專利名稱：酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法及所得寡聚透明質酸鹽和其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶切法制備寡聚透明質酸鹽的エ藝過程，特別是涉及應用芽孢桿菌來源的透明質酸酶降解透明質酸或其鹽制備寡聚透明質酸鹽的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
透明質酸(hyaluronic acid, HA)是ー種酸性黏多糖，由N-こ酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復單位通過β - (I — 4)糖苷鍵和β - (I — 3)糖苷鍵構成的無分支高分子糖胺聚糖，存在于動物組織細胞間質和某些細菌的夾膜中。透明質酸廣泛用于醫藥、化妝品、食品等領域，分子量一般為IO5 IO7Da(道爾頓)。寡聚透明質酸是指分子量小于IOkDa的透明質酸。研究表明，分子量對透明質酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質酸甚至表 現出截然相反的活性(郭學平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜志，2003，24 (3)148-150)。目前，透明質酸降解的方法主要有物理降解、化學降解、生物降解三大類，物理降解法很難將透明質酸降至IOkDa以下，化學降解法和酶法可以制備寡聚透明質酸，但化學降解法制備寡聚透明質酸，需要較劇烈的反應條件(如較高的酸堿濃度等)才能達到最大程度的降解。此時，不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖(葡糖醛酸和こ酰氨基葡糖)殘基的結構也遭到破壞，如こ酰基被水解掉，單糖六元環斷裂等，對制得的寡聚透明質酸的生物活性產生一定影響(郭學平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜志，2003,24 (3):148-150)。化學降解法制備的寡聚透明質酸還容易發生褐變(專利申請號201110008110. 9)，生產過程會污染環境。而酶解法降解透明質酸時，只斷裂單糖分子間的糖苷鍵，不會對其他結構造成破壞，而且酶解法反應條件溫和，不用強酸強堿，制備的寡聚透明質酸不會發生褐變，不會造成環境污染，因此酶解法最適合制備寡聚透明質酸。降解透明質酸所用的酶主要是透明質酸酶，根據作用機制的不同，可以分為3類
(I)內切-β_Ν-こ酰氨基葡糖苷酶，為水解酶，作用于β_1，4糖苷鍵，終產物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉糖苷酶活性。哺乳動物來源的以及動物毒液來源的屬于此類。(2)水蛭、十二指腸蟲來源的透明質酸酶，為內切-β_葡糖苷酸酶，作用于β-1,3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產物是四糖，特異性降解透明質酸；(3)細菌透明質酸酶，也稱為透明質酸裂解酶(hyaluronate lyase),作用于β_1，4糖苷鍵,通過β -消去機制得到4，5_不飽和雙糖(Kreil, G, Hyaluronidases—a group of neglected enzymes,Protein Sci, 1995， 4(9): 1666-1669)。目前エ業生產寡聚透明質酸或其鹽的方法是化學降解法，由于含透明質酸酶的動物組織來源有限，有文獻報道的微生物來源透明質酸酶發酵液単位酶活較低，不可能大規模制備透明質酸酶，也就不可能用酶法大規模生產寡聚透明質酸或其鹽
發明內容
本發明的目的是提供一種酶切法大規模生產寡聚透明質酸鹽的方法，本發明采用芽孢桿菌發酵得到的透明質酸酶對高分子量透明質酸或其鹽進行降解，酶活高、條件溫和、操作簡單、無環境污染。針對現今生物降解透明質酸或其鹽所需降解酶活性低、來源有限、成本高的缺點，發明人從空氣中分離得到了ー種產透明質酸酶的芽孢桿菌(Bacillus sp. )A50，該菌種已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，保藏號為CGMCCNO. 5744，保藏時間為2012年2月8日。該芽孢桿菌(Bacillus sp. )A50 CGMCC NO. 5744的獲取過程為將裝有富集培養基的平皿打開蓋，放置于空氣中，收集空氣中沉降菌，約I小時后，蓋上蓋，置于25 40°C培養箱中有氧培養，培養24小時后，將分離得到的單菌落接種于篩選培養基中，25 40°C，150rpm,有氧培養12 16小時,采用中國藥典方法測定透明質酸酶活力，選擇酶活力最高 的菌種作為本發明的菌種，菌種酶活力可達IO5 IU/mL。上述所采用的各培養基組成如下
富集培養基(IOOmL):蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3Η200· 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g、透明質酸鈉 0.01 ~ Ig,瓊脂粉 2g。篩選培養基(IOOmL):蛋白胨O.2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. 0g,K2HPO4 ·3Η20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g，透明質酸鈉 O. 01 Igo篩選所得的芽孢桿菌(Bacillus sp. )A50 CGMCC NO. 5744具有如下的特征
I、形態特征
菌體桿狀，單個或鏈狀。菌落乳白色，有皺褶。2、分子生物學特征
菌種A50的16S rDNA序列如SEQ NO: I所示。本發明菌種適于在25 40°C下進行有氧培養，該菌種可以用來生產透明質酸酶(SP芽孢桿菌透明質酸酶，下同)，方法是將芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC No. 5744經斜面培養、種子培養、發酵培養、離心、硫酸銨分級沉淀、超濾制得透明質酸酶。具體包括以下步驟
(1)將芽孢桿菌(Bacillus sp. )A50 CGMCC No. 5744菌種進行斜面培養，得斜面菌
種；
(2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 40°C、100 200rpm的條件下培養10 24h,得種子液；
(3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 40°C、100 300rpm的條件下培養12 24h，得透明質酸酶發酵液；
(4)離心分離發酵液，取上清液，將上清液用硫酸銨分級沉淀出透明質酸酶；
(5)將步驟(4)沉淀出來的透明質酸酶溶于磷酸鹽緩沖液中，超濾除去小分子雜質，得純化的透明質酸酶。上述生產透明質酸酶的方法中，步驟(4)中發酵液離心的轉速為10000 15000rpm,離心時間為10 20分鐘,硫酸銨分級沉淀的步驟是將上清液中加入硫酸銨，使其質量體積濃度為20%，過濾產生的沉淀，然后繼續加入硫酸銨，至其質量體積濃度為35%為止，取得到的沉淀即為透明質酸酶。這里所述的質量體積濃度的意思是每ml上清液中含有硫酸銨的質量(g)，下同。上述生產透明質酸酶的方法中，步驟(5)中磷酸鹽緩沖液的pH優選為6. 0，濃度優選為50mmol/L，在實際應用中可酌情變動，超濾所用的為超濾膜。超濾膜的截留分子量為
3X IO4Da0上述生產透明質酸酶的方法中，每IOOmL斜面培養基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. O g, K2HPO4 ·3Η20 O. 05 O. 15 g, MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖O. 5 I. 5 g，瓊脂粉2g，pH調至6. O 8. 0，斜面培養的溫度為25 40°C。上述生產透明質酸酶的方法中，每IOOmL種子培養基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. O g, K2HPO4 ·3Η20 O. 05 O. 15 g, MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖O. 5 I. 5 g, pH調至6. O 8. O。 上述生產透明質酸酶的方法中，每IOOmL發酵培養基中含有以下成分蛋白胨
O.2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. O g, K2HPO4 ·3Η20 O. 05 O. 15 g, MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖 O. 5 I. 5 g,吐溫 80 O. 05mL, pH 調至 6. O 8. O。上述生產透明質酸酶的方法中，斜面種子培養和發酵培養的接種量可以通過現有技術得到，不需付出創造性的勞動。種子培養基的接種量能夠達到發酵培養所需接種量的種子液即可，發酵培養基的接種量一般在3 15%即可。上述生產透明質酸酶的方法中，可采用鹽酸、硫酸或磷酸中的ー種或ー種以上調節斜面培養基、種子培養基和發酵培養基PH。本發明芽孢桿菌生產的透明質酸酶在發酵液中的酶活可達到IX IO5 3X IO5IU/HiL，大大高于文獻報道中的最高酶活(I. 3X102IU/mL)，且該酶熱穩定性和pH穩定性高，用其降解高分子透明質酸，用來制備寡聚透明質酸，成本顯著降低，可用于大規模生產，解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，在生化研究領域及寡聚透明質酸的生產方面有廣闊的應用前景。下面介紹以芽孢桿菌發酵得到的透明質酸酶(即芽孢桿菌透明質酸酶，下同)生物降解透明質酸或其鹽生產寡聚透明質酸鹽的方法。一種酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法，其特征是以芽孢桿菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO. 5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解，包括以下步驟
①配制透明質酸或其鹽溶液向純化水中加入分子量大于IOkDa的透明質酸或其鹽，配制成質量體積濃度為I 30%的溶液；所述質量體積濃度的意思是透明質酸或其鹽的質量/溶液的體積，單位為g/mL ；
②酶解調節步驟①中溶液的溫度為20 48°C、pH為4 9，然后向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；
③滅活將酶解液在5(T90°C下保持l(T60min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活；
④過濾向滅活后的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然后用孔徑為
O.45Mm的濾膜過濾，得濾液，每IOOml酶解液中加入O. I IOg的易溶性無機鹽；
⑤沉淀向步驟④的濾液中加入濾液體積3 20倍的醇或酮，混合均勻，析出寡聚透明質酸鹽沉淀；
⑥脫水干燥將步驟⑤中的寡聚透明質酸鹽沉淀分離出來，用有機溶劑脫水，然后真空干燥，得寡聚透明質酸鹽。上述方法中，所用的芽孢桿菌透明質酸酶即芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCCNO. 5744發酵得到的透明質酸酶比活為8 X IO6 I. 5 X 107IU/mg，酶的加入量為每kg透明質酸或其鹽配制的溶液中加入2 X IO7 5 X IO7IU的純化酶。透明質酸酶對透明質酸有很好的降解性，只要加入合適的透明質酸酶，即可以得到任意小分子量的透明質酸，因此在酶解時，控制時間的長短即可得到所需分子量的透明質酸。上述步驟①中，所述的透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽。上述步驟②中，采用酸或堿調節pH至4 9，所述酸為鹽 酸、冰こ酸、硫酸或磷酸，所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀。上述步驟④中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽，優選鈉、鉀、鈣、鋅、鎂的氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽。此外，步驟④中以濾膜過濾酶解液，濾去透明質酸酶等雜質，提高了產物的純度，所選濾膜為本領域常用的過濾膜即可，只要滿足孔徑的要求都能用于本發明，濾膜的孔徑為O. 45ΜΠ1，材質可以是纖維素酯類、聚砜類、聚酰胺類。上述步驟⑤中，所述醇或酮優選為こ醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇。上述步驟⑥中，脫水所用的有機溶劑為與水互溶的有機溶剤，將寡聚透明質酸鹽沉淀加入此有機溶劑中可以帶走沉淀中的大部分水，優選的，有機溶劑為酮或醇，最優選的為常用的こ醇、丙酮。上述步驟②中，優選的酶解溫度為35 45°C，優選的酶解pH為5. 5 7. 5。 上述方法中，所得寡聚透明質酸鹽為白色粉末或顆粒，含量大于95%，其O. 1%水溶液的pH在6 8之間，紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致，性能良好，結構未被破壞。本發明介紹了酶切法制備寡聚透明質酸鹽的エ藝，該エ藝利用芽孢桿菌產生的透明質酸酶降解透明質酸或其鹽，經過除酶、こ醇沉淀、脫水干燥而成，此法操作簡單，條件溫和，對產品結構無破壞，無環境污染，而且發酵來源的透明質酸酶成本低，適合大規模エ業化生產，制備的寡聚透明質酸鹽具有透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強等優點，可用在化妝品、食品及醫藥領域，前景廣闊。保藏信息
本發明芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50已于2012年2月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 5744。
圖I為不同方法制備的寡聚透明質酸鹽的紅外圖譜，其中a為比較例I寡聚透明質酸鹽的紅外圖譜，b為實施例8制得的寡聚透明質酸鹽的紅外圖譜，c為透明質酸鈉的歐洲藥典標準圖譜；
圖2為寡聚透明質酸鹽的透皮吸收比例 圖3寡聚透明質酸鹽的DPPH自由基清除能力 圖4寡聚透明質酸鹽的還原能力圖。
具體實施例方式 下面結合具體實施例、比較例和實驗例，進ー步詳細說明本發明。如無特別說明，下述實施例中硫酸銨的濃度為質量體積濃度。
下述實施例中，寡聚透明質酸鹽的分子量測定采用Laurent法，含量測定采用HPLC法，寡聚透明質酸與普通透明質酸都是由N-こ酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復單位構成的，因此它們的含量等于雙糖的含量，可以用芽孢桿菌透明質酸酶將寡聚透明質酸或普通透明質酸降解成雙糖，通過HPLC法測定雙糖含量，得到寡聚透明質酸鹽的含量。本發明降解透明質酸或其鹽所用的透明質酸酶(即芽孢桿菌透明質酸酶，下同)是由芽孢桿菌A50發酵得透明質酸酶發酵液，然后經離心、硫酸銨分級沉淀、超濾等步驟得到的。其制備過程是取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. )A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，25 40°C、100 200rpm下培養10 24小時，然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為3 15%，25 40°C、100 300rpm下培養12 24小時，發酵過程中用酸將PH維持在6. (Γ8. O,發酵結束得透明質酸酶發酵液，發酵液經10000 15000rpm離心10 20min得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取硫酸銨在上清液中的濃度為20% 35%時所得的透明質酸酶沉淀，溶于磷酸鹽緩沖液中，最后經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得酶解用透明質酸酶。
所用的培養基為
斜面培養基(IOOmL):蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. O g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15 g, MgSO4WH2O O. 05 O. 15 g，葡萄糖 O. 5 I. 5 g，瓊脂粉 2g，pH 調至 6. O 8. 0，水，斜面培養的溫度為25 40°C。種子培養基(IOOmL):蛋白胨0.2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2.0 g，K2HPO4 · 3H20O. 05 O. 15 g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15 g,葡萄糖 O. 5 I. 5 g, pH 調至 6. O 8. O。發酵培養基(IOOmL):蛋白胨0.2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2.0 g，K2HPO4 · 3H20O. 05 O. 15 g, MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15 g，葡萄糖 O. 5 I. 5 g，吐溫 80 0.05mL，pH 調至 6. O 8. O。采用中國藥典方法測定由以上方案制得的發酵液中的透明質酸酶活力在IXlO5- 3X 105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為8 X IO6 I. 5X 107IU/mg。下面提供幾個制備透明質酸酶的優選實施例
實施例I
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20O. 05g，葡萄糖0. 5g，瓊脂粉2g，用鹽酸將pH調至6. O。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g,MgSO4 ·7Η20 0.05g，葡萄糖0.5g，用鹽酸將pH調至6.0。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g,MgSO4 · 7H20 O. 05g,葡萄糖 0. 5g, Tween80 (吐溫 80) 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，25°C, 150rpm培養24小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，250C，200rpm培養24小時，發酵過程中用硫酸將pH維持在6. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經IOOOOrpm離心20min得上清液，將上清液中加入硫酸銨，使其濃度為20%，過濾除去產生的沉淀，然后繼續加入硫酸銨，至其濃度為35%為止，取得到的沉淀即為透明質酸酶，將得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(pH6.0，50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為I. 0X105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為8X106IU/mg。實施例2
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. lg, MgSO4 · 7H20
O.lg，葡萄糖I. 0g，瓊脂粉2g，用磷酸將pH調至7.0。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. Ig,MgSO4 · 7H20 O. Ig,葡萄糖I. Og用磷酸將pH調至7. O。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. Ig,MgSO4 · 7H20 O. lg，葡萄糖 I. 0g, Tween80 O. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種 子培養基中，30°C, IOOrpm培養15小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中,接種量為10%，350C，300rpm培養16小時，發酵過程中用硫酸將pH維持在7. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經15000rpm離心IOmin得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(PH6. O, 50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為3. OX 105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為I. 5X 107IU/mg。實施例3
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 I. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖I. 5g，瓊脂粉2g，用硫酸將pH調至8.0。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨I. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g,MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖I. 5g，用硫酸將pH調至8. O。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. lg,MgSO4 · 7H20 O. 05g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，35°C,200rpm培養13小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中,接種量為10%，40°C，IOOrpm培養12小時，發酵過程中用鹽酸將pH維持在7. 0，發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經12000rpm離心15min得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(PH6. O, 50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為
1.2X 105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為I. O X 107IU/mg。實施例4
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 2. Og,酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20
0.05g，葡萄糖I. Og,瓊脂粉2g,用硫酸將pH調至6. 5。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨2. 0g，酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g,MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖I. 0g，用硫酸將pH調至6. 5。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨I. 5g，酵母粉 O. 2g，K2HPO4 · 3Η200· 15g,MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，40°C, 180rpm培養10小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，360C，280rpm培養15小時，發酵過程中用磷酸將pH維持在8. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經IOOOOrpm離心20min得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(PH6. O, 50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為
1.5X105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為I. 2X107IU/mg。實施例5
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g, MgSO4 · 7H20
0.lg，葡萄糖0.58，瓊脂粉28，用磷酸將？!1調至7.5。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g,MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0. 5g，用磷酸將pH調至7. 5。
發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨2. 0g，酵母粉 O. 2g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g,MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，36°C, 120rpm培養14小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，300C，180rpm培養20小時，發酵過程中用磷酸將pH維持在7. 5，發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經IOOOOrpm離心20min得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(PH6. O, 50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為
2.OX 105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為I. 3X 107IU/mg。實施例6
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. lg, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖I. 5g，瓊脂粉2g，用鹽酸將pH調至7.0。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. Ig,MgSO4 ·7Η20 O. 15g，葡萄糖I. 5g，用鹽酸將pH調至7.0。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨I. 5g，酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g,MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，32°C, 150rpm培養18小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，28°C，200rpm培養22小時，發酵過程中用鹽酸將pH維持在8. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經15000離心IOmin得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(PH6. O, 50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為
1.8X 105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為I. 2X 107IU/mg。實施例7
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖0.58，瓊脂粉28，用磷酸將？!1調至7.0。種子培養基組成(IOOmL):蛋白胨2. 0g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g,MgSO4 ·7Η20 0. 15g，葡萄糖0. 5g，用磷酸將pH調至7.0。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白胨O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3Η200· 15g,MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 I. Og, Tween80 0. 05mL。
取斜面菌種(芽孢桿菌(Bacillus sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種于已滅菌的種子培養基中，30°C,200rpm培養20小時,然后將種子液接種于已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，340C，220rpm培養14小時，發酵過程中用磷酸將pH維持在7. 5，發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經12000rpm離心15min得上清液，上清液用硫酸銨沉淀，取得到的透明質酸酶沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(PH6. O, 50mmol/L)中，最后經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化后透明質酸酶。采用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為
I.2X105IU/mL，純化后的透明質酸酶比活為8X106IU/mg。本發明透明質酸酶酶活性高，熱穩定性和pH穩定性好，能夠滿足エ業化大批量降解透明質酸所需的酶用量，且酶的制備過程簡單、條件溫和，成本低，解決了化學降解污染環境、生物降解酶來源有限、活性低、價格高的缺陷。下面列舉以本發明比酶活在8X IO6
I.5X 107IU/mg之間的透明質酸酶酶切法制備寡聚透明質酸鹽的優選實施例。
實施例8
向Im3不銹鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為3 X IO6Da的透明質酸鈉300kg，待完全溶解后，用冰こ酸調節pH為4. 0，并升溫至20°C，カロ入I. 35X IOltlIU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至分子量小于IO4Da時，將溫度升高至50°C，維持60min，加入IkgNaCl，用O. 45Mm的混合纖維素濾膜過濾酶解液，然后用20m3的こ醇沉淀，得到透明質酸鈉沉淀，該沉淀用こ醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色顆粒，含量96. 8%，分子量O. 86kDa，pH6. 8，其紅外圖譜見圖1，與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例9
向Im3不銹鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為2X IO4Da的透明質酸鉀IOkg,待完全溶解后,用氫氧化鈉調節pH為9. O,并升溫至48°C,カロ入4X IO8IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至分子量小于IO4Da時，將溫度升高至90°C，維持IOmin,加入IOOkgKCl,用O. 45Mm的聚砜濾膜過濾酶解液,然后用5m3的丙酮沉淀,得到透明質酸鉀沉淀，該沉淀用丙酮脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鉀。該寡聚透明質酸鉀為白色粉末，含量98. 8%，分子量O. 32kDa，pH6. 5，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例10
向Im3不銹鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為
1.6X IO6Da的透明質酸鈉30kg，待完全溶解后，用氫氧化鉀調節pH為8. 0，并升溫至40°C，加入I. 2 X IO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至分子量小于IO4Da時，將溫度升高至60°C，維持60min,加入50kgNaCl,用O. 45Mm的尼龍濾膜過濾酶解液,然后用IOm3的丙醇沉淀,得到透明質酸鈉沉淀，該沉淀用丙醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色粉末，含量97. 6%，分子量O. 62kDa，pH7. 1，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜ー致。實施例11
向Im3不銹鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為8X IO5Da的透明質酸鈣60kg，待完全溶解后，用冰こ酸調節pH為7. 0，并升溫至35°C，加入
2.4X IO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至分子量小于IO4Da時，將溫度升高至70°C，維持30min,加入35kgCaCl2,用O. 45Mm的聚醚砜濾膜過濾酶解液,然后用3m3的異丙醇沉淀,得到透明質酸鈣沉淀，該沉淀用異丙醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鈣。該寡聚透明質酸鈣為白色粉末，含量96. 6%，分子量O. 56kDa，pH6. 5，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例12
向Im3不銹鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為2X IO5Da的透明質酸200kg，待完全溶解后，用硫酸調節pH為6. O,并升溫至25°C，加入SXlO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至分子量小于IO4Da時，將溫度升高至80°C，維持20min,加入60kgNaCl,用O. 45Mm的聚醚砜濾膜過濾酶解液,然后用6m3的甲醇沉淀,得到透明質酸鈉沉淀，該沉淀用甲醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色顆粒，含量98. 7%，分子量O. 76kDa，pH7. 3，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例13 向Im3不銹鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為IO5Da的透明質酸100kg，待完全溶解后，用鹽酸調節pH為5. O，并升溫至20°C，_；V4X109IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至分子量小于IO4Da時，將溫度升高至55°C，維持70min，加入20kgZnCl2,用O. 45Mfli的硝化纖維素濾膜過濾酶解液，然后用4. 5m3的こ醇沉淀，得到透明質酸鋅沉淀，該沉淀用こ醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鋅。該寡聚透明質酸鋅為白色顆粒，含量96. 8%，分子量O. 91kDa，pH6. 8，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。比較例I
向IL燒杯中加入IL純化水，邊攪拌邊向燒杯中加入分子量為8 X IO5Da的透明質酸鈉50g,待完全溶解后，加濃鹽酸10mL，降解至分子量小于IO4Da時，用氫氧化鈉調節pH至6. 2，用O. 45Mffl的混合纖維素濾膜過濾降解液，然后用IOL的こ醇沉淀，得到透明質酸鈉沉淀，該沉淀用こ醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為微黃色粉末，含量 63. 8%,分子量 O. 8IkDa, ρΗ4· 8。比較例2
向IL燒杯中加入IL純化水，邊攪拌邊向燒杯中加入分子量為5Χ IO5Da的透明質酸100g，待完全溶解后，加濃鹽酸10ml，降解至分子量小于IO4Da時,用氫氧化鈉調節pH至6. 5，用O. 45Mffl的聚砜濾膜過濾降解液，然后用IOL的こ醇沉淀，得到透明質酸鈉沉淀，該沉淀用こ醇脫水，然后真空干燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為微黃色粉末，含量60. 2%,分子量 O. 76kDa, ρΗ4· 2。將比較例及實施例中得到的透明質酸鹽的含量進行比較，見表I。
_ 表i暮聚透明廣酸鹽的含量(HPLCS) _
I:比！》！ [mm
II 2 8 9 I 10 11 12 I 13
63 S i 60.2 I 96 8 98 8 97 6 96.6 9S 7 96 8
(HPLC 法)[ I I I I I從表I可以看出，酶切法制備的寡聚透明質酸鹽含量顯著高于化學降解法制備的寡聚透明質酸鹽(P < O. 05)。
動物酶降解得到的寡聚透明質酸鹽，具有促血管生成、促進創傷愈合、抗腫瘤及免疫調節等生物活性。微生物來源透明質酸酶降解得到的寡聚透明質酸鹽的生物學活性未見報道。但以下的實驗研究表明該發明中得到的寡聚透明質酸鹽無細胞毒性，與化學降解法得到的寡聚透明質酸鹽相比，具有清除自由基作用強，還原能力強，因此可用于化妝品中，該寡聚透明質酸鹽分子量小，易于被腸道吸收，可用于食品中，同時該寡聚透明質酸鹽具有促血管生成、促進創傷愈合的作用，因此可用于醫藥領域。實驗例I
酶切法制備的寡聚透明質酸鹽的細胞毒性研究。試驗采用L929小鼠成纖維細胞作為觀察細胞，RPMI-1640培養基添加10%胎牛血清作為完全培養基，陰性對照為不添加任何供試樣品的完全培養基，陽性對照為5g/L苯酚溶液(溶于完全培養基)，空白對照為無細胞完全培養基，供試品為完全培養基加寡聚透明質酸鈉樣品。按下式計算相對增殖率(財況)。
權利要求
1.一種酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法，其特征是以芽孢桿菌(ifeci77i/5· sp. )A50 CGMCC NO. 5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解，包括以下步驟①配制透明質酸或其鹽溶液向純化水中加入分子量大于IOkDa的透明質酸或其鹽， 配制成質量體積濃度為I 30%的溶液；②酶解調節步驟①中溶液的溫度為20 48°C、pH為4 9，然后向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；③滅活將酶解液在5(T90°C下保持l(T60min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活；④過濾向滅活后的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然后用孔徑為 O. 45Mm的濾膜過濾，得濾液，每IOOml酶解液中加入O. I IOg的易溶性無機鹽；⑤沉淀向步驟④的濾液中加入濾液體積3-20倍的醇或酮，混合均勻，得到寡聚透明質酸鹽沉淀；⑥脫水干燥將步驟⑤中的寡聚透明質酸鹽沉淀分離出來，用有機溶劑脫水，然后真空干燥，得寡聚透明質酸鹽。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征是每Ikg透明質酸或其鹽配制成的溶液中加入2X107 5X IO7IU的芽孢桿菌透明質酸酶。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征是所述芽孢桿菌透明質酸酶的制備方法包括以下步驟(1)將芽孢桿菌(Bacillussp. )A50 CGMCC NO. 5744菌種進行斜面培養，得斜面菌種；(2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 40°C、100 200rpm的條件下培養10 24h，得種子液；(3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 40°C、100 300rpm的條件下培養12 24h，得發酵液；(4)離心分離發酵液，取上清液，將上清液用硫酸銨分級沉淀出芽孢桿菌透明質酸酶；(5)將步驟(4)沉淀出來的透明質酸酶溶于磷酸鹽緩沖液中，超濾除去小分子雜質，得純化的芽孢桿菌透明質酸酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征是發酵液中芽孢桿菌透明質酸酶的酶活為 IX IO5 3X 105IU/mL，純化后芽孢桿菌透明質酸酶的比活為8 X IO6 I. 5X 107IU/mg。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征是對芽孢桿菌進行培養時，每IOOmL斜面培養基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. O g，K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15 g，MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15 g,葡萄糖 O. 5 I. 5 g,瓊脂粉 2g，pH 調至 6. O 8. O ;每IOOmL種子培養基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. Og, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15 g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15 g,葡萄糖 O. 5 I. 5 g, pH 調至6.O 8. O ;每IOOmL發酵培養基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. Og, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g，吐溫 80O.05mL, pH 調至 6. O 8. O。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征是步驟①中，透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、 鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽；步驟②中，采用酸或堿調節pH至4-9，所述酸為鹽酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀；步驟④中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、 鋅鹽或鎂鹽；步驟⑤中，所述醇或酮為乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇；步驟⑥中，脫水所用的有機溶劑為酮或醇。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征是步驟②中，酶解溫度為35 450C，酶解pH為5. 5 7. 5，將透明質酸酶解至分子量為3000 104Da。
8.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征是所得寡聚透明質酸鹽含量大于95%。
9.一種寡聚透明質酸鹽，其特征是采用權利要求1-6中任一項所述的酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法制得。
10.寡聚透明質酸鹽在食品、化妝品或醫藥領域的應用，其特征是所述寡聚透明質酸鹽由權利要求1-6中任一項所述的酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法制得。
全文摘要
本發明公開了酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法及所得寡聚透明質酸鹽和其應用，以芽孢桿菌(Bacillussp.)A50 CGMCC NO.5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解，包括配制透明質酸或其鹽溶液、酶解、滅活、過濾、沉淀、脫水干燥步驟。本發明利用芽孢桿菌產生的透明質酸酶降解透明質酸或其鹽，經過除酶、乙醇沉淀、脫水干燥而成，此法操作簡單，條件溫和，對產品結構無破壞，無環境污染，而且發酵來源的透明質酸酶成本低，適合大規模工業化生產，制備的寡聚透明質酸鹽具有透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強等優點，可用在化妝品、食品及醫藥領域。
文檔編號C12R1/07GK102690847SQ201210188820
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月11日 優先權日2012年4月13日
發明者喬莉蘋, 馮寧, 劉愛華, 李海娜, 欒貽宏, 王冠鳳, 王海英, 石艷麗, 郭學平 申請人:華熙福瑞達生物醫藥有限公司