專利名稱：一株高產乙酸酯釀酒酵母工程菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是一株高產乙酸酯釀酒酵母工程菌。
背景技術：
黃酒和白酒是我國的特色酒種，國內普通白酒和黃酒是以純種培養的釀酒酵母為主進行發酵的，其特點是發酵周期短、原料出酒率高，但由于釀酒酵母產酯香物質的能力極低，致使成品酒品質較差。高檔飲料酒(黃酒、白酒)酯香物質含量較高的主要原因是采用自然網羅微生物制曲發酵，通過自然制曲網羅的產酯能力較強的漢遜酵母和假絲酵母等生香微生物來提高酒中酯含量，而這些野生酵母的存在嚴重影響原料出酒率，其酒精發酵效率不到釀酒酵母的三分之一，因而導致我國高檔白酒和黃酒耗糧高、生產周期長、效率低、 成本高。如何提高酒中酯香物質的含量，一直是我國普通白酒、黃酒企業和相關科研單位研究的重要課題。但是，目前國內提高酒中酯香物質含量的方法仍存在很多問題。因此，要從根本上解決釀酒酵母的產酯能力還是需要利用分子生物學育種技術構建高產酯的釀酒酵母工業菌株。研究表明，乙酸酯類，如乙酸乙酯(溶劑類香氣)，乙酸異戊酯(香蕉風味)和乙酸異丁酯(成熟水果香)，是酒中主要的風味活性酯。這些酯類的形成是在酵母代謝時在酵母內合成的，形成的酯一部分通過細胞擴散到發酵液中，一部分被酵母吸附，留在細胞體內。提高這些乙酸酯的含量不僅可以增進酒的酯香，同時能有效地擴張、松馳神經，可減少喝酒引起的副作用。參與乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基轉移酶(AATase)，該酶催化醇和乙酰輔酶A 形成乙酸酯。該酶是一種巰基酶，有三種不同的類型AATase I>Lg-AATase I和AATase II, 分別由ATFULg-ATFl和ATF2編碼。而國內還沒有醇乙?；D移酶及其編碼基因對白酒和黃酒風味和品質影響的相關研究。

發明內容
本發明的目的是解決釀酒酵母自身產酯能力較低的問題，提供一株高產乙酸酯釀酒酵母工程菌株。本發明提供的高產乙酸酯釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),具體為EY-14, 已于2011年12月22日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區大屯路甲3號，保藏號為CGMCC No 5635。該釀酒酵母在其它發酵性能不受影響的情況下，模擬半固態發酵后，轉化子菌株與親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)相比，乙酸乙酯含量提高3. 6 倍，乙酸異戊酯的含量提高到55. 2mg/L,乙酸異丁酯含量提高到33. 8mg/L。本發明高產乙酸酯釀酒酵母工程菌株的構建方法包括
I)將PGKl啟動子和終止子與PUC19質粒連接得到pUC_P ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段IAH連接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)將編碼醇乙?；D移酶ATF2基因插入到第2)步得到的pUC-PGKl-IAH中的 PGKl啟動子和終止子之間，得到pUC-PGKl-IAH-ATF2 ；4)將kan基因連接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH_ATF2上，得到質粒 pUC-PGKl-IAH-ATF2-kan (以下簡稱 pUC_PIA2K)；5)將第4)步構建的過表達質粒PUC-PIA2K用Bpull02I酶切，用醋酸鋰轉化法分別將其插入釀酒酵母a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株，6)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選得到高產乙酸酯釀酒酵母工程菌(雙倍體)。本發明同時提供了一種專門用于鑒定所述高產乙酸酯的釀酒酵母工程菌的基因序列，該基因序列是以ATF-U和ATF-D為引物，以所述高產乙酸酯的釀酒酵母工程菌菌株基因組為模板，擴增片段測序為一特異性序列，如序列表I所示。模擬半固態發酵將酵母菌接入5mL麥芽汁培養液中，30°C過夜培養12h ;將菌液全部轉至20mL新鮮麥芽汁培養液中，30°C培養24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中， 浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL三角瓶中，加入IOg熟麥曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養液，28°C發酵5天。對發酵液進行分析，包括失重、酒度、殘糖和GC測定香氣成分含量。GC分析發酵液經蒸餾萃取后采用氣相色譜法測定。內標物為乙酸正戊酯。氣相色譜儀為 Agilent 7890C ;色譜柱 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 260 °C 30mX320ymX0. 5μπι，配FID檢測器。載氣為高純氮，流速2. OmL/min。起始柱溫為52°C， 以2°C /min的升溫速度升至70°C，再以4°C /min的升溫速度升至90°C，最后以10°C /min 的升溫速度升至200°C。檢測器溫度為250°C，進樣口溫度為230°C，進樣量為I. O μ L。分流方式為分流，分流比為25 I。本發明的優點和積極效果本發明選用強啟動子PGKl過表達編碼醇乙?；D移酶的ATF2基因，獲得了高產乙酸酯釀酒酵母工程菌EY-14 (CGMCC No 5635)。本發明所獲得的高產乙酸酯釀酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiae EY-14 (保藏號CGMCC No 5635)與初始的釀酒酵母菌(受體菌Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2. 1525)相比模擬半固態發酵后，乙酸乙酯含量提高3. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到55. 2mg/L,乙酸異丁酯含量提高到33. 8mg/L，為釀酒工業生產提供了優良菌株。


圖l.pUC-PIAK質粒的驗證電泳圖。圖2.陽性重組釀酒酵母單倍體的驗證，其中(a)為a型陽性重組單倍體驗證結果；(b)為α型陽性重組單倍體驗證結果。圖3.高產乙酸酯釀酒酵母工程菌的構建路線圖。
本發明所述的高產乙酸酯釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具體為 EY-14，已于2011年12月22日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱 CGMCC，地址為中國北京市朝陽區大屯路甲3號)，保藏號為CGMCC No 5635。
具體實施例方式本發明所使用的釀酒酵母雙倍體菌體是可以采用任何來源的釀酒酵母雙倍體菌株。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例I :高產酯釀酒酵母基因工程菌的構建(I)基因工程菌株的構建I)將PGKl啟動子和終止子與PUC19質粒連接得到pUC-PGKl ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段IAH連接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)將編碼醇乙酰基轉移酶ATF2基因插入到第2)步得到的pUC-PGKl-IAH中的 PGKl啟動子和終止子之間，得到pUC-PGKl-IAH-ATF2 ；4)將kan基因連接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH_ATF2上，得到質粒 pUC-PGKl-IAH-ATF2-kan (以下簡稱 pUC_PIA2K)；圖I為pUC-PIA2K質粒的驗證電泳圖其中泳道I為5000bp DNALadder Marker ； 泳道2為受體菌基因組PCR擴增同源片斷IAH ;泳道3為pUC-PIA2K質粒PCR擴增同源片斷 IAH ;泳道4為受體菌基因組PCR擴增ATF2 ;泳道5為pUC_PIA2K質粒PCR擴增ATF2 ;泳道 6為pUG6質粒PCR擴增Kan ;泳道7為pUC_PIA2K質粒PCR擴增Kan ;泳道8為pUC_PIA2K 質粒，PGKl上游引物+下游引物PCR擴增結果；泳道9為IKb DNA Ladder Marker ;泳道10 為載體PUC19單酶切線性結果；泳道11為pUC-PIA2K質粒單酶切線性結果。5)Bpull02I(Blp I)酶切質粒pUC_PIA2K ;用醋酸鋰轉化法分別將其插入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)a型和α型單倍體,得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株。圖2中(a)為a型陽性重組單倍體PCR驗證結果；(b)為 α型陽性重組單倍體PCR驗證結果。其中泳道I為5000bp DNALadder Marker，泳道2為受體菌a/ α型單倍體上游PCR陰性對照；泳道3為a/ α型重組單倍體上游PCR產物；泳道 4為受體菌a/ α型單倍體下游PCR陰性對照；泳道5為a/ α型重組單倍體下游PCR產物。6)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選得到高產乙酸酯釀酒酵母工程菌ΕΥ-14(雙倍體)。圖3為高產乙酸酯釀酒酵母工程菌的構建過程。(2)基因工程菌株的特異性序列獲得的基因工程菌株ΕΥ-14染色體中含有一段特異性序列，可通過PCR擴增測序后進彳丁囷株鑒定。特異性片段擴增的引物序列為ATF-U :5’ -TCGGCCTAAACGTTTGCTCCACA-3’ATF-D :5，-TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG-3’該特異性片段的基因序列見序列表I。
實施例2 :高產酯釀酒酵母工程菌與出發菌株發酵性能的研究將實施例I得到的工程菌和受體菌分別接入5mL麥芽汁培養液中，30°C過夜培養 12h ;將菌液全部轉至20mL新鮮麥芽汁培養液中，30°C培養24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中，浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL三角瓶中，加入 IOg熟麥曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養液，28°C發酵5天。發酵期間每隔 12h振蕩并稱重，記錄失重；發酵結束后，停止培養并稱重；測定發酵液的殘糖濃度、酒精體積分數以及主要香氣成分含量，以發酵能力、殘糖濃度和產物生成量表征其綜合性能，結果見表I。表I釀酒酵母受體菌和工程菌的發酵性能
權利要求
1.一株高產乙酸酯釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具體為EY-14，保藏號為 CGMCC No 5635。
2.根據權利要求I所述的釀酒酵母，其特征在于，在其它發酵性能不受影響的情況下，模擬半固態發酵后，轉化子菌株與親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2.1525)相比，乙酸乙酯含量提高3. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到55. 2mg/L，乙酸異丁酯含量提1 到33. 8mg/L0
全文摘要
一株高產乙酸酯釀酒酵母工程菌。本發明提供的釀酒酵母菌，是選用強啟動子PGK1過表達編碼醇乙?；D移酶的ATF2基因，得到高產乙酸酯釀酒酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeEY-14，保藏號為CGMCC No.5635。該菌在其它發酵性能不受影響的情況下，轉化子菌株與親本菌株(SaccharomycescerevisiaeCGMCC No2.1525)相比模擬半固態發酵后，乙酸乙酯含量提高3.6倍，乙酸異戊酯的含量提高到55.2mg/L，乙酸異丁酯含量提高到33.8mg/L；篩選得到的工程菌對發酵設備及條件沒有特殊要求，一般酒廠的設備和條件均可使用，因而有廣泛的應用前景，能為酒廠的工業化生產帶來顯著經濟效益。
文檔編號C12R1/865GK102604848SQ20121008023
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者張建煒, 張翠英, 戴隆海, 肖冬光, 郭學武 申請人:天津科技大學