專利名稱：一種提高植物抗蟲能力的方法
技術領域：
本發明屬于植物生物工程和植物改良基因工程領域。具體地說，本發明涉及昆蟲體內一批新的靶基因，可以通過植物介導的RNAi技術特異地抑制昆蟲體內這些靶基因的表達，進而抑制昆蟲的生長，提高植物的抗蟲性。本發明公開了這些靶基因的序列，以及它們在RNAi介導的轉基因抗蟲領域中的應用。
背景技術：
在農業生產中，蟲害一直是影響農作物產量的一個重要因素。人們每年 要投入大量的人力、物力來抑制蟲害，以提高作物產量。大量施用農藥造成了環境的嚴重污染，嚴重破壞了農田生物多樣性，農藥殘留也逐漸成為威脅人類健康的一個重要因素。同時，長期施用農藥使害蟲對農藥抗性增加，導致需要不斷增加農藥使用量，并改變農藥種類，導致環境問題更加嚴重。出于保護環境和可持續性發展的考慮，迫切需要建立新的抗蟲方法。向植物中轉入抗蟲基因，如Bt基因，使植物產生能殺蟲的蛋白，可以顯著提高植物的抗蟲性，同時減少農藥使用。目前轉基因抗蟲大豆、Bt抗蟲棉等已在農業生產中廣泛使用，帶來了良好的經濟和社會效益。目前已發現隨著時間的推移，各種轉基因抗蟲植物的抗蟲性正在下降，并且由于專一地抑制田間某一種害蟲，導致其他害蟲開始泛濫。因此，需要找到新的方法，開發出新型的轉基因抗蟲植物，以有效地和/或特異性地對抗植物的病蟲害。

發明內容
本發明的目的在于提供一種提高植物抗蟲能力的方法。在本發明的第一方面，提供一種提高植物抗昆蟲能力的方法，所述方法包括在植物體內表達特異性干擾所述昆蟲基因(或其片段)表達的干擾分子；所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。在另一優選例中，昆蟲取食該植物(轉基因植物)后，體內該昆蟲基因或片段表達被下調或沉默，生長或發育受到抑制或者死亡。在另一優選例中，所述的干擾分子選自(但不限于)以所述的昆蟲基因或其片段或其轉錄本為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核(苷)酸、小干擾RNA、微小RNA。在另一優選例中，所述方法包括(I)提供一構建物，所述構建物含有以下結構Seq 正向-X-Seq 反向；其中，Seqtt為來自所述的昆蟲基因或片段的核苷酸序列，Seq&^^ Seqtt為基本上互補的核苷酸序列；X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補；
(2)將(I)的構建物轉化植物。在另一優選例中，所述的間隔序列的長度為30-300nt ;較佳地為50_200nt ;更佳地為 100-150nt。在另一優選例中，所述的Seq1^1或Seq&@的長度為至少18bp，較佳地至少20bp ;更佳地至少50bp ;更佳地至少IOObp ;更佳地為100-700bp ;更佳地為200-600bp。在另一優選例中，所述的構建物在轉入植物后，在植物細胞、組織或器官中表達形成式II所示的干擾分子，
權利要求
1.一種提高植物抗昆蟲能力的方法，其特征在于，所述方法包括在植物體內表達特異性干擾所述昆蟲基因表達的干擾分子； 所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。
2.—種生產轉基因植物的方法，所述轉基因植物具有改良的抗蟲性，該方法包括在植物體內表達特異性干擾所述昆蟲基因表達的干擾分子； 所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。
3.如權利要求I或2任一項所述的方法，其特征在于，所述的干擾分子選自以所述的昆蟲基因或其片段或其轉錄本為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA。
4.如權利要求I或2任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供一構建物，所述構建物含有以下結構 Seq正向Ueq反向； 其中，為來自所述的昆蟲基因或片段的核苷酸序列，5叫&自與Seq1^1為基本上互補的核苷酸序列； X為位于Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seqtt和Seqg不互補； (2)將(I)的構建物轉化植物。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括 (a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有(I)所述的構建物； (b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所述構建物轉入植物細胞、組織或器官。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的: SEQ ID NO 1或其中第1-576位的序列； SEQ ID NO 2或其中第311-621位的序列； SEQ ID NO 3或其中第297-771位或第501-899位的序列； SEQ ID NO 4或其中第203-630位的序列； SEQ ID NO 5或其中第372-662位的序列； SEQ ID NO 45或其中第251-643位的序列。
7.如權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的植物選自雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。
8.如權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲選自植食性昆蟲。
9.如權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲基因包括但不限于棉鈴蟲的基因、玉米螟的基因、蚜蟲的基因、或稻飛虱的基因。
10.如權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲基因包括 (a)具有SEQID NO :1_5或8任一所示序列的基因； (b)與(a)限定的任一序列以增加的優選順序具有高于50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、98%或更高的序列一致性的核苷酸序列的基因。
11.用權利要求1-10任一所述的方法獲得的轉基因植物。
12.昆蟲基因或其片段的用途，用于作為制備特異性干擾昆蟲基因表達的干擾分子的抑制或沉默靶標； 所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。
13.—種構建物，所述構建物含有以下結構 Seq正向Ueq反向； 其中，為來自所述的昆蟲基因或其片段的核苷酸序列，5叫&自與基本上互補的核苷酸序列； X為位于Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seqtt和Seqg不互補； 所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。
14.權利要求13所述的構建物的用途，用于制備具有抗昆蟲能力的植物。
15.一種特異性干擾昆蟲基因表達的干擾分子在植物抗蟲中的用途；所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。
16.一種作為干擾分子抑制或沉默靶標的昆蟲基因片段，選自 SEQ ID NO 1中第1-576位的序列； SEQ ID NO 2中第311-621位的序列； SEQ ID NO :3中第297-771位的序列； SEQ ID NO :4中第203-630位的序列； SEQ ID NO :5中第372-662位的序列； SEQ ID NO 3中第501-899位的序列；或 SEQ ID NO 45中第251-643位的序列。
17.一種植物細胞，所述的植物細胞表達特異性干擾昆蟲基因表達的干擾分子； 所述的昆蟲基因選自胰蛋白酶基因、多巴脫羧酶基因、NADH脫氫酶黃素蛋白2基因、ATP合成酶P亞基基因、肌球蛋白重鏈B亞型基因。
18.一種轉基因植物、其組織或其后代，其特征在于，其含有權利要求17所述的植物細胞。
全文摘要
本發明涉及一種提高植物抗昆蟲能力的方法。本發明提供了一些來源于昆蟲的靶基因，基于這些靶基因的核酸序列設計構建物并在植物體內形成干擾這些靶基因表達的干擾分子，所述植物在被昆蟲服食后，可顯著抑制相關基因的表達，受昆蟲體內消化系統等屏障的影響較小或不受影響。本發明的方法可以提高植物的抗病蟲害能力，減少農藥使用，降低農業生產成本，保護生態環境。
文檔編號C12N15/84GK102732554SQ20121009422
公開日2012年10月17日 申請日期2012年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者楊長青, 武秀明, 毛穎波, 王凌健, 陳曉亞 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 蘇州凱益生物科技有限公司