專利名稱：一種結冷膠的發酵制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵技術領域，尤其涉及一種結冷膠的發酵制備方法。
背景技術：
結冷膠是美國凱可(KELCO)公司開發的一種親水性膠體，它是以少動鞘脂單胞菌 (.Sphingomonas paucimobilis)為發酵菌,經數級發酵培養后,發酵液再通過一系列后期提取工藝生產而來。結冷膠是結冷膠族(Gellan Family )多糖中的一種,其分子的基本結構是一條主鏈，由重復的四糖單元構成，參與形成的單糖有葡萄糖、鼠李糖及葡萄糖醒酸， 摩爾比為2:1:1。每單位有I個O —甘油酰取代基，甘油酰基位于3 —連接成鍵的葡萄糖殘基的2位；另外每隔一個單位還有I個O —乙酰取代基，乙酰基在6位上。在結冷膠發酵液過程中，原始形態的高酰基結冷膠黏度極高，導致發酵液的含氧量受到限制，需要在發酵過程中使用大功率攪拌和強通風，不僅能耗大，而且發酵產率較低。目前國內現有的結冷膠發酵制備方法普遍存在發酵時間長、原料和能源費用高，產品收得率低等問題。傳統的結冷膠發酵為三級發酵，包括一級和二級種子罐及三級大發酵，通過改變培養基組成以及調整攪拌發酵參數；碳源主要為白糖，不但價格高，而且白糖是雙糖， 必須水解為單糖后才能更為有效地被發酵菌利用；氮源只用到大豆蛋白粉，其為遲效氮源， 菌體利用比較慢。傳統的結冷膠發酵攪拌器類型為軸向推進式和徑向圓盤彎葉式攪拌葉， 這種攪拌器類型能耗比較高。CN101586135公開了一種高產量的結冷膠發酵制備方法，該方法存在一些不足之處。首先該工藝為三級發酵，包括一級和二級種子罐擴大培養和三級發酵罐培養，總體發酵時間長，流程多；其次，該發酵工藝中大發酵中使用白糖和大豆蛋白作為碳源和氮源， 原料成本較高，而且不利于菌體對碳源和氮源的快速利用；最后，該工藝中使用的通風量過大，主要是由于攪拌槳葉不合理造成的。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠縮短發酵時間、降低能耗、適合工業化規模生產的結冷膠的發酵制備方法。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案
一種結冷膠的發酵制備方法，包括如下工藝步驟
(1)將斜面菌種接入搖瓶培養基中培養制成搖瓶種子液，其中所述菌種選用少動鞘脂單胞囷；
(2)將上述搖瓶種子液接入種子罐的種子罐培養基中進行一級擴大培養，得到一級種子液；
(3)將上述一級種子液接入發酵罐的發酵罐培養基中進行二級擴大培養，得到含有結冷膠的發酵液，其中發酵罐培養基包括如下質量比組分
葡萄糖漿5. O 6. 0%、大豆粉O. 3 O. 4%、銨鹽O. I O. 15%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 08 O. 11%、磷酸氫二鉀O. 13 O. 16%、硫酸鎂O. 05 O. 07%、消泡劑O. 04
O.06%、其余為蒸懼水。所述步驟(I)中所用的搖瓶培養基的pH為7. 10 7. 25，包括如下質量比組分 蔗糖I. 5 2. 5%、牛肉膏O. 2 O. 4%、酵母膏O. I O. 3%、氯化鈉O. 05 O. 15%、其余
為蒸餾水。所述步驟(I)中搖瓶培養條件為搖床轉速130 170rpm，溫度26 31°C，培養周期14 17h。所述步驟(2)中所用的種子罐培養基的pH為6. 8 7. 3，包括如下質量比組分 蔗糖I. 5 2. 5%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05%、磷酸氫二鉀O. 03
O.07%、硫酸鎂O. 05 O. 08%、消泡劑O. 02 O. 03%、其余為蒸餾水。所述步驟(2)中的一級擴大培養條件為溫度28.0 33. (TC，通風比I :3. O 3. 5，運行壓力O. 05 O. 08Mpa，培養周期12_15h。所述步驟(2)中的一級擴大培養的終點為OD值O. 25±0. 05，OD值測定采用721 型分光光度計、660nm波長條件下檢測。所述步驟(3)中的發酵罐培養基的pH為7. O 7. 3，所述銨鹽為硫酸銨。所述步驟(3)中的二級擴大培養條件為溫度30 33°C，通風比I: I. 25 2.0， 運行壓力O. 03 O. 05Mpa,培養周期45_48h。所述步驟(3)中二級擴大培養的終點為發酵液黏度為8000 12000cP，殘糖比例為O. I O. 3%，0D值O. 4±0. 05，OD值測定采用721型分光光度計、660nm波長條件下檢測。所述種子罐和發酵罐的罐徑比為I. 9 2. 6: 1，所用的攪拌槳為5 6組，其中上層4組攪拌槳采用斜葉式攪拌形式，底層剩余攪拌槳采用箭葉式與拋物式混合的攪拌形式。本發明的積極效果為
本發明方法發酵罐中，碳源以葡萄糖漿替換白糖，而氮源采用部分速效無機氮源，如硫酸銨，適量補充遲效有機氮源。這種培養基組成優化了培養基中碳源和氮源的類型，有利于菌體迅速生長，減少了發酵步驟，縮短了發酵時間并提高了發酵液出膠率，同時降低了原料成本。本發明采用兩級發酵，大大縮短了總體發酵時間，發酵周期由原來的75到80小時縮短為60到65小時。本發明方法改變了攪拌槳葉的類型和攪拌模式，上層四組攪拌槳葉采用斜葉式攪拌器，其為徑流型攪拌器，底層攪拌槳葉采用箭葉式與拋物式混合的攪拌模式。槳葉前端帶有后掠角的大寬葉槳葉，排出性能優于直葉和彎葉開啟渦輪，功耗低，剪切力小，在不影響發酵產率的前提下，可以降低攪拌機能耗30%同時也提升了體系溶氧條件。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。本實施例中所使用的搖瓶體積為5L，種子罐體積為5T，發酵罐體積為50T。實際使用體積為種子罐3. 5T，發酵罐35T。本實施例包括如下工藝步驟
(I)將斜面菌種接入搖瓶培養基，培養并制成搖瓶種子液；菌種選用少動鞘脂單胞菌/7awci o/^7i5·),搖瓶培養基的pH為7. 15, 包括如下質量比組分
蔗糖I. 5%、牛肉膏O. 4%、酵母膏O. 2%、氯化鈉O. 10%、蒸餾水97. 8% ；
搖瓶擴大培養條件為搖床轉速150rpm，溫度26°C，培養周期14h。(2)將上述搖瓶種子液按種子罐培養基體積的9%接入到種子罐中進行一級擴大培養，得到一級種子液；
所用種子罐的罐徑比為2. O: 1，轉速為IlOrpm，種子罐培養基的pH為7.0，包括如下質量比組分
蔗糖2. 5%、酵母膏O. 6%、磷酸二氫鉀O. 05%、磷酸氫二鉀O. 05%、硫酸鎂O. 08%、消泡劑
O.02%、蒸餾水 96. 7%ο培養條件為溫度33. (TC，通風比I :3· O，運行壓力O. 06Mpa，培養周期14h。培養的終點為OD值O. 30，OD值測定，使用721型分光光度計，660nm波長條件下進行OD值測定。(3)將上述制備的一級種子液按發酵培養基體積的8%接入發酵罐中進行二級擴大培養，得到含有結冷膠的發酵液，其中發酵罐培養基包括如下質量比組分
葡萄糖漿5. 0%、大豆粉O. 4%、硫酸銨O. 1%、酵母膏O. 6%、磷酸二氫鉀O. 08%、磷酸氫二鉀O. 15%、硫酸鎂O. 07%、消泡劑O. 05%、蒸餾水93. 55% ；
發酵罐培養基的pH為7. 3;
培養溫度在接種后至20h之間為32°C，20h至放罐前為30. 5°C ；
運行壓力O. 04Mpa，培養周期47h，通風比為變化數值，具體為接種后到15h通風比為 1:2. 0，15 30h通風比為1:1.4，30 47h通風比為1:1.25。在發酵過程中，當發酵液粘度高于400cp，pH低于6. 7時開始補堿(氫氧化鈉溶液)，堿液質量濃度為8-15%，頻率為每兩小時一次，補堿時段pH控制在6. 7-7. I之間。培養的終點為OD值O. 4±0. 05，OD值測定采用721型分光光度計、660nm波長條件下檢測。發酵液黏度為lOOOOcP，殘糖比例為0. 2%，出膠率為I. 8%。所用發酵罐的罐徑比為2. 3:1，轉速為150rpm，所用的攪拌槳為6組，其中上層4 組攪拌槳采用斜葉式攪拌形式，底層2組攪拌槳采用箭葉式與拋物式混合的攪拌形式。以上所述，為本發明的較佳實施案例，并非對本發明作任何限制，凡是根據本發明技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結構變化，均仍屬于本發明技術方案的保護范圍內。
權利要求
1.一種結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，包括如下工藝步驟(1)將斜面菌種接入搖瓶培養基中培養制成搖瓶種子液，其中所述菌種選用少動鞘脂單胞囷；(2)將上述搖瓶種子液接入種子罐的種子罐培養基中進行一級擴大培養，得到一級種子液；(3)將上述一級種子液接入發酵罐的發酵罐培養基中進行二級擴大培養，得到含有結冷膠的發酵液，其中發酵罐培養基包括如下質量比組分葡萄糖漿5. O 6. 0%、大豆粉O. 3 O. 4%、銨鹽O. I O. 15%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 08 O. 11%、磷酸氫二鉀O. 13 O. 16%、硫酸鎂O. 05 O. 07%、消泡劑O. 04 O.06%、其余為蒸懼水。
2.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中所用的搖瓶培養基的PH為7. 10 7. 25，包括如下質量比組分蔗糖I. 5 2. 5%、牛肉膏O. 2 O. 4%、酵母膏O. I O. 3%、氯化鈉O. 05 O. 15%、其余為蒸餾水。
3.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中搖瓶培養條件為搖床轉速130 170rpm，溫度26 31 °C，培養周期14 17h。
4.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中所用的種子罐培養基的pH為6. 8 7. 3，包括如下質量比組分蔗糖I. 5 2. 5%、酵母膏O. 5 O. 7%、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05%、磷酸氫二鉀O. 03 O.07%、硫酸鎂O. 05 O. 08%、消泡劑O. 02 O. 03%、其余為蒸餾水。
5.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的一級擴大培養條件為溫度28. O 33. (TC，通風比I :3. O 3. 5，運行壓力O. 05 O. 08Mpa, 培養周期12-15h。
6.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的一級擴大培養的終點為OD值O. 25±0. 05，OD值測定采用721型分光光度計、660nm波長條件下檢測。
7.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的發酵罐培養基的pH為7. O 7. 3，所述銨鹽為硫酸銨。
8.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的二級擴大培養條件為溫度30 33°C，通風比I: I. 25 2. 0，運行壓力O. 03 O. 05Mpa,培養周期 45-48h。
9.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中二級擴大培養的終點為發酵液黏度為8000 12000cP，殘糖比例為O. I O. 3%，OD值O.4 ± O. 05，OD值測定采用721型分光光度計、660nm波長條件下檢測。并不
10.根據權利要求I所述的結冷膠的發酵制備方法，其特征在于，所述種子罐和發酵罐的罐徑比為I. 9 2. 6: I，所用的攪拌槳為5 6組，其中上層4組攪拌槳采用斜葉式攪拌形式，底層剩余攪拌槳采用箭葉式與拋物式混合的攪拌形式。
全文摘要
本發明涉及一種結冷膠的發酵制備方法，包括如下工藝步驟將斜面菌種接入搖瓶培養基中培養制成搖瓶種子液；將搖瓶種子液接入種子罐培養基中進行一級擴大培養得到一級種子液；將一級種子液接入發酵罐中進行二級擴大培養得到含有結冷膠的發酵液，其中發酵罐培養基包括如下組分葡萄糖漿、大豆粉、銨鹽、酵母膏、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、消泡劑、蒸餾水。本發明方法發酵罐中，碳源以葡萄糖漿替換白糖，而氮源采用部分速效無機氮源，如硫酸銨，適量補充遲效有機氮源。這種培養基組成優化了培養基中碳源和氮源的類型，有利于菌體迅速生長，減少了發酵步驟，縮短了發酵時間并提高了發酵液出膠率，同時降低了原料成本。
文檔編號C12P19/04GK102605017SQ20121008888
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者許懷遠, 陳波 申請人:杭州健恒生物技術有限公司