專利名稱：一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學魚類育種技術領域，尤其涉及一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用。
背景技術：
目前，獲得較快生長速度的鯉魚依然是產業發展的需求，因此，選育出生長速度快，品質優良的鯉魚品種，尤其是選擇優良的候選基因及適當的處理方法在提高鯉魚生長速度的同時不影響其他性狀的表達，具有重要的意義。傳統的原核內顯微注射法、精子載體法、脂質體轉染法、反轉錄病毒載體法、細胞核移植方法等改善動物品種性能的方法皆因成本高、效率低或者插入片段小等缺點而無法廣泛應用。含有鯉IGF2b基因的慢病毒是一種用人工分離和修飾的方法獲得的病毒液，即根據鯉魚RNA反轉錄為cDNA，再設計相應引物進行PCR擴增，用相應內切酶切割獲得含有 IGF2b的基因片段，最終用此基因片段與載體pLenti6. 3-IRES-EGFP相連接從而獲得含有鯉IGF2b基因的慢病毒；其具體制備方式見專利申請號為201110356210. O的專利申請文件中所述。用此含有鯉IGF2b基因的慢病毒處理鯉魚來感染鯉特定組織中非分裂期和分裂期細胞，從而影響特定組織靶基因的表達以致其生長狀況發生變化。此種育種方法應用于魚類可在短期內確定具有目的基因的品系，提高鯉魚產肉量，從而縮短魚類育種時間，并且能使整合于靶細胞基因組的目的基因長期、穩定的表達，此類研究至今未見報道。

發明內容
解決的技術問題本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足，提供一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用。技術方案具體處理步驟如下(I)用人工分離和修飾的方法獲得含有鯉IGF2b基因的慢病毒；(2)讓鯉魚感染所述慢病毒，即在鯉魚體內注射所述慢病毒；(3)用綠色熒光來確定感染是否成功感染48h后，通過熒光顯微鏡觀測法觀察綠色熒光蛋白的表達狀況，如有綠色熒光蛋白的表達，則表明所述鯉魚已感染上所述慢病作為本發明的進一步改進，步驟(2)中所述慢病毒的感染在幼魚階段完成。作為本發明的更進一步改進，步驟(2)中，在所述鯉魚體重為5g時注射所述慢病毒。作為本發明的一種優選方案，步驟(2)中鯉魚注射部位為背部肌肉。
作為本發明的更進一步優選方案，步驟(2)中鯉魚注射部位為背鰭最前端定點到側線垂直距離的中間點。本發明還包括觀測由于感染而引起鯉魚性狀的變化的步驟(4) :3個月后，驗證鯉魚生長狀況和血液指標狀況。有益效果3個月后，驗證被感染鯉魚的生長狀況和血液指標狀況，其驗證方法為根據陰性對照、陽性對照，對比不同注射劑量的鯉魚的體重變化狀況及血液指標的變化狀況。結果顯示，用已檢測的含有鯉IGF2b基因的慢病毒感染鯉魚幼體，感染組相比對照組，鯉魚體重獲得了顯著增加的效果，且劑量較大時效果更好，同時對鯉魚血液指標沒有影響，安全性好。此種育種方法應用于魚類可在短期內確定具有目的基因的品系，縮短魚類育種時間，并且能使整合于靶細胞基因組的目的基因長期、穩定的表達，由于未對血液指標造成影響，所以安全性好。


圖I為熒光顯微鏡檢測到慢病毒注射48h后魚體綠色熒光蛋白的表達，通過此表達可以顯示被慢病毒感染的鯉魚背部肌肉的生長效果，有綠色熒光顯示說明已被感染圖2養殖3個月后不同實驗組魚的體重性狀的差異
具體實施例方式實施例I為了控制試驗誤差，所有注射工作由一個人完成，所有實驗組都在同一塘中養殖， 所有的養殖管理均由一個人進行。(I)含有鯉IGF2b基因的慢病毒來自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心鯉復合育種課題組，其制備方法參看專利申請號為201110356210.0的專利申請文件，250尾鯉取自中國水產科學研究院無錫淡水漁業研究中心南泉養殖基地，共設立5個實驗組一個是不做任何處理的陰性對照組；一個是注射不含鯉IGF2b基因的慢病毒稀釋液的陽性對照組，注射量為20μ L，總計約含I. IXlO5個病毒；另外三個是按照低、中、高三個不同濃度梯度注射含鯉IGF2b基因慢病毒稀釋液的慢病毒感染組，其注射劑量分別為10 μ L，20 μ L和40 μ L，分別對應含病毒個數為
5.54X IO4個病毒，1.1X IO5個病毒，2. 22 X IO5個病毒。(2) 48h后，隨機選取陰性對照組、陽性對照組和各劑量感染組魚各2尾，進行綠色熒光蛋白(GFP)熒光檢測。結果顯示，各劑量感染組魚均已感染鯉IGF2b基因慢病毒，見圖 I ;(3)在⑵的基礎上，養殖3個月后，測量體重，計算不同實驗組魚之間的生長表現。結果顯示，感染鯉IGF2b基因慢病毒的鯉魚比未感染此病毒的鯉魚體重明顯大，且最高感染劑量40uL組的體重最大，見圖2。(4)在(3)的基礎上，測量了不同實驗組魚的血液指標，包括腎臟、肝臟、以及IGF2 信號轉導路徑上的蛋白共9個指標，測定樣本量為20尾魚，結果見下表。
權利要求
1.一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，按如下步驟實現(1)用人工分離和修飾的方法獲得含有鯉IGF2b基因的慢病毒；(2)鯉魚感染所述慢病毒在鯉魚體內注射所述慢病毒；(3)用綠色熒光來確定感染是否成功感染48h后，通過熒光顯微鏡觀測法觀察綠色熒光蛋白的表達狀況，成功感染慢病毒的鯉魚體內有綠色熒光蛋白的表達。
2.根據權利要求I所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，其特征為步驟(2)中所述慢病毒的感染在幼魚階段完成。
3.根據權利要求I所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，其特征為步驟(2)中，在鯉魚體重為5g時注射所述慢病毒。
4.根據權利要求I 3中任一項所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，其特征為步驟(2)中鯉魚注射部位為背部肌肉。
5.根據權利要求I 3中任一項所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，其特征為步驟(2)中鯉魚注射部位為背鰭最前端定點到側線垂直距離的中間
6.根據權利要求I 3中任一項所述的含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，其特征為還包括步驟(4):觀測由于感染而引起鯉魚性狀的變化在鯉魚感染所述慢病毒3個月后，驗證鯉魚的生長狀況和血液指標狀況。
全文摘要
本發明涉及一種含有鯉IGF2b基因的慢病毒在提高鯉魚產肉量上的應用，采用含有鯉IGF2b基因的慢病毒來感染鯉特定組織中非分裂期和分裂期細胞，從而影響特定組織靶基因的表達以致其生長狀況發生變化，結果顯示用已檢測的含有鯉IGF2b基因的慢病毒感染鯉魚幼體，3個月后，感染組相比對照組，鯉體重獲得了顯著增加，同時鯉魚血液各項指標沒有影響，安全性好。
文檔編號C12N7/01GK102604897SQ20121008762
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者張寧, 徐跑, 蘇勝彥, 董在杰, 袁新華 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心