專利名稱：新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白及其制備和應用，具體涉及應用基因工程技術制備的一種新型結核分枝桿菌特異性的多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352及其制備方法，屬于結核病醫學免疫學檢測技術領域。
背景技術：
在全世界結核病依然是危害人類健康的主要傳染病之一，1985年以來艾滋病的流行、結核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國等歐美發達國家結核病發病率呈回 升趨勢，尤其是結核菌耐藥問題、與人免疫缺陷病毒(HIV)合并感染使結核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新增結核病人800 1000萬，每年死亡人數約200萬。中國的結核病疫情相當嚴重，是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病人數位居世界第二，僅次于印度。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查初步結果表明，15歲及以上人群肺結核的患病率為459/10萬，其中傳染性肺結核患病率為66/10萬。結核病死亡在傳染病中居第一位。結核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根據1996年WHO統計每3個死亡的AIDS患者中就有一例死于合并結核，45-85%HIV死亡者是由于結核病診斷延誤所致。早期診斷、發現病人、選擇敏感的抗結核藥物進行有效治療是控制結核病的關鍵。雖然結核病細菌學檢查是目前發現傳染源的主要途徑和手段，是結核病診斷的“金標準”，但臨床標本涂片、鏡檢的靈敏度低，需IO4 — IO5個菌/ml痰才能檢出，陽性率只有20-30% ；傳統的分枝桿菌培養陽性率低(只有30%左右)，需4-8周時間。顯然目前臨床上常規應用的診斷方法不能滿足結核病早期診斷、鑒別診斷的需要。因此，結核病的快速診斷、鑒別診斷是目前亟待解決的重要課題之一。尤其是菌陰肺結核、肺外結核和兒童結核的診斷十分困難，而免疫學檢查標本來源方便、簡便、快速、靈敏、特異，成為結核病重要的輔助檢查手段。結核病患者大都處于免疫紊亂狀態，機體未能誘導有效的免疫應答而導致發病。在疾病的早、中期，機體的免疫功能亢進，Thl型免疫應答逐漸減弱，Th2型免疫應答增強，使Thl型免疫向Th2型免疫轉移，表現為Thl型細胞因子和血清抗體逐漸增高，皮膚變態反應增強。而在疾病的中后期，細胞免疫功能低下，機體產生各種抗病因子的功能下降，體液免疫功能增強，結核病病情惡化，表現為血清抗體增高。因此，抗結核抗體檢測成為臨床上應用較廣泛的一種簡便、快速、價廉的結核病輔助診斷手段，尤其是對于那些診斷困難的菌陰肺結核、兒童結核病或肺外結核病具有實用價值。但目前尚不完全清楚結核分枝桿菌哪些抗原主要引起細胞免疫反應，而哪些抗原主要引起體液免疫反應；結核潛伏感染者、結核病患者對結核菌的不同抗原是如何反應的。目前已發現不同結核病患者對不同結核分枝桿菌抗原產生不同水平的抗體，而同一個患者在疾病的不同階段對不同抗原的免疫反應也不同，使得每一位患者血清識別抗原的種類、數目和水平都有很大的差異，抗原識別的個體差異是人類結核病體液免疫的主要特性。此外，其他細菌感染也可能產生假陽性反應，導致目前商業化的結核抗體檢測試劑盒存在靈敏度和特異性不高的問題，目前任何一種單一的抗原進行結核病血清學診斷時的靈敏度均未超過70%，尚無確切的抗原或成套的抗原可被所有的或大多數的患者所識別。抗原的篩選、評價對抗結核抗體的檢測至關重要，篩選靈敏度高、特異性強、具有互補性的抗原構建融合蛋白，不僅可提高檢測的靈敏度和特異性，還可降低成本，從而彌補目前診斷方法的不足。

發明內容
本發明的目的是克服已有技術的不足，提供一種新型結核分枝桿菌特異性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352及其制備方法，作為結核病抗體檢測抗原，可提高結核抗體檢測的靈敏度和特異性，應用于結核病的快速診斷。一種結核分枝桿菌特異性融合蛋白，其由Rv0057和Rvl352兩種蛋白抗原的關鍵 表位依次連接構成，稱為Rv0057-Rvl352 ;Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列(DNA序列)如序列表中序列I所示；Rvl352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。Rv0577抗原是一種功能未知的醛酮變位酶，僅在結核分枝桿菌復合群中分泌表達，而環境中的分枝桿菌不存在。該蛋白可在結核病患者的肺部表達，存在于多數活動性結核患者的痰液中，并可刺激機體產生體液免疫反應，是已知的可與結核患者血清反應的抗原之一 ORv0057抗原是結核分枝桿菌一個功能未知的蛋白，而Rvl352抗原是結核分枝桿菌復合群保守的一個外膜蛋白，與Rvl351在一個操縱子。它們均可刺激T細胞反應產生IFN-Y，雖然目前國內外尚未見該蛋白在結核病血清學診斷方面的研究報道，但本發明人發現這兩種抗原的融合蛋白具有很好的抗原性，可與血清中抗結核抗體反應，具有較高的靈敏度和特異性(分別為66. 7%和91. 8%)。將上述RV0057和Rvl352兩種結核分枝桿菌蛋白關鍵的抗原表位依次連接，并刪除無抗原表位區域，從而提高結核抗體檢測的靈敏度和特異性，實現結核病患者的早期發現。本發明提出的結核分枝桿菌特異性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352，是選擇結核分枝桿菌兩種蛋白Rv0057和Rvl352關鍵的抗原表位，并將其依次連接，通過基因工程技術將其克隆、表達、純化。本發明提出上述融合蛋白Rv0057-Rvl352的制備(構建)方法，包括如下步驟(I)兩個蛋白抗原表位融合的設計分析結核分枝桿菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白質結構，確定兩個蛋白抗原表位融合的區域、組合和順序；依次將Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位連接、形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。(2)兩個蛋白融合的克隆通過基因工程技術進行克隆。①在Rv0057上游引物添加Nhe I酶切位點，在Rv0057下游引物添加編碼3個疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I, Xho I酶切位點，將PCR擴增產物用Nhe I和Xho I雙酶切后，插入用Nhe I和Xho I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中。轉化到大腸桿菌DH5a受體菌中。經過質粒提取，經T7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。②在Rvl352上游引物添加Nhe I酶切位點和編碼I個疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位點，將PCR擴增產物用Nhe I和Xho I雙酶切后，插入用Nhe I和Xho I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中。轉化到大腸桿菌DH5 α受體菌中。經過質粒提取，經Τ7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rvl352/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。③用Spe I和Xho I雙酶切Rv0057/pET30aSETB質粒作為載體；用Nhe I和XhoI雙酶切Rvl352/pET30aSETB質粒，獲得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB質粒載體中。轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)受體菌中。經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057-Rvl352/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列5所示,并使Rv0057蛋白抗原表位與Rvl352蛋白抗原表位之間通過連接臂相聯接，表明已成功構建了具有多抗原表位的融合蛋白重組表達質粒。(3)多抗原表位融合蛋白的鑒定Rv0057-Rvl352大腸桿菌基因工程株經過誘導、表達、純化，SDS-PAGE電泳、鑒定，及Westhern免疫印跡反應和ELISA分析，表明獲得的純化的融合蛋白與實際設計的大小相符，并具有很好的抗原性。本發明的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白Rv0057-Rvl352可應用于制備結核抗體診斷試劑盒，對結核病具有較高的抗原檢測靈敏度和特異性。本發明將Rv0057和Rvl352蛋白的抗原表位依次通過連接臂連接而構建了多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352。研究結果表明，與目前商品化的抗體檢測試劑盒相比，本發明所制備的結核分枝桿菌特異性融合蛋白，在結核病血清學診斷方面均具有敏度高、特異性強、并與其它抗原具有互補性的優點，可用于檢測血清、胸水等體液標本中特異的抗結核抗體。本發明的特點及技術效果本發明通過基因工程技術克隆、表達、純化結核分枝桿菌Rv0057-Rvl352重組融 合蛋白，通過多種不同的聯合作為結核病抗體檢測的抗原，該種融合蛋白能用于檢測結核病患者的抗體水平。本發明人研究證明應用結核分枝桿菌Rv0057_Rvl352重組融合蛋白抗原檢測結核病人的靈敏度和特異性分別為66. 7%、91. 8%。本發明結核分枝桿菌重組Rv0057_Rvl352融合蛋白抗原可大規模生產，且成本相對較低。本發明的融合蛋白可作為新型結核抗體檢測的聯合抗原之一，用于檢測血清、胸水等體液樣品中特異的抗結核抗體，可用于結核病臨床血清學診斷。


圖I為基因合成的Rv0057DNA片段的瓊脂糖電泳圖。圖2為基因合成的Rvl352DNA片段的瓊脂糖電泳圖。圖3 為 Rv0057-Rvl352/pET30aSETB 大腸桿菌工程菌 IPTG 誘導前后 SDS-PAGE 結
果O
圖4為Rv0057_Rvl352/pET30aSETB大腸桿菌工程菌的表達形式和純化的SDS-PAGE 結果。
具體實施例方式本發明提出的結核分枝桿菌特異性多抗原表位融合蛋白及其制備方法和應用結合實施例及附圖詳細說明如下本發明提出的結核分枝桿菌特異性多抗原表位的融合蛋白Rv0057-Rvl352，是選擇結核分枝桿菌兩種蛋白Rv0057和Rvl352關鍵的抗原表位，并將其依次連接，通過基因工程技術將其克隆、表達、純化。上述的融合蛋白Rv0057-Rvl352的制備方法，包括
(I)兩個蛋白抗原表位融合的設計分析結核分枝桿菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白質結構后，確定兩個蛋白抗原表位融合的區域、組合和順序；依次將Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位連接、形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。由Rv0057和Rvl352兩種蛋白抗原的關鍵表位依次連接構成，稱為Rv0057-Rvl352 ；(2)兩個蛋白融合的克隆通過基因工程技術進行克隆。①在Rv0057上游引物添加Nhe I酶切位點，在Rv0057下游引物添加編碼3個疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I.Xho I酶切位點，將基因合成的Rv0057PCR產物片段用NheI和Xho I雙酶切后，插入用Nhe I和Xho I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中。轉化到大腸桿菌DH5ci受體菌中。經過質粒提取，經T7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057/pET30aSETB。②在Rvl352上游引物添加Nhe I酶切位點和編碼I個疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位點，將基因合成的Rvl352PCR產物片段用NheI和Xho I雙酶切后，插入用Nhe I和Xho I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中。轉化到大腸桿菌DH5ci受體菌中。經過質粒提取，經T7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rvl352/pET30aSETB。③用Spe I和Xho I雙酶切Rv0057/pET30aSETB質粒作為載體；用Nhe I和XhoI雙酶切Rvl352/pET30aSETB質粒，獲得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB質粒載體中。轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)受體菌中。經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057-Rvl352/pET30aSETB，并使Rv0057抗原與Rvl352抗原之間通過連接臂相聯接，表明已成功構建了具有多抗原表位的融合蛋白重組表達質粒。實施例I一、通過基因工程技術克隆Rv0057抗原表位編碼基因I、依據序列表中的序列I設計與合成擴增Rv0057抗原表位的一對引物上游引物(5’端含限制性內切酶Nhe I)5，一 CTAGCTAGCGTGGTGACCGCGGTCGG — 3，下游引物(5’端含限制性內切酶Xho I和Spe I)5，—
CCGCTCGAGTTATTATTAACTAGTACCGCCACCGGTCATCAACGACCGCCA — 3’擴增片段555bp2、Rv0057 基因合成根據上面的設計，通過基因合成Rv0057555bp的PCR產物，于I. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定合成的基因片段。圖I為基因合成的Rv0057DNA片段的瓊脂糖電泳圖，測序結果證明，圖中箭頭所指的DNA條帶就是Rv0057基因合成PCR產物在I. 2%瓊脂糖電泳膠上的位置；左側第一個泳道為TaKaRa公司的DL2000分子量標準(從上到下的6個條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp)。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結束后，在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要·回收DNA的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收目的基因片段，定量后，貯存于_20°C備用。4.重組質粒的構建用限制性內切酶Nhe I和Xho I雙酶切純化后的Rv0057基因合成PCR產物和表達載體pET30aSETB質粒DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳，切取Rv0057基因片段和pET30aSETB質粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，Rv0057基因片段與pET30aSETB質粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，10 μ I反應體系如下
2x連接緩沖液5μ1
pET30aSETB 載休Ιμ
PCR產物2μ1 Τ4 DNA連接酶Ιμ 無菌水補至10 μ 混勻后置于16°C連接過夜，75°C滅活lOmin，冰浴后直接進行轉化。5.連接產物的轉化次日取目的基因片段與載體pET30aSETB連接產物5μ I加入含有100 μ I大腸桿菌DH5 α感受態細胞的離心管中，冰浴O. 5h ;放入42°C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min ;加入LB培養液400 μ 1，37°C恒溫搖床培養Ih ;加入X_Gal60 μ 1，IPTG4y 1，混勻，取出200 - 400 μ I涂布于含有50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒溫培養箱培育14h。6.質粒的提取根據藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落6個，分別接種于5ml含有60 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜；根據《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質粒，定量后，置-20°C儲存備用。7.鑒定重組質粒(I)PCR擴增鑒定以挑選的菌落質粒DNA為模板，以上游和下游引物進行PCR擴增鑒定。擴增產物在I %瓊脂糖凝膠中電泳，陽性重組質粒命名為Rv0057/pET30aSETB。(2)序列測定直接挑選一個克隆送公司進行T7通用引物正向測序驗證測序。測序結果與設計的基因組序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列3所示，其中，GCTAGC 為 Nhe I 酶切位點，GGTGGCGGT 作為連接臂，ACTAGT 為 Spe I, CTCGAG 為 Xho I。GGGGGCGGTAATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGTGGTGACCGCGGTCGGCCGCCGCCGGGGTTTCGCCATGCCCTGGGTGTCCACCGCACGGTCCGGTGCGGTGATGCTGGCGAACTATTCGGCCGGCGTTTGCGGGCGGGTGTCTTCACCGGGCCTTAACGTCAGGAAAATGTGTCTGAAAGCCAACACGCCCGGCGCGGTAACCTGGCTCGACACGCCGAAGAGATTCTTGTCCACACAAACGGCGTCGCGTTGTATGGCCGTTAACAGCAGTGATGTCGTAACGGGCCGTATTGATCCACAGGTTCTCCACACCCCGCTCAACACAGACGTCGACGGATATGCACATGCGATGCACAGCTCCATAAACAGTGGCCCCTTGGAGTACTTGCCAGCAACGTTTAGCGTCTTCCCGGCGCTAGGCGATGTGGGTGACTTGGGCGGTGGTGTCGGTGCGGCG
ACTTACGCTCTGGATAGGTTGTCGAATATGCGTTCGGGTGCTTGTGTCGGAGGAGGTGAGAGCCCATGGCGGTCGTTGATGACCGGTGGCGGTACTAGTTAATAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCAC
CTCGACCCCAAAAACTTGATTAGGTGATGGTTCACGTAGTGGCATCGCCCTGATAGACGTTTTCGCCCTTTGACGTGGAGTCCACGTTCTTATAGTGGACTCTGTCAAACTGGAACAACACTCACCCTATCTCGTCTATTCTTTGATTTATAGCATTTGCGAATCGCTATGGTTAAATGACCTGATACAAACTACGGCGAATTAAAAAATTAACGCCCTTACAA二、通過基因工程技術克隆Rvl352抗原表位編碼基因I、依據序列表中的序列2設計與合成擴增Rvl352抗原表位的一對引物上游引物(5’端含限制性內切酶Nhe I)5，一 CTAGCTAGCGGTGCACGCGCCGAAACC — 3’下游引物(5’端含限制性內切酶Xho I和Spe I)5，—CCGCTCGAGTTATTATTAACTAGTACCGCCACCAGAGATACGCATCCAAAGCT — 3’擴增片段333bp2、Rv1352 基因合成根據上面的設計，通過基因合成Rvl352333bp的PCR產物，于I. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定合成的基因片段。圖2為基因合成的Rvl352DNA片段的瓊脂糖電泳圖，測序結果證明，圖中箭頭所指的DNA條帶就是Rvl352基因合成PCR產物在I. 2%瓊脂糖電泳膠上的位置；左側第一個泳道為TaKaRa公司的DL2000分子量標準(從上到下的6個條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp)。3、回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結束后，在長波紫外線照射下，用干凈的手術刀片在膠上切下要回收DNA的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的說明書回收目的基因片段，定量后，貯存于_20°C備用。4.重組質粒的構建用限制性內切酶Nhe I和Xho I雙酶切純化后的Rvl352基因合成PCR產物和表達載體pET30aSETB質粒DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳，切取Rvl352基因片段和pET30aSETB質粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，Rvl352基因片段與pET30aSETB質粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，10 μ I反應體系如下
2χ連接緩沖液5μ1
pET30aSETB 拔休!μ1
PCR產物2μ1
T4DNA連接酶Ιμ
無菌水補至10 μ 混勻后置于16°C連接過夜，75°C滅活lOmin，冰浴后直接進行轉化。5.連接產物的轉化次日取目的基因片段與載體pET30aSETB連接產物5μ I加入含有100 μ I大腸桿菌DH5 α感受態細胞的離心管中，冰浴O. 5h ;放入42°C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min ;加入LB培養液400 μ 1，37°C恒溫搖床培養Ih ;加入X_Gal60 μ 1，IPTG4y 1，混勻，取出200 - 400 μ I涂布于含有50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒溫培養箱培育14h。6.質粒的提取根據藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落6個，分別接種于5ml含有60 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜；根據《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質粒，定量后，置-20°C儲存備用。7.鑒定重組質粒(I)PCR擴增鑒定以挑選的菌落質粒DNA為模板，以上游和下游引物進行PCR擴增鑒定。擴增產物在I %瓊脂糖凝膠中電泳，陽性重組質粒命名為Rvl352/pET30aSETB。(2)序列測定直接挑選一個克隆送公司進行T7通用引物正向測序驗證測序。測序結果與設計的基因組序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列4所示，其中，GCTAGC 為 Nhe I 酶切位點，GGTGGCGGT 為連接臂，ACTAGT 為 Spe I,CTCGAG 為 Xho I。TTGGAGGGTAATTACCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGGTGCACGCGCCGAAACCGGTGAGCAATTCCCCGGGGATGGGGTGTTTCTCGTGGGAACTGACATTGCGCCAGGCACCTACCGCACGGAGGGGCCGTCGAATCCCCTTATTTTGGTGTTCGGCAGGGTGTCCGAGCTCTCAACCTGCTCATGGTCGACACACAGC
GCACCCGAGGTGAGCAATGAGAACATTGTCGACACCAACACCTCATGGGCCCGATGTCAGTGGTGATCCCGCCGACCGTGGCAGCCTTCCAGACGCATAACTGCAAGCTTTGGATGCGTATCTCTGGTGGCGGTACTAGTTAATAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATTATCCGGATTGGC
GAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTA
CGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAAGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAATGAGCTGATTTAACAAAATTTAACGCGAATTTACAAATATTAACGCTTACAATTTAGTGGCACTTTTCCGGGAAATGGGCCGCGGAACCCCTATTTTGTTATTTTTTCTAAATACATTCCAAATATGTATCCGCCTCATGAATAATTCTTAGAAAACTCCATTCGAGGCATCGATGAAACTGCATTTATTTCTTATCCGGATTATTCATACCTATTTTTGAAAGGCGTTCCTGGATGAAGGAAACTCCCTAGCGAGCTTCTAGGATGGCGAGATTCCTGGGTAATCCGGATTTCGCGGATTCCGCAATCATGGTTA三、通過基因工程技術克隆Rv0057-Rvl352融合編碼基因I.重組質粒的構建用限制性內切酶Spe I和Xho I雙酶切Rv0057/pET30aSETB質粒DNA，用NheI和XhoI雙酶切Rvl352/pET30aSETB質粒DNA，于1%瓊脂糖凝膠電泳，切取Rv0057/pET30aSETB質粒片段和Rvl352基因片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純化。定量后，Rvl352基因片段與Rv0057/pET30aSETB質粒DNA片段按2:1的摩爾比混合，10 μ I反應體
系如下
2χ連接緩沖液5μ1
Rv0057/pET30aSETB 故休Ιμ
Rvl352基因片段2μ1
T4DNA連接酶Ιμ
無菌水補至10 μ 混勻后置于16°C連接過夜，75°C滅活lOmin，冰浴后直接進行轉化。2.連接產物的轉化次日取Rvl352基因片段與Rv0057/pET30aSETB DNA片段連接產物5 μ I加入含有100 μ I大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞的離心管中，冰浴O. 5h ;放入42°C水浴箱熱休克90s，迅速取出冰浴2min ;加入LB培養液400 μ 1，37°C恒溫搖床培養Ih ;加入X_Gal60 μ 1，IPTG4 μ 1，混勻，取出200 - 400 μ I涂布于含有50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37°C恒溫培養箱培育14h。3.質粒的提取根據藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落6個，分別接種于5ml含有60 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜；根據《分子克隆》堿裂解方法，小量提取質粒。4.鑒定重組質粒(I)PCR擴增鑒定以挑選的菌落質粒DNA為模板，分別以Rv0057和Rvl352上游和下游引物進行PCR擴增鑒定。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，陽性重組質粒命名為Rv0057-Rvl352/pET30aSETBo(2)序列測定直接挑選一個克隆送公司進行T7和T7t雙向測序驗證測序。測序結果與設計的基因組序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列5所示，其中，GCTAGC為Nhe I酶切位點，GGTGGCGGT為連接臂，ACTAGC為Nhe I和Spe I產生的位點，編碼Thr和 Ser，ACTAGT 為 Spe I。TAAGTTACGGTACAATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGTGGTGACCGCGGTCGGCCGCCGCCGGGGTTTCGCCATGCCCTGGGTGTCCACCGCACGGTCCGGTGCGGTGATGCTGGCGAACTATTCGGCCGGCGTTTGCGGGCGGGTGTCTTCACCGGGCCTTAACGTCAGGAAAATGTGTCTGAAAGCCAACACGCCCGGCGCGGTAACCTGGCTCGACACGCCGAAGAGATTCTTGTCCACACAAACGGCGTCGCGTTGTATGGCCGTTAACAGCAGTGATGTCGTAACGGGCCGTATTGATCCACAGGTTCTCCACACCCCGCTCAACACAGACGTCGACGGATATGCACATGCGATGCACAGCTCCATAAACAGTGGCCCCTTGGAGTACTTGCCAGCAACGTTTAGCGTCTTCCCGGCGCTAGGCGATGTGGGTGACTTGGGCGGTGGTGTCGGTGCGGCGACTTACGCTCTGGATAGGTTGTCGAATTATGCGTTCGGGTGCTTGTGTCGGAGGAGGTGAGAGCCCATGGCGGTCGTTGATGACCGGTGGCGGTACTA GCGGTGCACGCGCCGAAACCGGTGAGCAATTCCCCGGGGATGGGGTGTTTCTCGTGGGAACTGACATTGCGCCAGGCACCTACCGCACGGAGGGGCCGTCGAATCCCCTTATTTTGGTGTTCGGCAGGGTGTCCGAGCTCTCAACCTGCTCATGGTCGACACACAGCGCACCCGAGGTGAGCAATGAGAACATTGTCGACACCAACACCTCTATGGGCCCGATGTCAGTGGTGATCCCGCCGACCGTGGCAGCCTTCCAGACGCATAACTGCAAGCTTTGGATGCGTATCTCTGGTGGCGGTACTA GTTAATAATAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAGCGAGTCAC四、Rv0057-Rvl352工程菌的誘導表達及鑒定將Rv0057-Rvl352大腸桿菌工程菌接種于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培養液中，置37°C恒溫振蕩器培養過夜，然后按1%轉種到IOml含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培養液中，置37°C恒溫振蕩器培養至OD6tltl為O. 6 — O. 8時，加入IPTG，誘導3 — 4hr。將I X載樣緩沖液150 μ I加入來自Iml菌液的沉淀樣本，混懸后，置100°C沸水浴5min，于12000rpm離心lOmin，取上清液40 μ I進行SDS-PAGE，電泳條件為積層膠恒流IOmA,分離膠恒壓15mA，待溴酚藍電泳至凝膠底部，停止電泳。用考馬斯亮藍R250染色液染色6h ;用脫色液脫色至條帶清晰。Rv0057-Rvl352/pET30aSETB菌體在相對分子質量30. 5kDa位置附近有濃重的表達條帶出現，誘導3-4小時表達量最多，結果見圖3。圖3 為 Rv0057-Rvl352/pET30aSETB 大腸桿菌工程菌 IPTG 誘導前后 SDS-PAGE 結果，其中I :蛋白質分子量標準(北京天根生化科技有限公司預染蛋白Marker111:94，60，45，27，18kD)；2:基因工程菌誘導前；
3 :基因工程菌誘導后I小時；4 :基因工程菌誘導后2小時；5 :基因工程菌誘導后3小時；6 :基因工程菌誘導后4小時。七、Rv0057_Rvl352重組蛋白的純化將誘導菌超聲破碎后,采用Novagen公司生產的His. Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說明書純化Rv0057-Rvl352融合蛋白，SDS-PAGE電泳可見純化的30. 5kDa蛋白呈一條帶，結果見圖4。圖4為Rv0057_Rvl352/pET30aSETB大腸桿菌工程菌的表達形式和純化的SDS-PAGE結果，其中I :蛋白質分子量標準(北京天根生化科技有限公司預染蛋白Marker111:94，60，45，27，18kD)；2:基因工程菌誘導前；3 :基因工程囷誘導后；4 :基因工程菌表達菌體超聲破碎后高速離心分離出的上清(可溶性部分)樣品；5 :基因工程菌表達菌體超聲破碎后高速離心分離出的沉淀(不可溶性部分)樣品;6:純化后蛋白樣品。以下結合具體的實施例詳細說明本發明的應用，各實施例中的抗原原料均可通過上述制備方法獲得，但不應構成對本發明實施范圍的限定。實施例2將本發明實施例I所構建、純化的Rv0057-Rvl352融合蛋白應用于結核病的血清學診斷。以其作為化學發光免疫實驗的診斷抗原，應用于臨床標本的試驗，獲得了較好的診斷效果，與目前商品化的三個結核抗體檢測試劑盒比較，顯著地提高了結核病診斷的靈敏度。ELISA檢測程序如下所示I.實驗標本共選擇103例血清標本，分為兩組(I)結核病組臨床上經影像學、實驗室檢查及抗結核治療而確診的活動性結核病患者54例，其中男35例，女19例，平均年齡43. I±18. 8歲。包括肺結核、結核性胸膜炎、結核性心包炎、結核性腦膜炎、泌尿系結核等。(2)非結核對照組臨床上經影像學、實驗室檢查及治療效果而確診的非結核呼吸疾病患者49例，其中男25例，女24例，平均年齡61. 3±20. 8歲。包括肺炎、慢性支氣管肺炎、支氣管哮喘、肺癌、支氣管擴張合并感染、呼吸道感染等。2.實驗儀器和試劑儀器化學發光分析儀KPS-KM為北京科美東雅科技發展有限公司公司產品。試劑Rv0057-Rvl352融合蛋白，3個商品化的結核抗體診斷試劑盒(包括韓國SD標準診斷公司、上海奧普生物醫藥有限公司、北京現代高達生物技術有限責任公司)，包被緩沖液(O. 05mol/L碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液，pH9. 6)，封閉液(PBS_2%小牛血清)，洗滌液(PBST，PBS-0. 05%吐溫，ρΗ7· 4)，樣本稀釋液(PBST-2%小牛血清，ρΗ7· 4)，酶標第二抗體(HPR標記的羊抗人IgG)，化學發光底物液(用前15分鐘將A與B試劑按1:1配制)。 3.實驗方法(I)抗原包被用包被緩沖液將重組蛋白抗原稀釋至IOyg/ ml，每孔加100 μ I。每板留I個孔，只加包被緩沖液，作為空白對照。置4°C過夜。次日用PBST洗板3次，3分
鐘/次。(2)封閉每孔加PBS-2%小牛血清200μ 1，置37°C孵育I小時。用PBST洗板3次，3分鐘/次。(3)加待檢樣品用PBST-2%小牛血清稀釋待檢樣品，充分混勻后，每孔加100 μ 1，做2個平行孔；同時做空白、陰性及陽性孔對照，置37°C孵育40分鐘。用PBST洗板3次，3
分鐘/次。(4)加酶標二抗用PBST-2%小牛血清新鮮稀釋酶標第二抗體，充分混勻后，每孔加100μ 1，置37°C孵育40分鐘。用PBST洗板6次，8分鐘/次。(5)加底物液每孔加100 μ I新鮮配制的化學發光底物液，立即放入化學發光分析檢測儀，5分鐘讀取發光強度。4.結果實驗結果見表1，Rv0057-Rvl352融合蛋白用作抗原檢測結核抗體的特異性(為91. 8%)明顯高于上海奧普生物醫藥有限公司(為66. 7%)和北京現代高達生物技術有限責任公司(為84. 8%)的結核抗體診斷試劑盒，略低于韓國SD標準診斷公司的結核抗體診斷試劑盒(為97. 0%)。Rv0057-Rvl352融合蛋白的靈敏度(為66. 7%)明顯高于韓國SD標準診斷公司(為24. 1%)、北京現代高達生物技術有限責任公司(為33. 3%)的結核抗體診斷試劑盒和傳統的涂片和培養(為20. 4%)，略低于上海奧普生物醫藥有限公司的結核抗體診斷試劑盒(為77.8%)。本發明的融合蛋白用作抗原檢測結核抗體無論是菌陽還是菌陰的活動性結核病患者均具有較高的檢出率。結果表明與現有商品化的結核抗體檢測試劑盒和傳統的涂片、培養相比，本發明所構建的結核分枝桿菌特異性融合蛋白，在對結核病診斷的靈敏度和特異性方面具有明顯的優勢。因此，本發明在結核病血清學快速診斷方面具有廣泛的應用前景。表I應用化學發光酶免疫方法檢測結核和非結核血清中抗結核抗體
權利要求
1.一種新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白，其由RV0057和RV1352兩種蛋白的抗原表位依次連接構成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列I所示；Rvl352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.根據權利要求I所述的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白，其特征在于所述的Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。
3.權利要求I或2所述的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白的制備方法，包括如下步驟 (O分析結核分枝桿菌Rv0057、Rvl352的基因序列和蛋白質結構，確定兩個蛋白抗原表位融合的區域、組合和順序；依次將Rv0057和Rvl352蛋白抗原表位連接，形成融合蛋白；Rv0057蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rvl352蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端; (2)兩個蛋白融合的克隆 ①在Rv0057上游弓I物添加NheI酶切位點，在Rv0057下游引物添加編碼3個疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Xho I酶切位點，將PCR擴增產物用Nhe I和Xho I雙酶切后，插入用Nhe I和Xho I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中；轉化到大腸桿菌DH5a受體菌中；經過質粒提取，經T7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057/pET30aSETB ； ②在Rvl352上游引物添加NheI酶切位點和編碼I個疏水性氨基酸的DNA序列，在Rvl352下游引物添加Spe I、Xho I酶切位點，將PCR擴增產物用Nhe I和Xho I雙酶切后，插入用Nhe I和Xho I雙酶切后的pET30aSETB質粒載體中；轉化到大腸桿菌DH5 α受體菌中；經過質粒提取，經Τ7正向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rvl352/pET30aSETB ； ③用SpeI和Xho I雙酶切Rv0057/pET30aSETB質粒作為載體；用Nhe I和XhoI雙酶切Rvl352/pET30aSETB質粒，獲得的Rvl352片段插入Rv0057/pET30aSETB質粒載體中；轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)受體菌中；經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒Rv0057-Rvl352/pET30aSETB，并使Rv0057蛋白抗原表位與Rvl352蛋白抗原表位之間通過連接臂相聯接。
4.權利要求I或2所述的新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白在制備結核抗體診斷試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種新型結核分枝桿菌特異性融合蛋白及其制備和應用，屬結核病醫學免疫學診斷技術領域。本發明的融合蛋白由Rv0057和Rv1352兩種蛋白的抗原表位依次連接構成，Rv0057蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv1352蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。與目前商品化的抗體檢測試劑盒相比，本發明所制備的結核分枝桿菌特異性融合蛋白，在結核病血清學診斷方面均具有敏度高、特異性強、并與其它抗原具有互補性的優點，可用于檢測血清、胸水等體液標本中特異的抗結核抗體。
文檔編號C12R1/32GK102702360SQ20121023210
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者馮金棟, 吳雪瓊, 張俊仙, 梁艷, 趙衛國, 陽幼榮 申請人:中國人民解放軍第三〇九醫院