專利名稱：一種制備牡丹花雄蕊浸膏的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備牡丹花雄蕊浸膏的方法，具體研究了牡丹花雄蕊中具有抗氧化能力的功效物質的提取、分離純化方法，并制備了具有抗氧化能力的浸膏，屬于食品新資源開發領域。背景技術：
牡Paeonia suffru(icosa,茍藥科、茍藥屬，原產于中國西部秦嶺和大巴山一帶山區。牡丹是我國特有的木本名貴花卉，花大色艷、雍容華貴、富麗端莊、芳香濃郁，而且品種繁多，素有“國色天香”、“花中之王”的美稱，長期以來被人們當做富貴吉祥、繁榮興旺的象征。以洛陽牡丹、菏澤牡丹最富盛名。牡丹除去觀賞價值外，其花瓣已被用作食材一千余年，牡丹的根經過加工稱為“丹皮”，是一種重要的藥材，入心、肝、腎三經，有清熱、活血、化淤等功能。然而牡丹花的雄蕊卻一直未得到充分的利用。每年花期過后，大量的牡丹雄蕊隨植株一起被丟棄掉，造成了巨大的浪費。本技術針對風味幽香、色澤金黃的牡丹花雄蕊中功效物質的提取、分離純化并制備浸膏進行研究，以期更好的開發利用牡丹花雄蕊，實現牡丹產業及花卉保健功能食品的更大發展。
發明內容
為了更好的開發利用牡丹花雄蕊，實現牡丹產業及花卉保健功能食品的更大發展，本發明提供了一種制備牡丹花雄蕊浸膏的方法，目的是研究牡丹花雄蕊中功效物質的提取介質、分離純化的方法和條件及其清除ABTS自由基的IC50值。一種制備牡丹花雄蕊浸膏的方法，包括以下步驟
I)將牡丹花雄蕊按照與純凈水的質量體積比1:16-18浸泡40-60分鐘得到牡丹花雄蕊功效物質粗提溶液。2)將步驟I獲得的粗提溶液通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至原來體積的 1/3-1/4后，經過石油醚、乙酸乙酯在常溫條件下萃取3-5次，直至溶于石油醚、乙酸乙酯的物質去除干凈。然后用無水乙醇在_18°C以下進行冷凍醇沉12小時后解凍過濾并將乙醇蒸發得提取液。3)將步驟2獲得的提取液通過高效液相色譜，色譜條件為甲醇水(含有0. 1%冰乙酸)(v/v) =3:7,流速I. 0 mL/min,進樣量10. 0 uL,檢測波長266 nm,溫度為室溫,時間 80 min ;再收集提取液。4)將步驟3獲得的提取液進行柱層析分離純化。將大孔樹脂AB-8采用濕法裝柱，用去離子水沖至水PH 7.0后等待上樣。將提取液上樣后分別采用去離子水、30%乙醇、 60%乙醇和無水乙醇洗脫樣品后通過高效液相色譜分析流出組分，液相色譜條件為甲醇 水(含有0. 1%冰乙酸)(v/v)=3:7，流速1.0 mL/min，進樣量10. 0 uL，檢測波長266 nm，溫度為室溫，時間80 min。根據不同組分的液相色譜圖譜判定組分所含物質是否相同，將含有相同物質的液體進行合并，將合并后的液體通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至無有機溶劑蒸出得濃縮液。5)將步驟4獲得的濃縮液進半制備高效液相色譜儀制備牡丹花雄蕊浸膏，制備色譜條件為甲醇水(含0. 1%冰乙酸)=3 7 (v/v)，波長266 nm，流速10.0 mL/min,進樣量2mL，溫度為室溫，時間為70min。每當半制備色譜儀圖譜出峰時即收集功效物質，將收集后的功效物質液體通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至無有機溶劑蒸出即得到牡丹花雄蕊浸膏。利用本發明制備的浸膏在低溫下耐保藏，可以用熱水沖調后飲用，香味獨特誘人、 顏色金黃，飲用后沁人心脾。將利用本發明得到的牡丹花雄蕊浸膏進行清除ABTS自由基檢測，得出清除50% ABTS自由基時浸膏的濃度(IC50)為0.914 mg/mL。這說明利用本發明制備的牡丹花雄蕊浸膏具有抗氧化能力，將有助于人體延緩衰老、增加免疫力、養顏護膚等。本發明的有益效果本方法以牡丹花雄蕊為原料，開創的研究了牡丹花雄蕊功效物質的提取、分離純化及抗氧化能力，并得到具有保健作用的牡丹花雄蕊浸膏。本方法為牡丹花雄蕊的綜合利用及牡丹花保健功能食品開辟了新的領域。
本方法確定了牡丹花雄蕊中功效物質的提取介質、料液比、液相色譜、半制備高效液相色譜條件及分離純化用柱材料與抗氧化能力等，為開發牡丹花雄蕊新型保健功能食品奠定了理論基礎。
具體實施例方式
實施例I牡丹花雄蕊中功效物質的提取介質研究
取0. 500g牡丹花雄蕊4份，置于四個小燒杯中，分別加入SmL純凈水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯，浸泡I小時后，觀察溶液的顏色，可發現純凈水溶液顯示的黃色〉乙醇溶液〉石油醚溶液〉乙酸乙酯溶液。過濾得到的4種溶液，分別進行全波長掃描，若出現平頭峰則稀釋后重復操作，直至全波長掃描圖中無平頭峰為止。分析4個樣品的結果后得出純凈水為最佳溶劑。牡丹花雄蕊與純凈水比例為1:16 (m/v)。實施例2牡丹花雄蕊中功效物質的高效液相色譜分離及半制備色譜制備條件研究
由全波長掃描結果確定檢測波長為266nm。設定單任務時間90分鐘，進樣量10 u L，流速lmL/min，溫度室溫，分別嘗試甲醇水比例為5 5、4 6、3 7、2 8和9 I的流動相，水中加入0. 1%的冰乙酸，流動相使用前混勻，超聲處理10分鐘以去除其中的氣泡。分析各液相色譜圖后發現3 7為最佳比例，且60分鐘后不再出峰。進一步嘗試3.5 6.5， 2.5 7. 5的比例后發現，3 7的甲醇水比例仍為最佳的流動相比例。進而得出最終用于各種樣品分析的液相色譜條件單任務時間60分鐘,進樣量10 u L,流速lmL/min,溫度室溫，流動相為3 7的甲醇加入0. 1%冰乙酸的純凈水溶液，檢測波長為266nm。半制備色譜制備牡丹花雄蕊中功效物質的條件為甲醇水(含0. 1%冰乙酸)=3 7，波長266nm，流速10mL/min，進樣量2mL，溫度為室溫，時間為70min。實施例3牡丹花雄蕊中功效物質分離純化不同柱材料的篩選
將純凈水粗提物經過石油醚、乙酸乙酯萃取后水相等待柱層析上樣。本技術采用聚酰胺、大孔樹脂AB-8、大孔樹脂XAD-16三種柱層析材料進行分離純化效果對比試驗。實驗采用濕法上樣，取20mL濃縮后的樣品上樣，依次使用純凈水、30%乙醇、60%乙醇和無水乙醇進行洗脫，洗脫速度控制在40-50滴/min，下方根據洗脫色素帶用試管接液，標明洗脫液濃度
4及編號后采用高效液相色譜進行分離效果比較。檢測結果為大孔樹脂AB-8分離純化效果最佳。實施例4牡丹花雄蕊浸膏清除ABTS自由基的IC50值確定
將提取物按照濃度梯度I、1/2、1/5、1/10、1/20進行樣品準備。準備好的樣品加3. 6mL ABTS-溶液，用振蕩器混勻，反應6分鐘，同時以0. 4mL水作為測試樣品按上述操作制成陰性對照液，每種濃度下制作3個平行。用紫外分光光度計測試反應后的樣品及陰性對照液在734nm波長下的吸光度，取三個平行實驗所得結果的平均值進行計算。按公式(A陰性對照-A)X100/A陰性對照求得ABTS*自由基清除率(%)。WABTS*自由基清除率(%)為縱軸，測試樣品的濃度為橫軸作圖，得出回歸直線，ABTS*自由基清除率(%)為50時的樣品濃度即為樣品對ABTS*自由基的半抑制濃度，IC50。結果為IC50值為0.914 mg/mL。實施例5牡丹花雄蕊浸膏的制備
1)將牡丹花雄蕊與純凈水按照質量體積比1:16浸泡40分鐘得到牡丹花雄蕊功效物質粗提溶液；
2)將步驟I獲得的粗提溶液通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至原來體積的1/3后經過石油醚、乙酸乙酯在25°C條件下萃取3次，直至溶于石油醚、乙酸乙酯的物質去除干凈。 然后用無水乙醇在_18°C以下進行冷凍醇沉12小時后解凍過濾并將乙醇蒸發掉得提取液；
3)將步驟2獲得的提取液通過半制備高效液相色譜儀，色譜條件為甲醇水(含有
0.1% 冰乙酸)(v/v)=3:7，流速 I. 0 mL/min，進樣量 10. 0 uL，檢測波長 266 nm，溫度 25。。， 時間80 min。再收集提取液。4)將3獲得的提取液進行柱層析分離純化。將大孔樹脂AB-8采用濕法裝柱，用去離子水沖至水PH 7.0后等待上樣。將提取液上樣后分別采用去離子水、30%乙醇、60%乙醇和無水乙醇洗脫樣品后通過高效液相色譜分析流出組分，液相色譜條件為甲醇水(含有
0.1% 冰乙酸)(v/v)=3:7，流速 1.0 mL/min，進樣量 10.0 uL，檢測波長 266 nm，溫度 25°C， 時間80 min。根據不同組分的液相色譜圖譜判定組分所含物質是否相同，將含有相同物質的液體進行合并，將合并后的液體通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至無有機溶劑蒸出得濃縮液。5)將步驟4獲得的濃縮液進半制備高效液相色譜儀制備牡丹花雄蕊中功效物質， 制備色譜條件為甲醇水(含0. 1%冰乙酸)=3 7 (v/v)，波長266 nm，流速10.0 mL/ min,進樣量2mL，溫度25°C，時間為70min。半制備色譜儀圖譜每次出峰時即收集功效物質，將收集后的功效物質液體通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至無有機溶劑蒸出得到牡丹花雄蕊浸膏。本發明所使用的石油醚、乙酸乙酯為分析純。
權利要求
1.一種制備牡丹花雄蕊浸膏的方法，其特征在于包括以下步驟1)將牡丹花雄蕊按照與純凈水的質量體積比1:16-18浸泡40-60分鐘得到牡丹花雄蕊功效物質粗提溶液；2)將步驟I獲得的粗提溶液通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至原來體積的1/3-1/4 后，經過石油醚、乙酸乙酯在常溫條件下萃取3-5次，直至溶于石油醚、乙酸乙酯的物質去除干凈；然后用無水乙醇在_18°C以下進行冷凍醇沉12小時后解凍過濾并將乙醇蒸發得提取液；3)將步驟2獲得的提取液通過高效液相色譜儀，色譜條件為甲醇水(含有0.1%冰乙酸)(v/v)=3:7，流速1.0 mL/min，進樣量10. 0 uL，檢測波長266 nm，溫度為室溫，時間80 min ;再收集提取液；4)將步驟3獲得的提取液進行柱層析分離純化；將大孔樹脂AB-8采用濕法裝柱，用去離子水沖至水pH 7. 0后等待上樣；將提取液上樣后分別采用去離子水、30%乙醇、60%乙醇和無水乙醇洗脫樣品后通過高效液相色譜儀分析流出組分，液相色譜條件為甲醇水(含有0.1%冰乙酸)(v/v)=3:7，流速1.0 mL/min，進樣量10.0 uL，檢測波長266 nm，溫度為室溫，時間80 min ;根據不同組分的液相色譜圖譜判定組分所含物質是否相同，將含有相同物質的液體進行合并，將合并后的液體通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至無有機溶劑蒸出得濃縮液；5)將步驟4獲得的濃縮液進半制備高效液相色譜儀制備牡丹花雄蕊浸膏，制備色譜條件為甲醇水(含0. 1%冰乙酸)=3 : 7 (v/v),波長266 nm,流速10.0 mL/min,進樣量 2mL，溫度為室溫，時間為70min ;當半制備色譜儀圖譜出峰時即收集功效物質，將收集后的功效物質液體通過旋轉蒸發儀在50°C溫度下濃縮至無有機溶劑蒸出即得到牡丹花雄蕊浸
全文摘要
本發明涉及一種制備牡丹花雄蕊浸膏的方法，具體研究了牡丹花雄蕊中具有抗氧化能力的功效物質的提取、分離純化方法，并制備了具有抗氧化能力的浸膏。利用本發明得到的牡丹花雄蕊浸膏進行清除ABTS自由基檢測，得出清除50%ABTS自由基時浸膏的濃度(IC50)為0.914mg/mL，這說明利用本發明制備的牡丹花雄蕊浸膏具有抗氧化能力，將有助于人體延緩衰老、增加免疫力、養顏護膚等。
文檔編號A23L1/29GK102599519SQ20121009516
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者張仁堂, 谷端銀 申請人:山東農業大學