專利名稱：一株產丁二酸基因工程菌及其發酵生產丁二酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及一株產丁二酸基因工程菌及其發酵生產丁二酸的方法，具體是一株高效利用葡萄糖生長并產丁二酸重組菌株及其利用該菌株發酵生產丁二酸的方法。
背景技術：
丁二酸(又稱琥珀酸)作為一種C4平臺化合物，不僅被廣泛應用于醫藥、農藥、 染料、香料、油漆、食品和塑料等行業，還可用于合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內酯等有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12 種最有價值的生物煉制產品之一。目前工業應用的丁二酸主要采用化學方法生產，污染大、 成本高，制約了丁二酸作為大宗化學品的發展潛力。利用微生物發酵法轉化可再生資源生產琥珀酸、價格低廉、污染小，且在發酵過程中可吸收固定CO2，開辟了溫室氣體利用的新途徑，工藝過程具有綠色、能耗低、原子經濟性高的優點，近年來成為研究的熱點。丁二的生產菌株很多，目前主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、ActinobaciIlus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens 和重組疋coli I。利用野生菌株生產丁二酸雖然獲得了較高的產物濃度，但培養過程培養基成本較高，且甲酸、乙酸等副產物積累較多，阻礙了其工業化進程。大腸桿菌由于對營養條件需求簡單，并具有生長迅速、遺傳背景清楚、易調控、易改造等特點，因此利用基因工程手段改造大腸桿菌生產丁二酸備受關注。現有的產丁二酸大腸桿菌基因改造策略主要有增強代謝途徑中的關鍵酶(如 PPC、PCK)、失活或敲除競爭途徑中的酶(如LDH、PFL)、引入新的代謝途徑(如乙醛酸循環) 等。其中，疋coli NZNlll由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，丙酮酸的代謝支路大大減少，丙酮酸大量積累，最終導致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發突變株疋coli AFPlll由于突變了葡萄糖專性轉運系統中的基因，菌株使用葡萄糖激酶系統進行葡萄糖的轉運，使丙酮酸的積累不再是糖轉運的限制因素，恢復了菌株在厭氧條件下利用葡萄糖的能力，且產物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發酵培養AFPlll過程中，丁二酸質量收率達到96%，生產強度為1.21因此，在高產丁二酸大腸桿菌菌株構建過程中，減少丙酮酸的積累是重組大腸桿菌高產丁二酸的關鍵因素之一。Stols等通過測定的蘋果酸酶對蘋果酸的Km值,認為蘋果酸酶在特定的菌種中有可能催化從丙酮酸到蘋果酸的逆向反應，原因是該反應方向在熱力學上是有利的。在 E. coli雙突變株NZNlll中超量表達Ascaris suum中的蘋果酸酶基因sfcA后，使蘋果酸酶逆向催化生成蘋果酸，減少了丙酮酸的大量積累，并以琥珀酸作為最終還原產物而大量積累。同時，Wang等人構建了萬.NZNlll/pTrc99a_麗*菌株，過量表達蘋果酸脫氫酶基因ijndh、后，能使疋coli NZNlll在厭氧條件下利用葡萄糖，丁二酸產量增加了 5倍多， 并且大大降低了丙酮酸的積累。Hui Wu和Zhi-min Li等人利用NZNlll進行兩階段發酵， 結果發現MDH和ICL的酶活大大提高，使丙酮酸的量大大減少，流向乙醛酸循環，從而使丁二酸的產量大幅度提高。Vemuri等人將Λ etli中的/77c基因引入NZNlll中，結果丙酮酸減少了 3倍，丁二酸產量增加了 52%。岳方方等人在JM1307中過量表達枯草芽孢桿菌中的 Pyc基因，結果丁二酸的產量增加了 I. 9倍，同時丙酮酸的量也有所減少。

發明內容
本發明的目的在于提供了一種能高效利用葡萄糖生長并產丁二酸的基因工程菌株及其構建方法，并利用該菌株厭氧發酵生產丁二酸，達到菌株的構建方法簡單方便，構建得到的菌株發酵方法簡單可行，易于工業化，產酸能力強的目的，從而大大降低生產成本， 提聞經濟效益。為實現本發明目的，本發明采用以下技術方案。一、本發明提供的一株產丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌 (.Escherichia co7i ) BA103，其保藏號登記號為 CCTCC NO M 2012032。二、本發明所述的大腸埃希氏菌BA103的構建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌為出發菌株，利用同源重組技術敲除基因(Glucose phophotransferase Enzyme IIBC (Glc))后，再過量表達丙酮酸羧化酶(PYC)，得到能夠利用葡萄糖產丁二酸的大腸埃希氏菌BA103。本發明所述的重組菌株BA103的代謝途徑如圖I所示。進一步地,所述的具體構建步驟如下
(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因(A/M)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7沒)活性的疋CWi NZNlll菌株為出發菌株，敲除其中的葡萄糖專性轉運系統中的基因，得到同時缺乏 IdhA ,pflB和ptsG的感受態菌株；
(2)合成一對5’端帶有酶切位點的引物，以ZaciococciAslactis subsp. cremoris NZ9000基因組DNA為模板，純化擴增出的基因后，表達質粒pTrc99a用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-/ _Fc ；
(3)將步驟(2)所述的重組質粒pTrc99a-/7_Fc導入步驟(I)得到的感受態菌株，獲得陽性轉化子；
(4)利用步驟(3)的陽性轉化子表達丙酮酸羧化酶(PYC)，得到可高效利用葡萄糖代謝產丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA103。三、利用本發明所述的大腸埃希氏菌BA103發酵生產丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發酵產酸。進一步地，具體步驟如下將大腸埃希氏菌BA103按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發酵培養基中有氧培養，當有氧培養菌體0D_至0. 4 0. 6用0. 5 mM的IPTG誘導至 0D_=3時，按3倍菌泥接種量轉接至厭氧階段發酵培養基中厭氧發酵。其中所述的有氧階段發酵培養基是現有技術中有氧培養產丁二酸大腸桿菌的常規培養基；所述的厭氧階段發酵培養基是以葡萄糖為碳源的產丁二酸大腸桿菌用發酵培養基。本發明的有益效果在于本發明以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌NZNlll為出發菌株，利用同源重組技術敲除葡萄糖專性轉運系統中的基因，并表達Zaclactis subsp. cremoris NZ9000 中的/77c基因，通過兩階段發酵，得到了高效利用葡萄糖產丁二酸的優良菌株疋coli BA103。


圖I本發明所述的重組菌株BA103的兩階段代謝途徑；
其中，黑色粗線方塊處表示敲除失活的酶；虛線部分表示新構建的途徑。圖2線性DNA片段的電泳鑒定圖。圖3同源重組陽性重組子的電泳鑒定圖。圖4重組質粒pTrc99a-/ _FC的構建圖譜。圖5 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖6重組質粒pTrc99a-/ _FC的單酶切鑒定圖。本發明的微生物分類命名為大腸埃希氏菌co7i ) BA103,其保藏日期為2012年2月23日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱為CCTCC，保藏地址是中國·武漢·武漢大學；保藏編號CCTCC NO M 2012032。
具體實施例方式下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。本發明的生物材料的來源的說明
I、質粒來源
本發明所述的表達質粒用pTrc99a的來源是購自Introvegen公司。本發明所述的氯霉素抗性基因的來源是pKD3,購自Introvegen公司。本發明所述的能夠誘導表達λ重組酶的質粒的來源是pKD46,購自Introvegen 公司。本發明所述的能夠誘導產生FLP重組酶的質粒的來源是pCP20,購自Introvegen 公司。2、基因組模板來源
Lactococcus lactis cremoris NZ9000,購自中國微生物菌種網(www. mum800. com)。3、出發菌株'E. coli NZNlll的感受態菌株的來源有兩處
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申請人首先通過查閱到該生物材料的上述文獻出處，并聯系了發表人系美國芝加哥大學的David P. Clark教授，并郵件請求其贈與該生物材料，并免費獲得了該生物材料；且申請人保證從本申請日起二十年內向公眾發放該生物材料；
(2)該生物材料還在中國專利(申請號96198547.X，申請日1996. 10. 31，授權曰2003年 I月I日，授權公告號CN1097632C)的專利文獻中公開并獲得授權。4、引物的設計及合成自行設計并外包金斯瑞生物技術公司合成。實施例I
本實施例說明利用同源重組技術敲除出發菌株NZNlll中葡萄糖專性轉運系統中的基因，得到消除氯霉素抗性菌株的過程。I、利用LB培養基，于37°C、有氧條件下培養大腸桿菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 O. 6， 制備成電轉感受態。
2、將質粒pKD46電轉入感受態的大腸桿菌NZNlll。電擊條件為200 Ω，25 μ F， 電擊電壓2. 3 kV，電擊時間4 5 ms ο電擊后迅速將菌體加入預冷I mL的SOC培養基，150 r/min、30°C培養I h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養基平板篩選出陽性轉化子大腸桿菌 NZNlll (pKD46)。3、在LB培養基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導質粒pKD46表達出λ
重組酶，制成電轉感受態。4、以兩側帶有FRT位點的氯霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統，以質粒PKD3為模板，并設計兩端帶有同源片段的擴增引物，擴增出線性DNA同源片段，引物序列如下
上游帶同源臂引物H1-P1，下劃線為同源片段
5’ -ATCGCAGCGTACATGTTTAACCGTTTCTACCGTATTAAGCTGCCTGAGTATCGTGTAGGCTGGAGCTGCT TC-3，。下游帶同源臂引物H2-P2，下劃線為同源片段
5， -TTCGCTGGTACCTGTCGCTTTTGCATCTTCAGTCGCGTCTTCACGACCCGGCATGGGAATTAGCCATGGT CC-3，。反應體系帶同源臂的上下游引物(100 11101/^1^各0.5 yL;模板DNA(100 ng/ μ L) O. 5 μ L ； 10 X buffer 5 μ L ；dNTPs (10 mM)各 I μ L ;DMS0 (100%) 2.5 μ L ； Pyrobest DNA 聚合酶(2· 5 U/ μ L) I μ L ；ddH20 36/35. 5 μ L ;總體積 50 μ L。反應條件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 個循環)； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;15 個循環)；72°C，5 min。線性DNA片段的鑒定如圖2。5、電轉線性DNA片段至已誘導表達λ重組酶的大腸桿菌NZNlll(pKD46)感受態， 并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了 PCR鑒定，電泳圖如圖3所示。6、陽性重組子制成感受態后倒入能誘導表達FLP重組酶的質粒pCP20，于42°C熱激表達FLP重組酶后即可消除氯霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的均極為已經敲除抗性的菌株。實施例2
本實施例說明構建表達外源丙酮酸羧化激酶的表達質粒，得到菌株coli BA103，如圖4所示的原理構建。I、構建pTrc99auc質粒,其過程包括
(I)合成帶有AfcoI和AiI酶切位點的引物，
上游引物5’ - CATGCCATGGTCAGCTGATGAGAAACGTCGAGAAG -3’ ；
下游引物5’ _ AAAACTGCAGGGTCATCTCTTCAAAGCCAAAACGA-3’。Lactococcus lactis cremoris NZ9000基因組DNA為模板,PCR擴增目的基因片段，反應條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，53°C 45 s，72°C 300 s, 35個循環)；72°C， 10 min。純化擴增出的/7_^基因后，表達質粒用？1'1^99&分別用價01和/ >^1雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-/7_Fc。PCR擴增得到的產物片段如圖5瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖所示。使用單酶切重組質粒pTrc99a-/ _Fc,得到8185bp的片段,結果見圖6,酶切結果表明重組質粒pTrc99a-/ _Fc構建成功。
2、將質粒pTrc99auc導入同時缺乏的感受態菌株,獲得的陽性轉化子即為本發明的新構建菌株coli BA103。實施例3
本實施例說明在大腸桿菌NZNlll中敲除葡萄糖專性轉運系統中的基因并導入質粒pTrc99a-/7_Fc后，能夠高效利用葡萄糖，同時主要的產物是丁二酸，無甲酸和乳酸的積累，而且大幅度地減少了副產物丙酮酸的生成。將大腸埃希氏菌BA103按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發酵培養基中有氧培養，當有氧培養菌體OD6tltl至O. 4 O. 6用O. 5 mM的IPTG誘導至0D6(I(I=3時，按3倍菌泥接種量轉接至厭氧階段發酵培養基中厭氧發酵48h。有氧階段培養基為LB+ Amp +Chl+Kna (氨節青霉素、氯霉素、卡那霉素各50 μ g/ mL) ο厭氧血清瓶發酵用培養基為LB+葡萄糖(20g/L) +堿式碳酸鎂0.48g + Amp +Chl+Kna(氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素各50 μ g/mL) +0. 5mM IPTG。厭氧血清瓶培養后各種參數的測定結果見表I。
權利要求
1.一株產丁二酸基因工程菌菌株,其分類命名為大腸埃希氏菌coli) BA103，其保藏編號為 CCTCC NO M 2012032。
2.權利要求I所述的產丁二酸基因工程菌菌株大腸埃希氏菌BA103的構建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發菌株， 利用同源重組技術敲除基因后，再過量表達丙酮酸羧化酶，得到能夠利用葡萄糖產丁二酸的大腸埃希氏菌BA103。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于具體包括以下步驟Cl)以缺乏基因，/7/7沒基因活性的菌株為出發菌株，敲除其中的葡萄糖專性轉運系統中的基因，得到同時缺乏IdhA ,pflB和ptsG的感受態菌株；(2)合成一對5’端帶有酶切位點的引物，純化擴增出的基因后，表達質粒pTrc99a 用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-/ _Fc ；(3)將步驟(2)所述的重組質粒pTrc99a-/7_Fc導入步驟(I)得到的感受態菌株，獲得陽性轉化子；(4)利用步驟(3)的陽性轉化子表達丙酮酸羧化酶，得到可利用葡萄糖代謝產丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA103。
4.利用權利要求I所述的大腸埃希氏菌BA103發酵生產丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發酵產酸。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于具體步驟是將大腸埃希氏菌BA103按體積比1%接種量接種入有氧階段發酵培養基中有氧培養，當有氧培養菌體0D_至O. 4 O. 6 用O. 5 mM的IPTG誘導至0D_=3時，按3倍菌泥接種量轉接至厭氧階段發酵培養基中厭氧發酵。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，涉及一株產丁二酸基因工程菌及其發酵生產丁二酸的方法。具體是高效利用葡萄糖產丁二酸基因工程菌株EscherichiacoliBA103菌株及其構建方法及其產丁二酸的方法。通過表達外源丙酮酸羧化酶，使重組大腸桿菌能夠利用葡萄糖代謝生長，大幅度提高丁二酸的得率及生產強度，減少副產物丙酮酸的生成。
文檔編號C12N1/21GK102604880SQ20121009671
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者劉嶸明, 姜岷, 張常青, 梁麗亞, 茍冬梅, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請人:南京工業大學