專利名稱：微生物發酵生產低溫果膠酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫果膠酶微生物發酵生產方法。該發明生產的低溫果膠酶主要應用于食品加工、飼料、造紙與紡織、以及其它果膠酶應用行業。可以顯著提高生產率、降低成本、縮短生產周期，改善并提高產品質量。
背景技術：
果膠酶(pectinases)是指能協同分解果膠的一組酶的總稱。主要包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠裂解酶(PL)和果膠酯酶(PE)等(裘紀瑩，中國食品添加劑，2009)。果 膠酶作為生物酶制劑，已經廣泛應用于食品工業、飼料工業、造紙業和紡織工業中，但目前使用的微生物發酵生產的果膠酶主要為中溫果膠酶。雖然國內對果微生物發酵生產的果膠酶的研究有30多年，但主要是研究中溫果膠酶；有關微生物發酵生產的低溫果膠酶的研究是起步階段，主要是菌種選育和發酵條件優化、生長特性和酶學性質、酶的分離純化以及工程菌構建(陳姍姍，廣西農業生物科學，2007 ;李祖明，工業微生物，2008 ;姜曉雷，中國釀造，2009)。我國微生物發酵生產的低溫果膠酶產業化、規模化生產及應用還未見報道。微生物發酵生產的低溫果膠酶與高溫、中溫果膠酶相比具有很大的應用優勢，因為低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節能方面有相當大的優勢；經過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產品的品質(王偉，食品工業科技，2011)，這將有助于微生物發酵生產的低溫果膠酶的推廣和使用。微生物發酵生產的低溫果膠酶的應用將對傳統的農業、食品、醫藥、化工、能源和環保等領域產生深遠的影響。近年來，隨著我國國家政策和產業結構的調整，果汁和果酒行業得到迅猛發展。農產品加工業“十一五”發展規劃指出在加工布局上，原料主產區建立濃縮加工廠，發展濃縮果蔬汁、果蔬漿等半成品；遼寧、山東、陜西等地發展濃縮蘋果汁，果膠酶作為果汁加工的重要酶制劑，市場需求量巨大。微生物發酵生產的低溫果膠酶將為人類擺脫生存和發展中所面臨的諸如資源、能源危機以及環境污染等困境提供現實的機遇。微生物發酵生產的低溫果膠酶具有非常廣闊的開發潛力和應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產低溫果膠酶的方法，該方法主要微生物經過低溫馴化后，在10 16°C液體發酵生產低溫果膠酶的方法，這種生產方法獲得的低溫果膠酶粗酶液活性可以達到200U/mL，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。在飼料中添加500mg/kg果膠酶制劑，能防止果膠類物質引起的雛雞生產性能下降，并降低肝脂肪和血清膽固醇的質量濃度，顯著提高21日齡肉雞的平均日增質量和采食量，并提高飼料的轉化率，降低了生產成本，改善并提高產品質量。該酶制劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發明所述的一種微生物發酵生產低溫果膠酶的方法具體包括以下步驟
(I)將產生果膠酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化后的果膠酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫果膠酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。果膠酶產生菌(例如，CGMCC菌種編號1. 229)，菌株先活化、定向馴化后，按本發明產酶條件發酵生產低溫果膠酶，低溫馴化后的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
I.0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基蛋白胨8.0 12. 0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果膠2.0 6. 0g, NaCl 5. 0 15. Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養基牛肉膏2.0 5. 0g，蛋白胨7.0 12. 0g，NaCl 3. 0 6. 0g，自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基蛋白胨6. 0 9. Og,酵母膏2. 0 4. Og,果膠2. 0 8. Og,NaCl 2. 0 10. 0g，MgSO4 7H20 I. 6 2. 2g，自來水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌20mino(2)將產生果膠酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的果膠酶產生菌在10 16°C培養48 72h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積3 5%的接種量接入10L的產酶培養基中，在10 12°C培養120 144h時，即微生物發酵生產低溫果膠酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫果膠酶制劑。實施例二 (I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基蛋白胨8.0 12. 0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果膠2. 0 6. 0g, NaCl 5. 0 15. Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養基牛肉膏2. 0 5. 0g，蛋白胨7. 0 12. 0g, NaCl 3. 0 6. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基蛋白胨6. 0 9. Og,酵母膏2. 0 4. Og,果膠2. 0 8. Og, NaCl 2. 0 10. 0g，MgSO4 7H20 I. 6 2. 2g，自來水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌20mino(2)將產生果膠酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化后的果膠酶產生菌在10 16°C培養48 72h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積5 7%的接種量接入50L的產酶培養基中，在12 14°C培養96 120h時，即微生物發酵生產低溫果膠酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫果膠酶制劑。實施例三(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. OgjNaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養基蛋白胨8.0 12. 0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果膠2. 0
6.0g, NaCl 5. 0 15. Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養基牛肉膏2. 0 5. 0g，蛋白胨7. 0 12. 0g, NaCl 3. 0 6. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基蛋白胨6. 0 9. Og,酵母膏2. 0 4. Og,果膠2. 0 8. Og,NaCl 2. 0 10. 0g，MgSO4 7H20 I. 6 2. 2g，自來水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌20mino(2)將產生果膠酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好；
(4)按常規方法將低溫馴化后的果膠酶產生菌在10 16°C培養48 72h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發酵液體積7 9%的接種量接入100L的產酶培養基中，在14 16°C培養72 96h時，即微生物發酵生產低溫果膠酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫果膠酶制劑。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫果膠酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產生果膠酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環境中生長良好； (2)按常規方法將低溫馴化后的果膠酶產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫果膠酶結束； (4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(5)之后進一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、發酵產酶培養基分別為 (1)菌種低溫馴化培養基蛋白胨8.0 12.0g，牛肉膏3.0 7. 0g，果膠2.0 6. Og,NaCl 5. 0 15. Og,瓊脂20g,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(2)液體種子培養基牛肉膏2.0 5.0g，蛋白胨7.0 12. 0g，NaCl 3. 0 6. 0g，自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基蛋白胨6.0 9. 0g，酵母膏2. 0 4. Og,果膠2. 0 8. 0g, NaCl.2.0 10. 0g，MgSO4WH2O 1.6 2.2g，自來水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 20min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫果膠酶的方法是將產生果膠酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化后的果膠酶產生菌在10～16℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫果膠酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/26GK102653744SQ20121010957
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者于爽, 張慶芳, 王春雨, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉 申請人:大連大學