專利名稱：胃癌淋巴結轉移的判斷方法
技術領域：
本發明涉及判斷胃癌淋巴結轉移的方法、判斷裝置及其使用試劑盒。
背景技術：
近年來，在臨床診斷領域，基因檢查迅速普及。作為基因檢查的一例，有癌癥的淋巴結轉移診斷。癌細胞脫離原發灶經血管和淋巴管轉移到全身。在癌癥手術中，需要盡可能將病灶切除干凈，因此，要求正確地查出轉移，并根據轉移的程度采取適當處置。為此，術中的癌細胞淋巴轉移的診斷顯得尤為重要。作為癌癥淋巴結轉移的一種診斷方法，即以在正常細胞中不表達或表達量很低、在癌細胞中大量表達的蛋白質的核酸為靶核酸進行檢測。隨著近年來基因分析技術的發展，通過擴增、檢測從生物體切除的淋巴結組織中所含靶 核酸即可有效地進行癌癥診斷。為了用這種基因檢查的方法檢查癌向特定組織的轉移，現在越來越多的人熱衷于進行使用 LAMP 法(loop-mediated isothermal amplification method)和聚合酶鏈反應(PCR法,polymerase chain reaction)等檢查癌基因的研究。這種基因檢查可以通過檢測組織和細胞等所含癌標志物(比如在癌細胞特異表達的蛋白質的mRNA等)進行。眾所周知，癌標志物(以下也單稱為標志)之一角蛋白19 (CK19)作為診斷乳腺癌淋巴結轉移的標志非常有用。CK19是一種公認的在正常淋巴結的表達量和在轉移到淋巴結的乳腺癌細胞上的表達量具有有意義之差的分子。胃癌在中國、日本和韓國等亞洲和南美患者較多。據2003年癌癥死亡人數統計，胃癌在日本，在男性中僅次于肺癌居第二位，在女性中僅次于大腸癌位居第二位。而且，癌癥自覺癥狀很少，早期發現很困難，進展轉移到淋巴結等的情況很多。過去，人們使用角蛋白20和癌胚抗原作為判斷胃癌淋巴結轉移的標志。但關于胃癌基因檢查的報告很少，判斷胃癌淋巴結轉移的更先進的方法有待開發。

發明內容
本發明旨在解決前述問題，目的是提供一種胃癌淋巴結轉移的判斷方法、判斷裝置及其試劑盒。本發明提供一種胃癌淋巴結轉移的判斷方法，包括
定量步驟，定量用疑有胃癌轉移的淋巴結組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA ； 判斷步驟，根據所得所述mRNA的定量結果判斷胃癌的淋巴結轉移。所述判斷步驟包括根據mRNA的定量值判斷所述淋巴結組織中的轉移灶轉移度的步驟。所述轉移度為轉移灶大小。
所述轉移度為轉移灶的癌細胞數。在所述定量步驟用核酸擴增法定量所述角蛋白19的mRNA。所述核酸擴增法為定量RT - PCR或定量RT — LAMP。所述判斷步驟包括比較所述mRNA定量值和預定的閾值，當定量值低于閾值時，判斷胃癌淋巴結轉移陰性，當定量值超過閾值時，判斷胃癌淋巴結轉移陽性。所述mRNA定量值是所述檢測試樣中的所述角蛋白19mRNA的絕對量。本發明還提供一種胃癌淋巴結轉移判斷裝置，包括
定量系統，定量用疑有胃癌轉移的淋巴結組織制備的檢測試樣中的角蛋白19mRNA ； 判斷系統，根據所得mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結轉移。所述裝置，還具備根據所得mRNA定量值，判斷所述淋巴結組織中轉移灶的轉移度的第二判斷系統。本發明進一步提供一種用于判斷胃癌淋巴結轉移的試劑盒，其包括，用來制備檢測試樣的淋巴結組織前處理液、含能檢出角蛋白19的引物的引物溶液以及含用于實施核酸擴增法的酶的酶溶液。所述試劑盒的所述前處理液為含有二甲亞砜的緩沖液。 所述試劑盒的所述酶溶液含有RNA依賴型DNA聚合酶和DNA依賴型DNA聚合酶。本發明可以提供一種胃癌淋巴結轉移的判斷方法、判斷裝置及其所用試劑盒。以此可以進行有效的胃癌基因檢查。通過本發明還可以判斷有胃癌轉移的淋巴結組織中的轉移灶的轉移度。判斷轉移灶的轉移度可以提供決定是否要手術的指標或決定手術方式的指標。


[圖I]為本發明一實施方式的判斷裝置的整體結構斜視 [圖2]為圖I所示判斷裝置的作為定量系統的核酸擴增測定裝置整體結構的斜視圖； [圖3]為圖2的核酸擴增測定裝置的平面略 [圖4]為本發明一實施方式的判斷裝置中作為判斷系統的個人電腦CPU的轉移判斷流
程;
[圖5]為實施例I算出的胃癌淋巴結組織中CK19mRNA未標準化的拷貝數顯示 [圖6]為實施例2算出的胃癌淋巴結組織中CK19mRNA的標準化值的顯示 [圖7]為實施例3算出的胃癌淋巴結組織中CK19mRNA的拷貝數顯示 [圖8]為CK19 m RNA定量值與轉移灶大小的關系 [圖9]為CK19mRNA定量值與癌細胞數的關系 [圖10]為CK19 m RNA定量值與轉移灶大小的關系 [圖11]為CK19mRNA定量值與癌細胞數的關系圖。[符號說明]
I癌轉移判斷裝置
101核酸擴增測定裝置
51反應部
52濁度檢測器102電腦
102c 顯示器 102d CPU。
具體實施例方式 在本發明第一實施方式中，轉移度只要是胃癌轉移的淋巴結組織中能夠反映轉移程度或轉移灶狀態的東西均可，無特別限定。轉移度比如可以表現為轉移灶大小或轉移灶中癌細胞數量。淋巴結轉移根據大小分為微轉移(小轉移)和大轉移。轉移灶長徑小于2 mm時，稱為微轉移(Micro metastasis)。轉移灶長徑大于2 mm時,稱為大轉移(Macro metastasis)。小于0. 2mm的轉移灶稱為游離癌細胞(Isolated Tumor Cell :ITC)。一般一診斷為大轉移，就要求摘除轉移灶。微轉移處于無法判斷轉移灶是否再增大的狀態。本發明的一實施方式能夠設定閾值，作為可識別微轉移和大轉移的數值。也可以根據轉移灶的大小設定多個閾值。在本發明一實施方式中，作為所用標本可以例舉出含從胃癌患者身上采集的淋巴結組織的試樣。更具體地說，可以例舉出以生檢為目的采集的胃癌附近的淋巴結組織。作為檢測試樣，只要可以定量標本中角蛋白19的mRNA即可，并無特別限定。比如混合標本與前處理液，對前處理液中的標本進行化學和/或物理處理，讓含在標本中的細胞中的mRNA移動(增溶)到溶液中，獲得mRNA。可以以此溶液為檢測試樣。作為前處理液只要是可溶解標本中所含細胞中的mRNA即可，無特別限定。比如可以緩沖液為前處理液。為了控制RNA的分解，最好緩沖劑為酸性。具體而言，pH的理想范圍為2. 5 5. 0，最好為3. 0 4. O。為了使pH保持在這一范圍，可以使用公認的緩沖齊U。作為緩沖劑具體名稱，可以列舉出甘氨酸一鹽酸緩沖劑等。緩沖劑的濃度只要能夠讓緩沖劑PH保持在上述范圍內即可，無特別限定。前處理液里最好含有表面活性劑。用表面活性劑破損細胞膜和核膜。通過這種破損，細胞中的核酸更易移到溶液中。對表面活性劑的種類沒有特別限制，只要有這種作用即可，不過最好為非離子型表面活性劑，以聚氧乙烯類非離子型表面活性劑為好。特別以如下通式所示聚氧乙烯類非離子型表面活性劑最為合適
Rl — R2 — (CH2CH2O)n-H
(在此，Rl是碳原子數10 22的烷基、鏈烯基、炔基、異辛基；R2是一 0 —或一(C6H4) —0 —；n為8 120的整數)。比如可以使用聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鯨蠟醚、聚氧乙烯油酯醚、聚氧乙烯肉豆蘧醚、聚氧乙烯硬脂醚、聚氧乙烯壬基苯酚醚和聚氧乙烯異辛苯酚醚等。其中具體地說以Brij35 (聚氧乙烯(35)月桂醚)為宜。前處理液中的表面活性劑濃度0.1 6% (V / V)為宜，1 5 % (V / V)更好。用后述核酸擴幅法定量mRNA時，該前處理液最好添加二甲亞砜(DMS0)。淋巴結中有時含有阻礙核酸擴幅中的酶反應的物質(阻礙物質)，通過DMSO的作用可以有效地減少阻礙物質的影響。DMSO還有抑制核擴增酶的活性降低的作用。作為前處理液中的DMSO濃度，以I 50% (V / V)為宜，5 30% (V / V)更好，最好是10 25% (v / V)。通過使用上述前處理液，不必使用市場出售的提純試劑盒等進行普遍進行的核酸抽取和提純，就能夠便捷地制備出檢測試樣。
上述標本與前處理液的混合比例沒有特別限定，但對于Img標本可以使用0. 0001、. 005mL的前處理液。關于上述混合過程沒有特別限定，比如可以在室溫下進行標本與前處理液充分混合的時間。在混合標本與前處理液中，最好在前處理液中破碎標本。作為破碎的方法，可以列舉出用均質器均質化、凍結融化等。作為均質器，可使用在該領域中常用的東西，比如韋林氏攪切器、Potter-Elvehjem型均化器、Polytron型均化器、杜恩斯均化器、弗氏壓碎器(French press)和超聲波破碎機等。破碎條件根據使用方法和裝置適當設定即可。用上述方法破碎的破碎液通過離心分離、過濾器過濾、柱層析等一般使用的提純方法進行初提純，即可制備出檢測試樣。根據檢測試樣的狀態，也可用核酸提取法等方法進行再提純。在本發明的一實施方式中，定量檢測試樣中的角蛋白19的mRNA可以用諸如核酸擴增法和DNA芯片等眾所周知的方法。特別推薦使用核酸擴增法。
作為用于定量角蛋白19的mRNA的DNA芯片，可以使用固定了能與角蛋白19的cDNA雜交的多核甙酸及/或其片段的基質。使用DNA芯片檢測RNA可以使用眾所周知的常用方法。比如可以如下進行先利用與存在于檢測試樣中的mRNA3’端的polyA序列結合的引物進行逆轉錄反應。進行逆轉錄反應時，比如使用以Cy3和Cy5等熒光物質標記的核甙酸合成經熒光標記的cDNA。讓該cDNA與上述固定了多核甙酸的基質接觸，則此多核甙酸和被標記的cDNA形成雙鏈。接著，測定cDNA的熒光即可定量角蛋白19的mRNA。作為可用于定量角蛋白19的mRNA的核酸擴增法可以使用在核酸擴增反應前含逆轉錄反應的核酸擴增法、比如RT — PCR (Reverse Transcription PCR)法和RT —LAMP (Reverse Transcription LAMP :關于LAMP法參照美國專利6410278號公報)法等眾所周知的核酸擴增法。更具體地說，可以制備含有上述檢測試樣、能夠檢出角蛋白19的引物和實施核酸擴增法用酶的反應液，用所得反應液進行核酸擴增，測定擴增后的cDNA。在本發明的一實施方式中，引物也可作為引物液、作為一種試劑提供。引物溶液只要含有用以檢測角蛋白19的引物即可，并無特別限定。作為引物溶液，以引物在溶液中穩定、易保存的為宜。在本發明一實施方式中，用于實施核酸擴增法的酶也可以作為酶溶液、作為一種試劑提供。作為酶只要可以實施核酸擴增法即可，并無特別限定。作為酶溶液比如可以使用分別單獨調制RNA依賴型DNA聚合酶(逆轉錄酶)和DNA依賴型DNA聚合酶(以下也稱為DNA聚合酶)制備的酶溶液或既含有逆轉錄酶又含有DNA聚合酶的酶溶液。從反應液調制的簡便性來看，尤以既含有逆轉錄酶又含有DNA聚合酶的酶溶液為宜。逆轉錄反應和核酸擴增反應可以按照引物的序列等適當改變條件。逆轉錄反應和核酸擴增反應的條件可以使用比如Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York上記述的條件。作為用于檢測角蛋白19的引物，如有可擴增角蛋白19的mRNA或cDNA的多核甙酸。其序列無特別限定，具體而言，可以舉出下列序列號所示的引物。另外，序列號I和2所示引物為適于RT - PCR的引物對，序列號5 10所示引物為適于RT — LAMP的引物對。[RT —PCR 的引物]序列號 I :5’-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3，
序列號 2:5，- CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3’
[RT - LAMP的引物]
序列號 5 :5’ -GGAGITCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3’
序列號 6 :5’ -GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGITCG-3’ 序列號 I :5’ -TGGTACCAGAAGCAGGGG-3’
序列號 8 :5’ -GITGATGTCGGCCTCCACG-3’
序列號 9 :5’ -AGAATCTTGTCCCGCAGG-3’
序列號 10 :5’ -CGTCTGGCTGCAGATGA-3’
上述引物也可以用在該技術領域常用的技術進行修飾。上述引物的標記可以用放射活性元素或無放射活性分子進行。所用放射活性同位素可以列舉出32P、33P、35S、3H或125L無放射活性物質可以從生物素、抗生朊、鏈霉親和素或諸如地谷新配質那樣的配體、半抗原、色素和諸如放射線發光性、化學發光性、生物發光性、熒光或磷光性試劑那樣的發光性試劑中選擇。有逆轉錄活性的酶和DNA聚合酶可以使用在該技術領域眾所周知的東西。作為具有逆轉錄活性的酶如有AMV (Avian Myeloblastosis Virus)逆轉錄酶和M — MLV(MolonyMurine Leudemia Virus)逆轉錄酶等。作為DNA聚合酶可以使用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶等。通過測定上述核酸擴增生成的核酸擴增生物即可定量角蛋白19的mRNA。此時，推薦米用定量 RT — PCR (Quantitative Reverse Transcription-PCR)和定量 RT — LAMP(Quantitative Reverse Transcription-LAMP)等。米用這些方法，隨著核酸(cDNA)的擴增，反應液的光學狀態(濁度、吸光度、熒光強度等)會發生變化，因此，實時測定之，即可定量角蛋白19的mRNA。作為RT - PCR的具體例子可以使用眾所周知的方法，比如=Taqman (注冊商標)法和SYBR Green法(嵌合熒光法)預先在核酸擴增反應前的反應液中添加SYBR Green，實時測定擴增反應中隨著cDNA的擴增而增強的熒光強度。角蛋白19的mRNA定量值可以根據反應液的熒光強度達到一定值時所需要的循環數計算出來。使用RT - LAMP時，隨著cDNA的擴增，作為副產品生成大量焦磷酸鎂。此焦磷酸鎂為非溶性，反應液會隨焦磷酸鎂的增加而變濁。因此，通過實時對反應液的濁度(或吸光度)進行光學測定即可定量角蛋白19的mRNA。另外，在RT — LAMP法中也可使用上述SYBRGreen法。角蛋白19的mRNA定量值可以根據反應液的濁度、吸光度、熒光強度等達到一定值所需時間(檢測時間)計算出來。在本發明一實施方式中，作為判斷胃癌淋巴結轉移的步驟，只要是可以根據上述檢測試樣中的角蛋白19mRNA的定量值絕對或相對地判斷胃癌淋巴結轉移即可，并無特別限定，但應該將角蛋白19的mRNA定量值與閾值相比較。角蛋白19的mRNA定量值可以不管有無標準化處理，用于胃癌淋巴結轉移的判斷步驟，但是，最好不進行標準化處理，以角蛋白19的mRNA絕對量作為定量值使用。在此，所謂標準化指將定量上述角蛋白19的mRNA所獲得的定量值換算為與含從胃癌患者身上采集的淋巴結組織的試樣即標本數量相應的值。更具體地說就是指用標本量或反映該量的信息、推薦用內部標準、最好用管家基因的mRNA量或反映該量的信息除以定量上述角蛋白19的mRNA所獲得的定量值。所謂管家基因指一般認為在大多數組織和細胞中都有一定量表達的基因。作為管家基因，可以舉出P —肌動朊、GAPDH (3-磷酸甘油醛脫氫酶)、0 2微球蛋白和HPRTl (次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶I)等基因。所謂反映管家基因的mRNA量的信息指用與角蛋白19同樣的方法定量管家基因時所得信息。在本發明一實施方式中，標本的管家基因的mRNA測定值也可以作為判斷核酸擴增反應是否正確進行的質控品使用，而不用于標準化。管家基因在幾乎各種細胞中均有表達，因此，如果檢測出管家基因的mRNA，就可認為癌標志物的核酸擴增反應也適當進行。另一方面，若沒有檢測出管家基因的mRNA，則可考慮由于酶失活等原因使核酸擴增反應沒有正確進行的可能性。

在本發明一實施方式中，所謂角蛋白19mRNA的絕對量指用于定量mRNA的檢測試樣中的角蛋白19mRNA的絕對量或反映該絕對量的信息。求絕對量時不進行上述標準化。用上述這種絕對量作為定量值，直接與預先設定的閾值進行比較，即可比經標準化步驟更正確地判斷胃癌的淋巴結轉移。過去通過組織診斷判斷癌轉移的方法是先制作組織切片，經染色等處理后進行鏡檢。但是，鏡檢方式的組織診斷只能檢查組織的一部分，一旦在不含癌細胞的部位切片的話，有可能漏過癌細胞。而通過分子檢查判斷癌轉移能夠使用從生物體采集的所有組織標本(或制作切片剩余的組織標本)，因此，與僅憑部分截面檢查的組織診斷不同，漏診的可能較小。在本發明一實施方式中，閾值可以設定為低于已確認有胃癌淋巴結轉移的陽性標本所含m RNA的定量值、高于已確認無胃癌淋巴結轉移的陰性標本所含m RNA的定量值。最好預測數個陽性標本的mRNA定量值和數個陰性標本的mRNA定量值，將能以最高概率識別陽性標本和陰性標本的值設定為閾值。具體而言，當用定量RT-PCR法定量角蛋白質19的mRNA時，閾值設為8飛90個拷貝數為宜，用定量RT — LAMP法定量角蛋白質19的mRNA時，閾值設為10 270個拷貝數為宜。本發明判斷方法的判斷步驟是根據角蛋白19的mRNA定量值判斷上述胃癌淋巴結轉移的。比較角蛋白19的mRNA定量值與閾值，mRNA定量值比閾值高時可以斷定淋巴結轉移為陽性，比閾值低時則斷定為陰性。通過取得這種判斷結果即可作為手術方式、切除范圍和術后治療方針等的決定指標。mRNA定量值根據癌轉移度高低，與轉移灶大小和轉移灶所含癌細胞數量有關。因此，如上所述，根據mRNA定量值可以對淋巴結中的轉移灶進行定量測定和階段性測定。進行階段性測定時，將mRNA定量值與預設的數個閾值作比較。此時，最好至少有一個閾值(第一閾值)設定為可識別癌陰性和癌陽性。這些閾值根據癌和腫瘤標志物種類適當設定。即使在定量測定轉移灶時，也最好先用此第一閾值識別陰性和陽性，再對轉移陽性的病灶進行癌病灶定量測定。在本發明一實施方式中，第一閾值可以設定為低于已確認有癌細胞存在的淋巴結(陽性標本)所含mRNA的定量值、高于已確認無癌細胞存在的淋巴結(陰性標本)所含mRNA的定量值。最好預先測定數個陽性標本的mRNA定量值和數個陰性標本的mRNA的定量值，以能夠概率最高地區分陽性標本和陰性標本的值作為閾值。如要取得上述階段性信息，則除第一閥值外還使用第二閾值。比如預先設定上述第一閾值和可識別弱陽性和強陽性的第二閾值。當mRNA的定量值低于第一閾值時，可判斷實際上不存在癌病灶(即癌陰性)。當mRNA的定量值高于第一閾值、低于第二閾值時，可判斷存在較小癌病灶(癌弱陽性)。當mRNA的定量值高于第二閾值時，可判斷存在較大癌病灶(癌強陽性)。淋巴結轉移按大小分為微轉移(Micro metastasis)和大轉移(Macrometastasis)。轉移灶長邊不足2 mm時稱為微轉移。轉移灶長邊超過2 mm時稱為大轉移。不到0.2mm的轉移灶稱為游離癌細胞(Isolated Tumor Cell:ITC)。一般診斷為大轉移，則需要摘除轉移灶。微轉移則被認為處于無法判斷轉移灶是否會再變大的狀態。在本發明一實施方式中，上述第二閾值可以設定為能識別微轉移灶和大轉移灶的值。除第二閾值以外，還可以根據轉移灶大小設定數個閾值。測定角蛋白19的mRNA的表達量可以測定淋巴結中癌細胞數和癌病灶的尺寸(面積、體積或質量等)。即，淋巴結中的角蛋白19的mRNA表達量可以作為決定胃癌患者摘除淋巴結的范圍的指標。比如，如果檢查的淋巴結沒有大轉移灶，則不必進一步擴大摘除范圍。如果檢查的淋巴結中有大轉移灶，則有必要摘除更大范圍的淋巴結。現在的病理診斷能夠切實檢出的2mm大轉移灶的，從道理上說，淋巴結直徑均為4mm以下。再大的淋巴結就有可能漏檢轉移灶。病理診斷與本發明的方法并用的話就可以降低漏檢轉移灶的可能性。本發明的另一個實施方式胃癌淋巴結轉移判斷裝置包括定量系統，定量用從胃癌患者身上采集的淋巴結組織制備的檢測試樣中的角蛋白19的mRNA ;判斷系統，根據上述mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結轉移。在本發明一實施方式中，對定量系統沒有特別限定，只要能夠從胃癌患者身上采集淋巴結組織制備檢測試樣，定量其中的角蛋白19mRNA即可。作為定量系統推薦能定量經LAMP法和PCR法擴增的核酸的核酸擴增測定裝置。該核酸擴增測定裝置具有測定單元，用引物和核酸擴增酶擴增檢測試樣中的角蛋白19mRNA，測定所得核酸擴增產物。在本發明一實施方式中，對判斷系統無特別限定，只要能夠根據上述定量系統定量的角蛋白19的mRNA定量值絕對或相對地判斷胃癌淋巴結轉移即可。作為判斷系統以通過比較定量值和預設的閾值來判斷癌轉移的為宜。定量值尤以檢測試樣中的上述角蛋白19mRNA的絕對量為宜。此裝置也可具備顯示所得判斷結果的顯示器。在本發明一實施方式中，裝置還具有判斷轉移灶在淋巴結組織中的轉移度的判斷系統，轉移度判斷系統可以與判斷癌轉移的癌轉移判斷系統分設，也可以是將二者功能集于一身的一個裝置。胃癌淋巴結轉移判斷裝置的一實施方式如圖f 3所示。圖I為本發明一實施方式的判斷裝置的整體結構斜視圖。圖2為圖I所示作為定量系統的核酸擴增測定裝置的整體結構斜視圖。圖3為圖2所示核酸擴增測定裝置的平面略圖。本發明某實施方式的判斷裝置如圖I所示，由核酸擴增測定裝置101和與該核酸擴增測定裝置連接能進行有線或無線通信、作為判斷系統的電腦(PC) 102組成。核酸擴增測定裝置101如圖2所示，包括分裝器件10、上樣單元20、吸嘴安裝單元30、吸嘴廢棄單元40、由5個反應檢測塊50a構成的反應檢測單元50和用于向X方向和、Y方向移動分裝器件10的移送器60。分裝器件10如圖2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移動的旋臂11和與旋臂11相對可各自獨立向Z方向(垂直方向)移動的一對(二支)注射器12。如圖2和圖3所示，上樣單元20從裝置前側開始依次有10個試樣管插孔21a 21 j、一個酶試劑容器孔21k和一個引物試劑容器孔211。10個試樣管插孔21a 21 j分5行2列排列。試樣管插孔21c和21d、試樣管插孔21e和21f、試樣管插孔21g和21h、試樣管插孔21i和21j分別從裝置里面向外依次置于上樣位置I、上樣位置2、上樣位置3和上樣位置4。本實施方式中，正面左側的試樣管插孔21c、21e、21g和21i用于插裝有對預先切除的生物組織(淋巴結)進行處理(勻質化、過濾等)制作的溶解提取液(檢測試樣)的試樣管22，正面右側的試樣管插孔21d、21f、21h和21 j插裝有上述試樣稀釋到10倍的稀釋試樣的試樣管23。 試樣管插孔21a用于放置裝陽性質控品的容器24，該陽性質控品用于確認應該擴增的核酸正常擴增；而試樣管插孔21b用于放置裝有陰性質控品的容器25，該陰性質控品用于確認不該擴增的核酸正常未擴增。酶試劑容器插孔21k和引物試劑容器插孔211分別放置裝有用于擴增角蛋白19mRNA相應的cDNA(以下也簡稱為CK19)的核酸擴增酶試劑的酶試劑容器26和裝有CK19引物試劑的引物試劑容器27。反應檢測單元50的各反應檢測塊50a如圖2和圖3所示，由反應部51、二個濁度檢測器52和閉合器件53 (參照圖2)構成。設置于各反應檢測塊50a的反應部51如圖3所示，有二個用于放置檢測池54的檢測池孔51a。各反應檢測塊50a從裝置里側向外依次排列于池位I、池位2、池位3、池位4和池位5。濁度檢測器52由置于反應部51 —側基板55a上的由有465nm波長的蘭色發光二極管組成的發光二極管光源52a和配置于反應部51另一側基板55b上的光電二極管集光器52b構成。各反應檢測塊50a分別配置了由一個發光二極管光源52a和一個光電二極管集光器52b組成一組的濁度檢測器52各二組。檢測池54有裝試樣的二個池54a和蓋二個池54a的二個蓋54b。移送器60如圖2所示，有向Y方向移送分裝器件10的直行向導61和球型螺桿62、驅動球型螺桿62的步進電動機63、向X方向移送分裝器件10的直行向導64和球型螺桿65、驅動球型螺桿65的步進電動機66。向X方向和Y方向移送分裝器件10是靠步進電動機63和步進電動機66分別轉動球型螺桿62和65實現的。電腦102如圖I所示包括輸入設備鍵盤102a和鼠標102b、由監視器組成的顯示器102c以及分析試樣測定結果的CPU102d。下面參照圖f圖3就本實施方式的判斷裝置I的運行過程進行說明。本實施方式的裝置如上所述，用RT - LAMP法對胃癌手術切除的淋巴結組織中的角蛋白19mRNA進行擴增，測定隨著擴增產生的焦磷酸鎂形成的白色沉淀物引起的渾濁度變化，以此定量角蛋白19的mRNA，將定量值與閾值比較，判斷癌細胞向該淋巴結的轉移的情況。下面就這種裝置進行說明。預先對切除組織進行處理(如勻質化、過濾等)，將由此制備的溶解抽取液(以下稱試樣)裝入試樣管22，將該試樣管22插入試樣管插孔21c 21 j (參照圖2及圖3)。將裝有陽性質控品的容器24和裝有陰性質控品的容器25分別插入試樣管插孔21a和21b (參照圖3)。在酶試劑容器孔21k和引物試劑容器孔211分別放入裝有CK19擴增用核酸擴增酶試劑的酶試劑容器26和裝有CK19擴增用引物試劑的引物試劑容器27 (參照圖3)。吸嘴安裝單元30設置2個各自收納36個一次性吸移管吸嘴31的托盤32。核酸擴增測定裝置101 —啟動，首先，分裝器件10的旋臂11被圖2所示移送器60從初始位置移到吸嘴安裝單元30 后，分裝器件10的二個注射器12在吸嘴安裝單元30向下移動。于是，二個注射器12的頂端插入二個吸移管吸嘴31的上部開口處，從而自動裝上吸移管吸嘴31。當二個注射器12向上移動之后，分裝器件10的旋臂11向X方向移動，移向裝有引物試劑的引物試劑容器27的上方。位于引物試劑容器27上方的一個注射器12向下移動，吸移引物試劑后向上移動。分裝器件10的旋臂11被移送器60向Y方向移動，使另一個注射器12同樣位于引物試劑容器27的上方。然后另一個注射器12向下移動，同樣從引物試劑容器27吸移引物試劑后向上移動。如此，引物試劑容器27內的CK19引物試劑被安裝在注射器12上的二個吸移管吸嘴31吸移。引物試劑吸移后，二個注射器12都移到上面，分裝器件10的旋臂11被移送器60移向位于最里面(正對裝置的里側)池位I的反應檢測塊50a上方。在最里面的反應檢測塊50a，二個注射器12向下移動，使裝在二個注射器12的二個吸移管吸嘴31分別插入檢測池54的二個池54a中，再用注射器12將CK19的引物試劑分別注入二個池54a中。引物試劑分裝后，注射器12向上移動。二個注射器12分裝引物試劑后，向上移動，分裝器件10的旋臂11被移送器60向X方向移動，移到吸嘴廢棄單元40的上方。在吸嘴廢棄單元40的上方，吸移管吸嘴31被丟棄。具體而言，二個注射器12向下移動，使吸移管吸嘴31插入吸嘴廢棄單元40的二個吸嘴廢棄孔40a (參照圖3)。在此狀態下，分裝器件10的旋臂11被移送器60向Y方向移動，使吸移管吸嘴31移到槽40b下面，然后向上移動二個注射器12，吸移管吸嘴31上部的緣卡在槽40b下面，受到向下的力，從而吸移管吸嘴31自動脫離二個注射器12的嘴部，這樣，吸移管吸嘴31就被丟棄在吸嘴廢棄單元40。接下來，以同樣的動作酶試劑從酶試劑容器26分注到上述池54a，再以同樣的動作將試樣從試樣管22和試樣管23分注到上述池54a。引物試劑、酶試劑和試樣向上述池54a的吸移動作完成后，檢測池54的蓋54b閉合。當此閉合動作完成后，將檢測池54內的液溫從約20°C加熱到約65°C，通過RT — LAMP反應對CK19mRNA相應的cDNA進行擴增。隨擴增生成的焦磷酸鎂形成白色沉淀物，用比濁法檢測該白色沉淀物。具體而言，用圖3所示發光二極管光源52a和光電二極管集光器52b檢測(監測)擴增反應過程中檢測池54內的濁度，進行濁度檢測。試樣的濁度數據從核酸擴增測定裝置101實時傳送到電腦102。電腦102的CPU102d將試樣濁度與預設閾值進行比較，從而判斷胃癌的淋巴結轉移。在此，還可同時判斷向淋巴結轉移的病灶大小。在此，參照圖4就電腦102的CPU102d的處理過程進行說明。首先，在步驟SI，CPU102d從核酸擴增測定裝置101接收濁度數據。然后在步驟S2，CPU102d比較該濁度數據和預設閾值，以此判斷癌轉移為陽性還是陰性。在步驟S3，CPU102d將步驟S2判斷的結果傳送至顯示器102c。[實施例]
本實施例就通過定量從胃癌患者采集的淋巴結組織中的CK19mRNA來判斷胃癌淋巴結轉移的方法進行說明。實施例I (用定量RT — PCR法判斷胃癌的淋巴結轉移〉
(I)檢測試樣的制備
用組織學上認為有胃癌轉移的淋巴結(陽性淋巴結)10個和組織學上診斷為沒有胃癌轉移的淋巴結(陰性淋巴結)10個如下制備檢測試樣。在各淋巴結(約50 600mg/個)中添加4mL含DMS0、pH3. 4的處理液(含200mM甘氨 酸一 HCI、5% Brij35 (聚氧乙烯(35)十二醇，希格瑪公司生產)和20%DMS0 (和光純藥制))，用攪拌機勻質化。將所得勻質液以10，000X g、室溫下離心分離I分鐘，用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN公司制，產品號74014)從200 y L上清中提取、純化RNA，得檢測試樣。(2 )定量 CK19 的 mRNA
對如上從陽性淋巴結和陰性淋巴結制備的檢測試樣，采用實時PCR裝置(ABI PRISM(注冊商標)7000型熒光定量PCR儀，應用生物系統公司)用以下引物進行實時RT — PCR反應，定量CK19的mRNA。實時RT — PCR 使用 RT — PCR 試劑盒一Quanti Tect SYBR Green RT-PCR 試劑盒(QIAGEN公司制，產品號204245)按照使用說明書進行，反應液的組成和反應條件如下
用于檢測CK19的引物
上游引物5’ -CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3’(序列號 I)
下游引物5’ -CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3’(序列號 2)
反應液
RNase free H2O11. I U L
2Xmastermix12. 50 u L
10011] 上游引物(最終濃度50011]\00. 075 u L
10011] 下游引物(最終濃度50011]\00. 075 u L
QuantiTect RTmix0. 25 u L
檢測試樣_I. OOu L
合計25. OOu L
反應條件
50 0C >30 分鐘95°C、15 分鐘
PCR :以下工序重復40周期；
95。。、15 秒
530C >30 秒72 0C >30 秒。求反應液熒光強度超過閾值(Threshold :上述實時PCR儀配備的SDS軟件自動設定的值)時的PCR周期數，根據此PCR周期數算出mRNA拷貝數。結果如圖5所示。從圖5的結果得知，通過將閾值設定為每個檢測試樣350個拷貝數，即可對胃癌轉移得出與組織診斷的結果一致的判斷。實施例2
測定上述檢測試樣中P —肌動朊的mRNA的量作為管家基因。測定方法同實施例I中對CK19的mRNA的測定。用于PCR的引物如下
用于檢測P —肌動朊的引物
上游引物5’ -CCACACTGTGCCCATCTACG-3’(序列號 3 )
下游引物5’ -AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3’(序列號 4)
用在此所得P —肌動朊mRNA的拷貝數除以實施例I所得CK19的mRNA拷貝數(進行標準化)，結果如圖6所示。從圖6的結果可以看出，用作為管家基因的P —肌動朊mRNA 的拷貝數除以CK19的mRNA拷貝數，進行標準化，也可判斷胃癌的淋巴結轉移。從實施例I和2的結果可以看出，根據定量RT - PCR法定量CK19mRNA所得定量值可以判斷胃癌淋巴結轉移。并得知，定量值以CK19mRNA的絕對量更能明確區分陽性標本和陰性標本。實施例3 (用定量RT — LAMP法診斷胃癌的淋巴結轉移〉
(I)檢測試樣的制備
用組織學上診斷為有胃癌轉移的淋巴結(陽性淋巴結)7個和組織學上診斷為沒有胃癌轉移的淋巴結(陰性淋巴結)8個，如下制備檢測試樣。在各淋巴結(約50 600mg/個)中添加4mL含DMS0、pH3. 4的處理液(含200mM甘氨酸一 HCI、5% Brij35 (聚氧乙烯(35)十二醇，希格瑪公司生產)和20%DMS0 (和光純藥制))，用攪拌機勻質化。將所得勻質液以10，000X g、室溫下離心分離I分鐘，在20 ii L上清液中添加180 ii L處理液，得200 u L檢測試樣。(2)反應液的制備
混合以下各成份，制備13. 97uL的反應液。750mM TRIS 緩沖液(pH8. 0)I. OOu I
10 X Thermopol 緩沖液(新英格蘭 bioLaboratorie 公司生產)2. 50 U I IOmM dNTPs2.00U I
IOOmM MgSO40. 75 u I
IOOmM 二硫蘇糖醇I. 25 ill
2% Tergitol (Sigma Aldrich Japan 公司制) 2. 50 u I H2O3. 97 u I
(3)酶試劑的制備
混合以下成份制備3. 04y L的酶試劑。IOU/ u I AMV逆轉錄酶(普洛麥格公司制)0.14iil8U/ u I Bst DNA 聚合酶(新英格蘭 bioLaboratorie2. 27 U IRNase inhibitor (普洛麥格公司制) 0. 63 y I
(4)引物的制備
混合以下成份制備6. OOy L的引物溶液。80pmol/ii I 上游內引物LOOiU
(序列號 5 :5’ -GGAGITCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3’ )
權利要求
1.一種胃癌淋巴結轉移判斷裝置，包括 安裝有收納檢測試樣的容器的反應檢測單元，用于檢測擴增反應后檢測試樣的熒光，其中所述檢測試樣包括用疑有胃癌轉移的淋巴結組織制備的試樣和擴增與角蛋白19的mRNA相應的cDNA的試劑； 電腦，用于接收所述反應檢測單元檢測出的熒光數據，根據所接收的熒光數據定量角蛋白19的mRNA，根據所得mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結轉移；其中， 所述電腦將所得的mRNA的定量值與第一閾值和第二閾值比較，當所述mRNA的定量值低于第一閾值時，判斷不存在胃癌病灶，當所述mRNA的定量值高于第一閾值、低于第二閾值時，判斷存在胃癌的淋巴結微轉移灶，當所述mRNA的定量值高于第二閾值時，判斷存在胃癌的淋巴結大轉移灶。
2.根據權利要求I所述的裝置，其特征在于所述mRNA的定量值是所述檢測試樣中的所述角蛋白19的mRNA的絕對量。
3.根據權利要求I所述的裝置，其特征在于所述試劑包括含能檢出角蛋白19的引物的引物溶液以及含用于實施核酸擴增法的酶的酶溶液。
4.根據權利要求3所述的裝置，其特征在于所述酶溶液含有RNA依賴型DNA聚合酶和DNA依賴型DNA聚合酶。
全文摘要
本發明提供一種胃癌淋巴結轉移判斷裝置，包括安裝有收納檢測試樣的容器的反應檢測單元，用于檢測擴增反應后檢測試樣的熒光，其中所述檢測試樣包括用疑有胃癌轉移的淋巴結組織制備的試樣和擴增與角蛋白19的mRNA相應的cDNA的試劑；電腦，用于接收所述反應檢測單元檢測出的熒光數據，根據所接收的熒光數據定量角蛋白19的mRNA，根據所得mRNA的定量值判斷胃癌的淋巴結轉移；其中，所述電腦將所得的mRNA的定量值與第一閾值和第二閾值比較，當所述mRNA的定量值低于第一閾值時，判斷不存在胃癌病灶，當所述mRNA的定量值高于第一閾值、低于第二閾值時，判斷存在胃癌的淋巴結微轉移灶，當所述mRNA的定量值高于第二閾值時，判斷存在胃癌的淋巴結大轉移灶。
文檔編號C12M1/34GK102719358SQ201210257059
公開日2012年10月10日 申請日期2008年1月10日 優先權日2007年1月15日
發明者中林一樹, 大友泰裕, 檜山佳代, 高田英基 申請人:希森美康株式會社