2步得到的質粒中的PGKl啟動子和終止子之間，得到 PUC-PGK1-NTH1-LAC4 ；4)將sh ble基因連接到第3步得到的pUC-PGKl-NTHl_LAC4上，得到質粒 pUC-PGKI-NTHI-LAC4-sh ble ；5)將來源于釀酒酵母的同源片段MIGl連接到第I步得到的pUC_PGKl上，得到 pUC-PGKl-MIGI ；6)將編碼乳糖通透酶LAC12基因插入到第5步得到的質粒中的PGKl啟動子和終止子之間，得到 PUC-PGK1-MIG1-LAC12 ；7)將kan基因連接到第6步得到的pUC-PGKl-MIGl_LAC12上，得到重組質粒 pUC-PGKI-MIGl-LAC12-kan ；圖I為pUC-PNLZ和pUC-PMLK質粒的驗證電泳圖其中泳道I為Ikb DNALadderMarker ;泳道 2 為 pUC-PNLZ 質粒；泳道 3 為 pUC-PMLK 質粒；泳道 4 為 pUC-PNLZ 單酶切線性化結果；泳道5為pUC-PMLK質粒單酶切線性化結果。8)NsiI、NheI分別酶切質粒pUC-PNLZ和pUC-PMLK ;用醋酸鋰轉化法分別將其插入到受體菌(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2.1364)的a型和α型單倍體,得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株。圖2為a和α型陽性重組單倍體PCR驗證結果。其中泳道I為5000bp DNALadder Marker,泳道2為a型重組單倍體下游PCR產物；泳道3為α型重組單倍體下游PCR產物，泳道4為受體菌a/ α型單倍體上游PCR陰性對照； 泳道5為a型重組單倍體上游PCR產物；泳道6為α型重組單倍體上游PCR產物；泳道7 為受體菌a/α型單倍體下游PCR陰性對照。9)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選得到可以利用乳糖的釀酒酵母工程菌(雙倍體)。圖3為利用乳糖釀酒酵母工程菌的構建過程。(2)基因工程菌株的特異性序列獲得的基因工程菌株AY-510B24M(CGMCC No 5843)染色體中含有一段特異性序列，可通過PCR擴增測序后進行菌株鑒定，而受體菌中不存在該片段。特異性片段擴增的引物序列分別為L4-U:5’ -GCTGTAGGTATCTCAGTTCGGT-3’L4-D :5，-TGAATCCGACTGAGAAATGG-3’特異性片段的基因序列見序列表I。實施例2 :利用乳清產燃料乙醇工程菌發酵性能的研究將工程菌AY-510B24M(CGMCC No 5843)接入20mL葡萄糖培養液中，30°C過夜培養12h ;將菌液全部轉至200mL乳清培養液中，30°C靜置培養發酵。乳清培養基為乳清粉 10%, (NH4)2SO4O. 5%, MgSO4 ·7Η20 0.1%。發酵期間每隔24h震蕩取樣，并記錄失重；發酵結束后，停止培養并稱重；測定發酵液的殘糖濃度、酒精濃度和菌體干重表征其綜合性能， 結果見表I。表I釀酒酵母受體菌和工程菌在乳清中發酵性能
項目CO2失重 (g)殘糖含量 (g/L)酒精度 (g/L)菌體干重 (g/L)乳糖對無水乙醇得率工程菌5.11.521.182.0135.7%受體菌O59.3O0.016O注所示數據為三個平行試驗結果的平均值。實施例3 :乳糖利用型釀酒酵母工程菌與出發菌株葡萄糖阻遏現象研究分別將工程菌和受體菌接種至20mL YETO培養液中，30°C培養24h。配置葡萄糖與半乳糖I : I混合培養基葡萄糖3g，半乳糖3g，(NH4)2SO4 O. 5g, MgSO4 · 7H20 O. lg，酵母粉O. 2g，蛋白胨O. lg, KH2PO4 O. 3g。按10%接種量將兩株菌各自接種到混合培養基中， 30°C靜置培養。發酵期間不同時間振蕩取樣，測不同糖濃度，從圖4可以看出，受體菌中，葡萄糖和半乳糖的利用是有順序的，只有葡萄糖被完全利用之后，半乳糖才開始利用；而在工程菌中，葡萄糖和半乳糖是同時利用的，當葡萄糖被完全消耗時，已經有16. 5%被利用，結果見圖4，其中(A)為受體菌，(B)為工程菌。實施例4 :工程菌與受體菌耐性比較將工程菌與受體菌分別接于6mLYEPD/管進行一級培養，30°C靜置培養24h后取種子液O. 5mL接于不同酒精濃度的YEH)培養基中，30°C靜置培養觀察產氣情況。溫度耐性實驗為取種子液O. 5mL接于YEH)培養基中，在不同溫度中培養，觀察其產氣情況。酒精耐性及溫度耐性見表3。具體培養基成分含量見表2。表2不同酒精濃度培養基成分含量
權利要求
1.一株高效利用乳糖生產燃料乙醇的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌 AY-510B24M，保藏號為 CGMCC No 5843。
2.根據權利要求I所述的工程菌株，其特征在于該菌株同親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1364)相比，轉化子能夠在乳清培養基中生長、發酵產乙醇；發酵周期為120h，乳清中乳糖利用率為97. 65% ;乳糖對無水乙醇得率為46. 4%，相當于理論得率的86. 24% ;同時緩解了葡萄糖對半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同時利用，并且可以在含有19% (v/v)乙醇的發酵液中正常發酵，環境溫度可以耐受到39°C而不影響發酵效果。
全文摘要
一株高效利用乳糖生產產燃料乙醇的釀酒酵母工程菌。本發明提供的釀酒酵母菌，是選用強啟動子PGK1分別表達乳糖分解酶基因LAC4及乳糖通透酶基因LAC12，同時敲除MIG1及NTH1基因，緩解葡萄糖阻遏現象，得到一株具有高耐性的高效利用乳糖產乙醇釀酒酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeAY-510B24M，保藏號為CGMCCNo5843。該菌在其它發酵性能不受影響的情況下與受體菌株(SaccharomycescerevisiaeCGMCCNo2.1364)相比能夠在乳清濃度為100g/L(乳糖含量約為50g/L)的培養基中生長、發酵產乙醇；發酵周期為120h，乳清中乳糖利用率為97.65%；乳糖對無水乙醇得率為為46.4%(相當于理論得率的86.24%)；同時緩解了葡萄糖對半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖可以同時利用；在含有19%(v/v)乙醇，或者環境溫度為39°C時可以正常發酵。
文檔編號C12N15/04GK102604849SQ20121008023
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者張翠英, 杜麗平, 申童, 肖冬光, 鄒靜, 郭學武 申請人:天津科技大學