專利名稱：一種低聚半乳糖的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種低聚半乳糖的制備方法，特別是ー種利用固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖的方法。
背景技術：
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide, G0S)是ー類天然存在于動物母乳中的功能性低聚糖，具有出色的保水力和極強的酸熱穩(wěn)定性，不能被人小腸消化吸收，但可被結腸菌群發(fā)酵，能促進雙歧桿菌増殖，抑制有害病原菌和腐敗菌生長，促進鈣、鎂、鉀的吸收，有利于B族維生素、煙酸和葉酸的生成，能有效刺激腸道蠕動，減少和防止便秘的發(fā)生，降低結腸中有毒物質的含量等調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、促進腸道健康的作用。低聚半乳糖是以乳糖為原料經(jīng)β -半乳糖苷酶(EC3. 2. I. 23)催化制得，是在乳糖 分子中的低聚半乳糖基上以β (I —2)鍵或β (I —3)、β (I —4)鍵、β (I —6)鍵連接I 4個半乳糖分子的寡糖類混合物。目前通常使用游離細胞或游離β-半乳糖苷酶酶來生產(chǎn)低聚半乳糖。在生產(chǎn)過程中，產(chǎn)品會引入游離細胞或蛋白質等雜質，需要增加復雜的提純エ藝，不利于清潔生產(chǎn)。為了解決此問題，已研究出將細胞進行固定化，并利用固定化的細胞生產(chǎn)低聚半乳糖的方法。該方法能簡化生產(chǎn)エ藝，含β_半乳糖苷酶的固定化細胞可以重復利用，節(jié)省了生產(chǎn)成本。固定化細胞常采用海藻酸鈣包埋法，在利用固定化細胞轉化乳糖的過程中，由于溫度較高且海藻酸鈣機械強度差，導致固定化細胞容易破碎，從而引入糖漿中，造成糖漿在后續(xù)過濾エ序中容易堵塞過濾裝置，使過濾壓力升高較快。另外，目前用于生產(chǎn)β -半乳糖苷酶的菌種有脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)等微生物。其中，脆壁克魯維酵母所產(chǎn)的β_半乳糖苷酶為胞內(nèi)酶，乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉等所產(chǎn)的β_半乳糖苷酶為胞外酶。胞內(nèi)β_半乳糖苷酶的獲取需要進行破碎菌體、分離提純等步驟，這增加了生產(chǎn)環(huán)節(jié)和生產(chǎn)設備，同時耗能也増加。若菌株直接將半乳糖苷酶分泌到胞外，則大大方便了酶的分離和利用，并且節(jié)省生產(chǎn)成本。已知環(huán)狀芽孢桿菌所產(chǎn)的半乳糖苷酶為胞外酶，并具有耐高溫的性質，但是利用環(huán)狀芽孢桿菌生產(chǎn)β_半乳糖苷酶的報道很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的在于提供一種低聚半乳糖的制備方法，利用該方法能夠獲得較高的低聚半乳糖得率。本發(fā)明的另ー個目的在于提供ー種固定化β -半乳糖苷酶的制備方法，利用該方法制備的固定化酶具有機械強度高、物化性能穩(wěn)定等優(yōu)點，能夠有效解決采用海藻酸鈣包埋法制備的固定化細胞或固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖的過濾エ序中過濾壓力上升較快的問題。
本發(fā)明的又ー個目的在于提供ー種利用環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulars)生產(chǎn)β_半乳糖苷酶的方法，該方法能夠顯著提高β_半乳糖苷酶的產(chǎn)量。本發(fā)明所采用的技術方案是一種低聚半乳糖的制備方法，包括以下步驟(I)使用戊ニ醛在15-35°C下與大孔弱堿苯こ烯樹脂在攪拌下反應16_24h，使樹脂活化；(2)取液體半乳糖苷酶與步驟(I)所得的活化的大孔弱堿苯こ烯樹脂在15-35°C下攪拌反應16-24h，得到固定化的β -半乳糖苷酶；(3)將固定化的半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48_52°C攪拌反應24_36h。優(yōu)選地，步驟(2)所述的β -半乳糖苷酶在使用前經(jīng)鹽析進行提純。優(yōu)選地，步驟(2)中β -半乳糖苷酶與大孔弱堿苯こ烯樹脂的配比為100_200U/g樹脂；步驟(3)中所加入的乳糖濃度為45%-52% (w/w)，并按照每千克乳糖(按干基計)加入6000-10000U的固定化β -半乳糖苷酶。優(yōu)選地，步驟(2)中所述β -半乳糖苷酶由環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生。優(yōu)選地，步驟(2)中所述半乳糖苷酶經(jīng)以下步驟制備Α.將保存的環(huán)狀芽孢桿菌接種至LB固體培養(yǎng)基，于36_38°C下培養(yǎng)16_24h，使菌種活化；B.取活化的菌種接種至20_50ml的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)46h后接種至裝有LB培養(yǎng)基的種子罐中，于36-38°C下培養(yǎng)4-6h，得到種子培養(yǎng)液； C.將種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)36_48h，得到環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵液；D.將發(fā)酵液經(jīng)微濾或離心除去菌體，再將所得酶液濃縮，得到液體半乳糖苷酶。優(yōu)選地，上述環(huán)狀芽孢桿菌為環(huán)狀芽孢桿菌ATCC No. 31382。優(yōu)選地，步驟C所述培養(yǎng)的方式為將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)16_24h后，以補料量4-6g ·じ1以及補料速度為O. 4-0. 6g ·じ1 · h-1的方式補加乳糖，繼續(xù)發(fā)酵20-28h。優(yōu)選地,步驟C所述發(fā)酵培養(yǎng)基為乳糖5_15g/L、半乳糖5-10g/L、大豆蛋白胨10-30g/L、玉米浸提液4-6g/L、酵母提取物2-4g/L、磷酸氫ニ銨2_4g/L、碳酸鈉l_2g/L、大豆油 8-15g/L、消泡劑 O. 5-2g/L。優(yōu)選地，步驟C中所述培養(yǎng)的條件為溫度36_38°C、pH6. 8-7. 5、溶氧彡30%、通氣量 O. 5-2V · Ti · mirT1、攪拌速度 120_220rpm。ー種由上述方法制備得到的低聚半乳糖，包括漿狀產(chǎn)品和粉狀產(chǎn)品。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用固定化β_半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖，固定化所采用的樹脂機械強度高、物化性能穩(wěn)定，在乳糖的轉化過程中不會發(fā)生變化，也不容易破碎，因而不會堵塞過濾裝置，能夠使壓力保持穩(wěn)定，克服固定化細胞所帶來壓力上升較快的問題。生產(chǎn)過程中所用的固定化酶可以回收重復使用，其使用效率比游離的β_半乳糖苷酶要高得多，具有適合エ業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的特點。本發(fā)明制備低聚半乳糖的生產(chǎn)エ藝簡單易行，操作便利，可滿足エ業(yè)化大生產(chǎn)的要求，低聚半乳糖的得率> 57%。本發(fā)明采用環(huán)狀芽孢桿菌生產(chǎn)半乳糖苷酶，由于環(huán)狀芽孢桿菌所產(chǎn)的半乳糖苷酶為胞外酶，因此后續(xù)的酶的分離純化過程大為簡化，從而節(jié)省了分離純化的設備和成本。同時，該菌種所產(chǎn)的β -半乳糖苷酶具有耐高溫的性質，因此，生產(chǎn)低聚半乳糖的過程可以在較高溫度下進行，由此帶來至少以下好處第一，在高溫下反應可減少微生物的污染；第二，高溫下乳糖的溶解度更高，越高的乳糖初始濃度低聚半乳糖的得率就越高；第三，β -半乳糖苷酶在低溫、低乳糖濃度下一般表現(xiàn)為水解乳糖的活性，合成的低聚半乳糖較少。另外，本發(fā)明對環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶的發(fā)酵方式、培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了改進，使β-半乳糖苷酶的產(chǎn)酶能力得到了一定的提高。
具體實施例方式以下實施方式中使用的產(chǎn)半乳糖苷酶的菌株環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)購自美國菌種保藏中心(ATCC)，編號為31382。但本發(fā)明所用的菌株不限于環(huán)狀芽孢桿菌ATCC No. 31382，其它環(huán)狀芽孢桿菌也適用于本發(fā)明。以下對描述本發(fā)明的幾個概念進行說明。
游離β -半乳糖苷酶酶活測定在ImL含有濃度為4mg/mL的ONPG O. IM磷酸緩沖液中(pH 6. O)加入ImL β -半乳糖苷酶酶液，在50°C反應lOmin，加入2mL10%碳酸鈉溶液終止反應，通過測定產(chǎn)物中鄰硝基酚含量計算鄰硝基酚半乳糖苷(ONPG)的水解量。在該條件下每分鐘水解I μ M ONPG所需的酶量定義為ー個酶活單位(U)。低聚半乳糖的含量測定參照AOAC Official Method 2001. 02《Determinationof trans-Galacto-oligosaccharides (TGOb； m Selected Food Products〉〉。本發(fā)明提供了一種低聚半乳糖的制備方法，包括以下步驟(I)使用戊ニ醛在15-35°C下與大孔弱堿苯こ烯樹脂在攪拌下反應16_24h，使樹脂活化；(2)取液體半乳糖苷酶與步驟(I)所得的活化的大孔弱堿苯こ烯樹脂在15-35°C下攪拌反應16-24h，得到固定化的β -半乳糖苷酶；(3)將固定化的半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48_52°C攪拌反應24_36h。本發(fā)明還提供了一種低聚半乳糖的制備方法，其步驟包括液體β_半乳糖苷酶的制備、固定化半乳糖苷酶的制備和固定化半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖三部分。以下針對每個部分進行說明。I.液體半乳糖苷酶的制備以環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulars)為出發(fā)菌種，經(jīng)活化、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵、除菌體、濃縮得到液體β_半乳糖苷酶，具體步驟如下I)菌種活化將甘油保存的環(huán)狀芽孢桿菌接種到裝有LB固體培養(yǎng)基的平板中，36 38°C培養(yǎng)16 24小時，得到活化環(huán)狀芽孢桿菌。2)種子罐培養(yǎng)挑取一至ニ環(huán)活化后菌種接種到裝有2(T50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)4飛小時后，再按f3% (v/v)的接種量接入裝有LB培養(yǎng)基的種子罐中，于36 38°C、溶氧彡30%、通氣量0. 5 2V. T1 · mirT1、攪拌速度12(T400rpm培養(yǎng)4 6小時，得到種子罐培養(yǎng)液。3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐培養(yǎng)液按f 3% (v/v)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)16 20小時后,按補料量為5g.じ1,補料速度0. 5g.じ1. IT1的方式補加乳糖至發(fā)酵罐，繼續(xù)發(fā)酵2(Γ28小時后，得到環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵液。其中，發(fā)酵用培養(yǎng)基包括以下幾種物質乳糖5 15g/L、半乳糖5 10g/L、大豆蛋白胨l(T30g/L、玉米浸提液4飛g/L、酵母提取物2 4g/L、磷酸氫ニ銨2 4g/L、碳酸鈉f 2g/L、大豆油8 15g/L、消泡劑O. 5^2g/し其培養(yǎng)條件是在36°C 38°C、pH7. 0 7. 5、溶氧彡30%、通氣量O. 5 2V. V' mirT1、攪拌速度120 220rpm。4)除菌體、濃縮酶液將發(fā)酵液經(jīng)微濾或離心去除菌體，再用低溫真空濃縮或超濾濃縮方法濃縮酶液，得到酶活為8(Tl20U/mL的液體β -半乳糖苷酶。2.固定化半乳糖苷酶的制備將游離的β -半乳糖苷酶用固定化工藝制成一定形狀的固定化酶。固定化β_半乳糖苷酶的制備是將液體β_半乳糖苷酶經(jīng)硫酸銨鹽析初步提純，然后用化學偶聯(lián)法與樹脂交聯(lián)，所述硫酸銨鹽析過程中硫酸銨使用終濃度為25 30%，固液分離可以采用離心或O. 2^1 μ m孔徑的濾紙板加壓過濾；所用的樹脂是大孔弱堿苯こ烯樹脂；所用交聯(lián)劑是戊ニ醛。固定化方式是先活化樹脂，再與酶進行吸附交聯(lián)。樹脂活化條件是戊ニ醛使用終濃度為O. 5^1. 5%，溫度為15 35°C，轉速為5(Tl00rpm，反應時間為16 24小吋。酶固定化條件是酶與樹脂的配比是每克大孔弱堿苯こ烯樹脂所需酶量為10(T200U，溫度為15 35°C，轉速為5(Tl00rpm，反應時間為16 24小時。3.固定化β-半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖用固定化β_半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖所采用的分批反應法是在反應罐中加入45 52%(w/w)的乳糖溶液，按每千克乳糖(干基算)加入600(Tl0000U酶量的固定化β-半乳糖苷酶，控制溫度在48 52°C，攪拌轉速在5(Tl00rpm的條件反應24 36小時，反應完成后，回收固定化酶，用于下ー批原料的生產(chǎn)，反應液經(jīng)過濾、真空濃縮得到低聚半乳糖含量為57%以上的低聚半乳糖糖漿，或者將濃縮的糖漿進一歩干燥、添加輔料、干燥得到粉狀低聚半乳糖。以下結合實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。實施例I β -半乳糖苷酶的制備I、菌種活化將甘油管保存的環(huán)狀芽孢桿菌接種至LB固體培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)18h。2、種子液培養(yǎng)將環(huán)狀芽孢桿菌經(jīng)LB平板活化后，挑取一環(huán)菌種接種到裝有25mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)4小吋，然后轉接到裝有2. 5L LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于37°C、攪拌速度12(T220rpm、通氣量I. 25L/min，通過調(diào)整轉速控制溶氧彡30%培養(yǎng)4小時，得到種子培養(yǎng)液。3、發(fā)酵培養(yǎng)I)預發(fā)酵將種子培養(yǎng)液接種到裝有乳糖1250g、半乳糖2000g、大豆蛋白胨4000g、玉米浸提液1300g、酵母提取物650g、磷酸氫ニ銨650g、碳酸鈉325g、大豆油2275g、消泡劑125g、水250kg的500L發(fā)酵罐中，于37°C下，攪拌速度12(T220rpm、通氣量125L/min，通過調(diào)整轉速控制溶氧> 30%用鹽酸調(diào)節(jié)pH值在7. 4，發(fā)酵培養(yǎng)18小時。其中培養(yǎng)基的各種成分包括大豆蛋白胨、玉米浸提液和酵母提取物等均可從市面購買。并且，消泡劑可使用聚醚類、聚醚改性硅消泡劑等。2)補料發(fā)酵階段在步驟I)的發(fā)酵體系中開始按20mL/min流加12. 5%的乳糖溶液10し開始補料后，每隔2h取樣發(fā)酵液測定β-半乳糖苷酶酶活，待酶活停止上升后停止發(fā)酵。4、粗酶液制備取上述發(fā)酵液，在4 °C下，IOOOOrpm離心IOmin,收集中部酶液，將酶液在-O. 0Γ-0. 009MPa條件下蒸發(fā)濃縮，得到酶活力為115U/mL的β -半乳糖苷酶粗酶液。實施例2 β -半乳糖苷酶的固定化按照以下步驟制備固定化β -半乳糖苷酶I、粗酶的精制取實施例I濃縮獲得的酶液IOOmL,向其中緩慢添加硫酸銨43. 6g，待硫酸銨完全溶解后，于4°C靜置2小時后，在4°C下，IOOOOrpm離心IOmin收集沉淀，然后用IOOmL pH6. O磷酸緩沖液溶解沉淀，得到酶活力為100U/mL β-半乳糖苷酶精制液。2、酶的固定化(I)稱取大孔弱堿苯こ烯樹脂A103sl00g，用去離子水清洗2 3遍后，加入去離子水2000mL，再加入40mL 50%的戊ニ醛溶液，30°C攪拌16h，過濾，然后用去離子水清洗樹脂，過濾晾干水分即得活化樹脂。(2)在活化樹脂中加入含有IOOmL的β -半乳糖苷酶精制液，于30°C搖床振蕩16小時，過濾，然后用去離子水清洗樹脂，過濾晾干水分得到酶活力為85U/g的固定化β-半乳糖苷酶100g。
實施例3固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖在5L反應罐中加入質量濃度為50%的乳糖溶液2000g，加入實施例2的固定化酶80g，于50°C、80rpm條件下轉化24小時后，采用濾袋收集固定化酶，分離到的糖漿經(jīng)過濾、真空濃縮器濃縮得到低聚半乳糖含量為57. 6%的Brix為76的糖漿。實施例4 β -半乳糖苷酶的制備I、菌種活化將甘油管保存的環(huán)狀芽孢桿菌接種至LB固體培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)18h。2、種子液培養(yǎng)將環(huán)狀芽孢桿菌經(jīng)LB平板活化后，挑取ニ環(huán)菌種分別接種到2瓶裝有50mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)4小吋，然后轉接到裝有10L LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于37°C、攪拌速度12(T220rpm、通氣量5L/min，通過調(diào)整轉速控制溶氧^ 30%培養(yǎng)4小時，得到種子培養(yǎng)液。3、發(fā)酵培養(yǎng)I)預發(fā)酵將種子培養(yǎng)液接種到裝有乳糖5kg、半乳糖8kg、大豆蛋白胨16kg、玉米浸提液5. 2kg、酵母提取物2. 6kg、磷酸氫ニ銨2. 6kg、碳酸鈉I. 3kg、大豆油9. 1kg、消泡劑0. 5kg、水1000kg的2000L發(fā)酵罐中，于37°C下，攪拌速度12(T220rpm、通氣量500L/min，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至7. 4，發(fā)酵培養(yǎng)18小吋。2)補料發(fā)酵階段在I)發(fā)酵體系中開始按25mL/min流加20%的乳糖溶液25し開始補料后，每隔2h取樣發(fā)酵液測定β -半乳糖苷酶酶活，待酶活停止上升后停止發(fā)酵。3、粗酶液制備將上述發(fā)酵液在30°C以下、進膜壓カ為0. 3^0. 4MPa條件下，用0. 5μπι孔徑的陶瓷膜進行循環(huán)錯流過濾除去菌體，在此過程中適量添加水將酶洗出，最終得到澄清酶液。然后將澄清酶液在30°C以下、進膜壓カ為O. 25、. 3MPa條件下，用截留分子量為IOKD的卷式膜超濾濃縮，得到酶活為98. 5U/mL的粗酶液。實施例5 β -半乳糖苷酶的固定化按照以下步驟制備固定化β -半乳糖苷酶I、半乳糖苷酶的精制取實施例4制備的粗酶液200L添加87. 2kg硫酸銨，室溫攪拌至硫酸銨完全溶解后，靜置2小時后，用O. 2 μ m孔徑的澄清紙板加壓過濾截留沉淀，然后用200LPH6. O的磷酸緩沖液將沉淀循環(huán)清洗下來，即得酶活力為85U/mL β -半乳糖苷酶精制液。2、固定化β-半乳糖苷酶的制備
稱取大孔弱堿苯こ烯樹脂A103s 150kg，用去離子水清洗2 3遍后，加入去離子水至3000L，再加入60L濃度為50%的戊ニ醛溶液，于15°C、80rpm攪拌24小吋，過濾，然后用去離子水清洗樹脂去除殘余戊ニ醛，離心甩干即得活化樹脂。將活化樹脂加入到200L步驟I制備的β_半乳糖苷酶精制液中，于15°C、80rpm攪拌24小時，過濾，然后用去離子水清洗樹脂，離心甩干水分，即得酶活力為100U/g的固定化β-半乳糖苷酶150kg。實施例6固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖在4m3罐中加入質量濃度為50%的乳糖溶液3500kg，加入實施例5制備的固定化酶150kg,于48 °C、80rpm條件下轉化36小時,采用酶過濾器回收固定化酶，分離到的糖衆(zhòng)進一步過濾、真空濃縮器濃縮得到低聚半乳糖含量為57. 4%的Brix為75的糖漿。實施例7固定化細胞與固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖的比較I、固定化細胞生產(chǎn)低聚半乳糖在8m3罐中加入質量濃度為50%的乳糖溶液6000kg，加入專利CN201110049829. 7方法制備的固定化細胞，于60°C、80rpm條件下轉化20小時，采用酶過濾器回收固定化細胞，分離到的糖漿進一歩經(jīng)過濾面積為5 Hf板框過濾機加壓過濾，得到澄清糖漿再進行脫鹽脫色、旋轉真空蒸發(fā)濃縮得到低聚半乳糖。2、固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖按照本發(fā)明方法，在8m3罐中加入質量濃度為50%的乳糖溶液6000kg，加入本發(fā)明所述固定化酶，于50°C、80rpm條件下轉化24小時，采用酶過濾器回收固定化酶，分離到的糖漿進一歩經(jīng)過濾面積為5 Hf板框過濾機加壓過濾，得到澄清糖漿再進行脫鹽脫色、旋轉真空蒸發(fā)濃縮得到低聚半乳糖。上述兩種方式生產(chǎn)低聚半乳糖過程中板框過濾效果如下
權利要求
1.一種低聚半乳糖的制備方法，包括以下步驟 (1)使用戊二醛在15-35°C下與大孔弱堿苯乙烯樹脂在攪拌下反應16-24h，使樹脂活化； (2)取液體￠-半乳糖苷酶與步驟(I)所得的活化的大孔弱堿苯乙烯樹脂在15-35°C下攪拌反應16-24h，得到固定化的P -半乳糖苷酶； (3)將固定化的P-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52°C攪拌反應24-36h。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟(2)所述的￠-半乳糖苷酶在使用前經(jīng)鹽析進行提純。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟(2)中￠-半乳糖苷酶與大孔弱堿苯乙烯樹脂的配比為100-200U/g樹脂；步驟(3)中所加入的乳糖濃度為45%-52% (w/w),并按照每千克乳糖(按干基計)加入6000-10000U固定化P -半乳糖苷酶。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟(2)中所述￠-半乳糖苷酶由環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟(2)中所述￠-半乳糖苷酶經(jīng)以下步驟制備 A.將保存的環(huán)狀芽孢桿菌接種至LB固體培養(yǎng)基，于36-38°C下培養(yǎng)16_24h，使菌種活化； B.取活化的菌種接種至20-50ml的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)4_6h后接種至裝有LB培養(yǎng)基的種子罐中，于36-38°C下培養(yǎng)4-6h,得到種子培養(yǎng)液； C.將種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)36-48h，得到環(huán)狀芽孢桿菌發(fā)酵液； D.將發(fā)酵液經(jīng)微濾或離心除去菌體，再將所得酶液濃縮，得到液體3-半乳糖苷酶。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟C所述培養(yǎng)的方式為將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)16_20h后，補加乳糖，繼續(xù)發(fā)酵20-28h。
7.根據(jù)權利要求5所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中所述環(huán)狀芽孢桿菌為環(huán)狀芽孢桿菌 ATCC No. 31382。
8.根據(jù)權利要求5所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中所述補加乳糖的方式為補料量4飛g L—1，補料速度為0. 4^0. 6g L—1 h'
9.根據(jù)權利要求5所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟C所述發(fā)酵培養(yǎng)基為乳糖5-15g/L、半乳糖5-10g/L、大豆蛋白胨10-30g/L、玉米浸提液4_6g/L、酵母提取物2-4g/L、磷酸二氫銨2-4g/L、碳酸鈉l_2g/L、大豆油8_15g/L、消泡劑0. 5_2g/L。
10.根據(jù)權利要求5所述的一種低聚半乳糖的制備方法，其中步驟C中所述培養(yǎng)的條件為溫度 36-38°C、pH6. 8-7. 5、溶氧彡 30%、通氣量0. 5-2V ^T1 .min'攪拌速度 120_220rpm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低聚半乳糖的制備方法，包括(1)使用戊二醛在15-35℃下與大孔弱堿苯乙烯樹脂在攪拌下反應16-24h，使樹脂活化；(2)取液體β-半乳糖苷酶與步驟(1)所得的活化的大孔弱堿苯乙烯樹脂在15-35℃下攪拌反應16-24h，得到固定化的β-半乳糖苷酶；(3)將固定化的β-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52℃攪拌反應24-36h。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)低聚半乳糖能使糖漿過濾工藝中過濾壓力保持穩(wěn)定，提高低聚半乳糖的得率，既降低了能耗，又能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
文檔編號C12N11/08GK102676614SQ20121017297
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權日2012年5月29日
發(fā)明者曾憲綱, 曾憲經(jīng), 肖桂秋, 陳子健, 陳振鵬 申請人:江門量子高科生物股份有限公司