專利名稱：一種s-木薯羥腈裂解酶的提取方法及其在手性合成乙酸氰醇酯中的應用的制作方法
技術領域：
本發 明涉及生物醫藥和精細化工產品的制備技術領域，具體地說是一種直接使用有機溶劑沉淀法從木薯葉中分離提取S-木薯羥腈裂解酶(S-MeHNL)的簡單、高效的方法，并將其作為手性催化劑應用在催化醛與各種氰源的手性加成反應中，合成得到手性氰醇及其乙酸酯。
背景技術：
手性氰醇及其酯是一類具有重要價值的手性源。它可以方便地轉化為具有 構型的羥基酮、羥基醇、P-胺基醇、氨腈、氮啶、咪唑雜環等重要的合成手性藥
物及中間體的重要原料。在非手性催化劑或無催化劑的條件下，醛與HCN的加成一般只能得到外消旋的氰醇產物；所以，需要使用拆分或手性催化劑才能得到S-手性氰醇及其酯。
S-氰醇的生物催化合成，一般使用S-羥氰裂解酶作為手性催化劑。而S-羥氰裂解酶分布不如羥氰裂解酶那樣廣泛，目前發現它只存在于橡膠、木薯和高粱嫩葉等少數幾種植物組織中，并且豐度較低，純化難度大。其中，木薯是一種在100多個國家廣泛被種植的重要農作物° Effenberg 等(Wajant, H. ; Forster, S. ; Bottinger, H. ; Effenberger, F.;Pfizenmaier, K. Plant sci. , 1995, 108, I.)發現木薯中含有的51-木薯輕腈裂解酶(S-MeHNL),可催化醒或酮和HCN合成手性氰醇。Effenberg等并通過五步法分離得到了木薯羥腈裂解酶，分別為粗酶液的提取；凝膠層析；陰離子交換層析(pH 5. 8);凝膠過濾層析；再次陰離子交換層析(pH 7. 5)。然后將獲得的木薯羥腈裂解酶固定在硝基纖維上作為催化劑，催化芳醛、脂肪醛和雜環醛與HCN加成合成手性氰醇，苯甲醛的氰醇產物ee值較高(90%)，但收率只有34% ;其它產物的ee值和收率都不理想(Scheme I)。
I+ c,S-MeHyi I JH
R H— O 02 M acttait buffer R, iCH
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81V1 34% 30% -Pr 70% 83%
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Sckfin# IWhite等也嘗試了用三步法從木薯葉中提取了木薯羥腈裂解酶即先從木薯葉中提取了粗酶液，再用鹽析法(50%硫酸銨水溶液)析出5·-木薯羥腈裂粗酶，并透析24 h以除去粗酶中含有的鹽(硫酸銨)。在此基礎上White等對木薯羥腈裂解酶部分酶學性質進行了研究，但沒有達到催化合成手性氰醇的要求(White, ff. L. B. ; Arias-Garzon, D.
I.; McMahon, J. Μ. ; Sayre, R. Τ. Plant Phsiol. 1998, 116, 1219·)。
以上這些木薯羥腈裂解酶提取方法存在酶的收率低、純度低、酶催化反應效果差等問題。因此,科學家們將希望寄于基因工程的方法上。如Effenberger等(Forster S.，Roos J. , Effenberger F·，et al . Angew Chem. Int. Ed. Engl. , 1996, 35: 437.)將
木薯羥氰裂解酶(S-MeHNL)在大腸桿菌等中成功表達，通過基因重組的方法獲得MeHNL，并將其作為催化劑應用到5·-氰醇的合成上，取得了較好的效果。程樹華等(程樹華，嚴共鴻，吳襟，孫萬儒，生物工程學報，2001，17 (1)，78.)也成功地將S-木薯羥氰裂解酶克隆于質粒PPIC9K，在大腸桿菌獲得高效表達。重組羥腈酶的催化活性較高。雖然木薯羥氰裂解酶在基因工程的研究取得了較大的進展，但由于獲得的重組酶活性通常穩定性差，濃度低，到目前為止，該技術還難以達到實際應用的階段。如上所述，S-木薯羥氰裂解酶在木薯葉中豐度雖然低，但由于木薯葉是一種來源 豐富的可再生資源，價廉易得。若能研究開發出一種能簡易、經濟、有效地從木薯葉中提取具有高催化活性的S-羥氰裂解酶的方法，并將其作為手性催化劑直接應用于氰醇及其乙酸酯的手性加成反應，則實際應用價值很大。

發明內容
本發明的目的在于提供一種直接使用有機溶劑沉淀法從木薯葉中分離提取木薯羥腈裂解酶(S-MeHNL)的簡單、高效的方法，并將其應用為手性催化劑催化醛與各種氰源的手性加成反應，高收率、獲得高光學純度手性氰醇及其乙酸酯。本發明的目的是通過如圖I所示的操作程序實現的
SP，將木薯葉作為酶源，經破碎，加入一定濃度鹽水溶液作為粗酶的提取液，經過濾除去濾渣后，再加入有機溶劑析出固體，經過濾獲得S-木薯羥腈裂解酶，并置于冰箱中貯存。木薯esculenta, cassava)又稱樹薯或木番薯,是廣為種植的農作物之一。所述木薯葉指其新鮮葉子。所述的鹽水溶液可以是(NH4)2SO4, Na2SO4, K2SO4, NH4Cl和NaCl等鹽中的一種鹽的水溶液，濃度為O. 02 O. I mol/L。所選用的有機溶劑可以是甲醇，乙醇，異丙醇，丙酮，四氫呋喃和乙腈中的一種，其用量為提取液體積的Γ5倍區間。上述方法獲的木薯羥腈裂解酶可以直接作為手性催化劑，應用于催化醛與氫氰酸、丙酮氰醇、KCN或NaCN等各種氰源的手性加成反應，可高收率地獲得高光學純的氰醇產物，通過簡單連續的乙酰化反應，生成較穩定的各種手性乙酰氰醇酯。該反應可連續操作，方法簡便和高效。
權利要求
1.一種S-木薯羥腈裂解酶的提取方法，其特征在于該方法是將木薯葉作為酶源，經破碎，加入鹽水溶液作為粗酶的提取液，經過濾除去濾渣后，再加入有機溶劑析出固體，經過濾獲得5·-木薯羥腈裂解酶，并置于冰箱中貯存；其中 所述木薯葉為樹薯或木番薯的新鮮葉子； 所述鹽水溶液是(NH4)2S04、Na2SO4, K2S04、NH4C^PNaCl中的一種鹽的水溶液，濃度為O.02 O. I mol/L ； 所述有機溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、四氫呋喃和乙腈中的一種，其用量為提取液體積的I飛倍。
2.—種權利要求I所得S-木薯羥腈裂解酶的應用，其特征在于所述S-木薯羥腈裂解酶直接作為手性催化劑，應用于催化醛與氫氰酸、丙酮氰醇、KCN或NaCN氰源的手性加成反應，高收率地獲得高光學純的氰醇產物，通過簡單連續的乙酰化反應，生成較穩定的各種手性乙酰氰醇酯；具體反應如下
全文摘要
本發明公開了一種S-木薯羥腈裂解酶的提取方法及其在手性合成乙酸氰醇酯中的應用，其方法是將木薯葉作為酶源，經破碎，加入一定濃度鹽水溶液作為粗酶的提取液，經過濾除去濾渣后，再加入有機溶劑析出固體，經過濾獲得S-木薯羥腈裂解酶；進一步，將該方法得到S-羥腈裂解酶作為手性催化劑，催化醛與氫氰酸、丙酮氰醇、KCN或NaCN等氰源的手性加成反應，可高收率地獲得高光學純的氰醇產物，通過簡單連續的乙酰化反應，生成較穩定的各種手性乙酰氰醇酯，避免手性氰醇的外消旋化。本發明方法簡單、高效,可高收率獲得高光學純度的手性氰醇及其O-乙酸氰醇酯，具有較高的工業應用價值。
文檔編號C12P13/00GK102899306SQ201210229190
公開日2013年1月30日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者鄒新琢, 鄭祖彪, 訾艷, 李忠洲 申請人:華東師范大學