專利名稱：利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種互交種的鑒定方法，尤其是一種利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法。
背景技術(shù)：
玉米是我國乃至世界上重要的糧飼作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。玉米能否正常生產(chǎn)關(guān)系著我國糧食生產(chǎn)安全。種子純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是種子分級(jí)的主要依據(jù)。生產(chǎn)上造成玉米種子純度降低的主要原因較多隔離條件不充分、母本去雄去雜不徹底以及收獲時(shí)的機(jī)械混雜等[薛艷穎，陳興奎，樊嚴(yán)，陳小丹.SSR分子標(biāo)記 技術(shù)在雜交玉米種子純度鑒定中的應(yīng)用.雜糧作物，2007，27(1) : 6-7]。由此產(chǎn)生的種子混雜方式也多種多樣,包括親本自交種的混雜、其他品種的混雜及正交種、反交種的混雜等。傳統(tǒng)品種純度的檢驗(yàn)方法主要依賴于品種的形態(tài)特征、生理特性及同工酶等指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)越來越廣泛的應(yīng)用于品種純度檢測(cè)，國家和一些地方也相繼出臺(tái)了玉米品種純度及真實(shí)性的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，為玉米種子純度的分子檢測(cè)提供了標(biāo)準(zhǔn)。玉米互交種是由兩個(gè)不同的玉米親本自交系以相反的交配順序得到的，正交與反交是相對(duì)的，指定一種交配順序獲得的雜交種為正交種，則相反的交配順序獲得的雜交種為反交種。一般的正、反交種的表現(xiàn)型沒有差異，但是對(duì)于受細(xì)胞質(zhì)基因控制的母性遺傳性狀，正交種與反交種會(huì)表現(xiàn)出顯著差異。盡管受母本控制的部分性狀可作為形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)部分互交種進(jìn)行鑒定，但是利用分子標(biāo)記鑒定是從根本上實(shí)現(xiàn)互交種判定的可靠方法。現(xiàn)行的玉米品種純度的分子標(biāo)記檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不能對(duì)互交種的混雜進(jìn)行區(qū)分，主要原因在于該檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是建立在不同玉米品種基因組成是有差異的基礎(chǔ)之上的。由于互交種的基因均來自相同的親本，因此，互交種含有相同的基因，基因組之間不存在質(zhì)的差異。因此，如果從DNA水平上對(duì)互交種進(jìn)行判定，只能從基因劑量的角度進(jìn)行挖掘。玉米胚乳是一個(gè)精子和兩個(gè)極核融合后發(fā)育形成的組織，基因組含有兩個(gè)拷貝的母本基因及一個(gè)拷貝的父本基因，來自母本與父本的等位基因具有二倍劑量關(guān)系，可以此作為利用分子標(biāo)記區(qū)分互交種的基礎(chǔ)。Insertion/Deletion(InDel)標(biāo)記作為一種有應(yīng)用前景的遺傳標(biāo)記得到了研究者的關(guān)注[Dinakar B，Maureen D, Mike H，Robin ff, Dave V, James C R, Scott V T,Antoni R. Insertion-deletion polymorphisms in 3' regions of maize genes occurfrequently and can be used as highly informative genetic markers. Plant MolBiol, 2002，48: 539-547]。盡管玉米品種純度鑒定主要利用SSR分子標(biāo)記[李曉輝，李新海，李文華，王振華，馬鳳鳴，袁力行，張世煌.SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測(cè)定中的應(yīng)用.作物學(xué)報(bào)，2003，29(1) : 63- 68;張華生，王鳳格，趙久然，易紅梅，李瑞媛，楊國航，王璐.利用形態(tài)性狀和SSR標(biāo)記進(jìn)行玉米品種的特異性鑒定.玉米科學(xué)，2011，19(3) : 51- 55]，但I(xiàn)nDel標(biāo)記用于玉米品種純度分析已有報(bào)道[張?bào)w付，葛敏，韋玉才，趙涵.玉米功能性Insertion/Deletion (InDel)分子標(biāo)記的挖掘及其在雜交種純度鑒定中的應(yīng)用.玉米科學(xué)，2012，20(2): 64-68]。目前，InDel較多用于基因組多態(tài)性的評(píng)價(jià)[馮芳君，羅利軍，李熒，周立國，徐小艷，吳金紅，陳宏偉，陳亮，梅捍衛(wèi).水稻InDel和SSR標(biāo)記多態(tài)性的比較分析.分子植物育種，2005，3(5): 725- 730;申璐，沈火林，柴敏，王銀磊，楊文才.釆用InDel和SSR標(biāo)記分析番茄品種基因組DNA多態(tài)性.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16(2):34- 42]，未見用于互交種判定的研究。玉米基因組中存在大量的InDel多態(tài)，據(jù)估計(jì)每309bp就有一個(gè)InDel [VrohB I， McMullen M, Sanchez-Villeda H， Schroeder S， Gardiner J， Schaeffer M，Soderlund C，Wing R，F(xiàn)ang Z，Coe J E. Single nucleotide polymorphisms andinsertion-deletions for genetic markers and anchoring the maize fingerprintcontig physical map. Crop Sci, 2006，46: 12-21]。隨著玉米基因組測(cè)序及重測(cè)序工作的完成，玉米InDel多態(tài)性標(biāo)記得到了更快的發(fā)展[Schnable P S，Ware D, Fulton R S，Schnable P S，Ware D，F(xiàn)ulton R S，Stein J C，Wei F S，Pasternak S，Liang C Z，Zhang J W, Fulton L，Graves T A，Minx P，Reily A D，Courtney L，Kruchowski SS, Tomlinson C， Strong C， Delehaunty K， Fronick C， Courtney B， Rock S M， BelterE, Du Fj Kim K，Abbott R M，Cotton M，Levy A，Marchetto P，Ochoa K，Jackson SM, Gillam B，Chen W, Yan L，Higginbotham J，Cardenas M，Waligorski J，ApplebaumE, Phelps L, Falcone J，Kanchi K，Thane T，Scimone A，Thane N，Henke J，WangT, Ruppert J，Shah N，Rotter K，Hodges J，Ingenthron E，Cordes M，Kohlberg S，Sgro J，Delgado B，Mead K，Chinwalla A，Leonard S，Crouse K，Collura K，KudrnaD, Currie J，He R，Angelova A，Rajasekar S，Mueller T，Lomeli R，Scara G，KoA， Delaney K， Wissotski M， Lopez G， Campos D， Braidotti M， Ashley E， Golser W,Kim H, Lee S，Lin J，Dujmic Z，Kim W, Talag J，Zuccolo A，F(xiàn)an C，Sebastian A，Kramer M，Spiegel L，Nascimento L，Zutavern T，Miller B，Ambroise C，Muller S，Spooner W, Narechania A，Ren L，Wei S，Kumari S，F(xiàn)aga B，Levy M J，McMahan L，Buren P V，Vaughn M W, Ying K，Yeh C，Emrich S J，Jia Y，Kalyanaraman A，HsiaA，Barbazuk W B，Baucom R S，Brutnell T P，Carpita N C，Chaparro C，Chia J，Deragon J，Estill J C，F(xiàn)u Y，Jeddeloh J A，Han Y，Lee H，Li P，Lisch D R，LiuS, Liu Z, Nagel D H，McCann M C，SanMiguel P，Myers A M，Nettleton D，NguyenJ，Penning B W, Ponnala L，Schneider K L，Schwartz D C，Sharma A，Soderlund C，Springer N M，Sun Q，Wang H，Waterman M，Westerman R，Wolfgruber T K，Yang L，YuY, Zhang L，Zhou S，Zhu Q，Bennetzen J L，Dawe R K，Jiang J，Jiang N，Presting GG, Wessler S R，Aluru S，Martienssen R A，Clifton S W, McCombie W R，Wing R A，Wilson R K. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science,2009，326: 1112-1115 ； Lai J S, Li R Q，Xu X，JinW W, Xu M M，Zhao H N，Xiang ZK, Song W B, Ying K，Zhang M，Jiao Y P，Ni P X，Zhang J G，Li D，Guo X S，Ye KX，Jian M, Wang B，Zheng H S，Liang H Q，Zhang X Q，Wang S C，Chen S J，Li J S，F(xiàn)u Y, Springer N M，Yang H M，Wang J，Dai J R，Schnable P S，Wang J. Genome-widepatterns of genetic variation among elite maize inbred lines. Nat Genet, 2010，、42(11) : 1027-1030]。InDel標(biāo)記多態(tài)是一種擴(kuò)增片段長度多態(tài)，從幾個(gè)堿基對(duì)到幾十個(gè)堿基對(duì)甚至上百個(gè)堿基對(duì)不等。對(duì)于差異較大的InDel標(biāo)記的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳即可分辨出長度差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)目前現(xiàn)行的分子標(biāo)記檢測(cè)玉米品種純度方法不能對(duì)玉米互交種進(jìn)行鑒定的問題，提供一種利用InDel分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于 提取玉米待檢互交種胚乳、葉片及其親本葉片DNA，提取的DNA樣本測(cè)定濃度并用瓊脂糖凝膠檢測(cè)質(zhì)量；
根據(jù)待檢互交種親本全基因組序列及基因組二代測(cè)序序列存在的差異發(fā)展InDel標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增，篩選出親本葉片DNA之間存在共顯性差異的InDel標(biāo)記；
以互交種葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)瓊脂糖凝膠電泳條帶進(jìn)行圖像識(shí)別以分析等位基因擴(kuò)增質(zhì)量，識(shí)別圖像曲線圓滑、波峰波谷獨(dú)立且互交種等位基因識(shí)別圖像一致的共顯性InDel標(biāo)記被確定為鑒定互交種的分子標(biāo)記。利用確定的共顯性InDel標(biāo)記對(duì)待檢互交種胚乳及葉片DNA進(jìn)行同一批次PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)為處于指數(shù)擴(kuò)增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴(kuò)增條帶的PCR循環(huán)數(shù)；
對(duì)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行定量分析，獲得待檢互交種葉片及胚乳DNA等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值，通過XA’/Xa’=2In / 5;或xA’/xa’=o. 5 X, / 5;獲得正交種或反交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值(x；/x；分別為正交種或反交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值, / I為同一批次互交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值重復(fù)間的平均值)；
利用卡方測(cè)驗(yàn)對(duì)待檢互交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值與其理論值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算概率八若實(shí)測(cè)值與正交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值的統(tǒng)計(jì)概率P>Q. 05且與反交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值的統(tǒng)計(jì)概率/7 ^0. 05,則判定為正交種，反之則為反交種。在本發(fā)明中，共顯性InDel分子標(biāo)記是這樣獲得的二代原始序列經(jīng)過整理后，刪除在另一親本全基因組序列中對(duì)應(yīng)多個(gè)位點(diǎn)的二代測(cè)序序列，再根據(jù)InDel差異發(fā)展標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，篩選親本基因組間存在共顯性差異的InDel標(biāo)記。在本發(fā)明中，所述的待檢互交種胚乳及葉片DNA進(jìn)行同一批次PCR擴(kuò)增是指利用相同的InDel標(biāo)記對(duì)待檢互交種胚乳及葉片DNA同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)體系配制時(shí)采用統(tǒng)一混合然后分裝的方法，即根據(jù)總反應(yīng)量先混合除DNA模板以外的所有PCR組分形成PCR反應(yīng)混合液，然后按照待檢互交種胚乳及葉片DNA模板的樣本量分裝PCR反應(yīng)混合液，在分裝的混合液里加入相應(yīng)的待檢互交種胚乳或葉片DNA模板形成完整的PCR反應(yīng)體系，將完整的PCR反應(yīng)體系分裝為若干重復(fù)即可在同一臺(tái)PCR儀器上以相同的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可使同一標(biāo)記在互交種葉片DNA及互交種胚乳DNA中等位基因擴(kuò)增效率保持穩(wěn)定，即可利用互交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量獲得互交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值。在本發(fā)明中，所述的PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)為處于指數(shù)擴(kuò)增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴(kuò)增條帶的PCR循環(huán)數(shù)是指對(duì)相應(yīng)標(biāo)記以不同的循環(huán)數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)隨著循環(huán)數(shù)的增加擴(kuò)增條帶的亮度逐漸增強(qiáng)，則該P(yáng)CR階段處于指數(shù)擴(kuò)增期，以該階段在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴(kuò)增條帶的PCR循環(huán)數(shù)作為鑒定玉米互交種的PCR循環(huán)數(shù)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
本發(fā)明采用互交種胚乳DNA作為PCR反應(yīng)模板，胚乳DNA等位基因劑量關(guān)系為嚴(yán)格的 二倍關(guān)系，不會(huì)因?yàn)榧訕拥恼`差發(fā)生改變。本發(fā)明利用的InDel標(biāo)記可以通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，相比于SSR標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)法操作簡便，成本更低。本發(fā)明以PCR指數(shù)擴(kuò)增期為鑒定時(shí)期，可確保PCR反應(yīng)初始模板量與終產(chǎn)物量具有線性關(guān)系。本發(fā)明在PCR反應(yīng)體系配制過程中采用統(tǒng)一混合然后分裝的方法。這種操作可以最大程度的保證相同PCR條件下同一標(biāo)記在互交種葉片DNA及互交種胚乳DNA中等位基因擴(kuò)增效率保持穩(wěn)定，使互交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值與互交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值建立關(guān)系。本發(fā)明適應(yīng)性廣，可用于其它能夠獲得InDel標(biāo)記的作物互交種鑒定。本發(fā)明的鑒定結(jié)果不受環(huán)境的影響，可以早期對(duì)互交種進(jìn)行鑒定。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例中親本間InDel標(biāo)記的篩選(奇數(shù)泳道對(duì)應(yīng)的親本為Mol7，偶數(shù)泳道對(duì)應(yīng)的親本為B73)；
圖2共顯性標(biāo)記在互交種葉片DNA中的擴(kuò)增(波形圖右上角的數(shù)字與瓊脂糖凝膠電泳泳道相對(duì)應(yīng)，顯示了相應(yīng)標(biāo)記在等位基因間的擴(kuò)增質(zhì)量。波形圖下面的數(shù)字為對(duì)應(yīng)的標(biāo)記編號(hào))。圖3共顯性標(biāo)記在不同PCR循環(huán)數(shù)下的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(M為IOObp DNAladder,泳道對(duì)應(yīng)的數(shù)字為相應(yīng)的PCR循環(huán)數(shù))。圖4標(biāo)記81對(duì)互交種樣本的鑒定(泳道1，2分別為標(biāo)記81在親本B73，Mol7中的擴(kuò)增條帶；波形圖中的數(shù)字與泳道數(shù)字對(duì)應(yīng)；左右兩條波峰分別為來自B73，Mol7的等位基因擴(kuò)增后ImageJ的識(shí)別圖像)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例是利用玉米自交系B73、Mol7作為親本及雜交的互交種為材料，本發(fā)明是基于對(duì)所述的互交種進(jìn)行鑒定的。材料與方法
I.I材料
供試材料為玉米自交系B73、Mol7、正交種B73XMol7 (BM)及反交種Mol7XB73(MB)。提取B73、Mol7、BM、MB葉片DNA以及BM、MB胚乳(各5個(gè)樣本)DNA提取按照Karroten植物基因組DNA提取試劑盒(南京塞吉科技有限公司)相關(guān)步驟操作，提取的DNA樣本測(cè)定濃度并用0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)質(zhì)量。擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電 泳
PCR 反應(yīng)體積為 25 u I，其中含 2 mmol I71 MgCl2, 100 u mo I I71 dNTP ,0.2 u mol I71引物，I U Taq酶，50 Ug模板DNA，上覆20 U L礦物油。反應(yīng)在2720 Thermal cycler型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行。熱循環(huán)程序?yàn)?4 °C 3 min ；94 V 40 s, 58 V 40 s, 72 V40 S，37個(gè)循環(huán)；72 V 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5 Ug mF1 )上以80 V電壓電泳45 min,紫外透射儀上觀察結(jié)果并拍照。電泳條帶的定量分析
電泳條帶的定量分析由ImageJ公共圖像處理軟件完成。將要分析的電泳圖片進(jìn)行校正后，利用軟件的長型框工具選定要分析的區(qū)域，軟件以波形圖的形式顯示選定區(qū)域的影像強(qiáng)度，突出的波峰對(duì)應(yīng)的區(qū)域即為目標(biāo)條帶區(qū)，通過直線工具將波形圖的目標(biāo)條帶區(qū)與非條帶區(qū)分開，選擇該軟件的魔術(shù)棒工具點(diǎn)擊目標(biāo)波形區(qū)即可通過計(jì)算該區(qū)域面積得出電泳條帶的強(qiáng)度。分子標(biāo)記的開發(fā)與篩選
本研究所用的分子標(biāo)記為自主開發(fā)的Insertion/Deletion (InDel)標(biāo)記。第二版B73全基因組序列從www. maizesequence. org網(wǎng)站上下載獲得，Mol7 二代序列分別來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)和美國JGI-D0E。Mol7 二代原始序列經(jīng)過Q20標(biāo)準(zhǔn)過濾后用BWA軟件處理并利用SAMtool對(duì)結(jié)果進(jìn)行整理。在分析過程中刪除了可在B73基因組上對(duì)應(yīng)多個(gè)位點(diǎn)的Mol7二代原始序列。引物設(shè)計(jì)由emboss軟件包中eprimer3完成。開發(fā)的InDel標(biāo)記在B73、Mol7間進(jìn)行比較，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、無非特異性擴(kuò)增的共顯性標(biāo)記用于后續(xù)分析。互交種胚乳等位基因相對(duì)定量原理
PCR反應(yīng)方程為X=Xtl(1+Ex)n。其中，n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)；X為第n次循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物A為初始模板量；Ex為擴(kuò)增效率。當(dāng)Ex=I時(shí)為理想的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在實(shí)際的操作中很難達(dá)到理想水平。假定玉米雜交種親本中某一位點(diǎn)的一對(duì)等位基因分別為A、a，對(duì)于某一引物來說這對(duì)等位基因的PCR反應(yīng)方程分別為Xa =Xao(I+Ea)\Xa =Xa0(l+Ea)no其中，XA、Xa分別為等位基因A、a第n次循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物量；XA(I、Xa0分別為等位基因A、a的初始模板量；Ea、Ea分別為等位基因A、a擴(kuò)增效率。在PCR指數(shù)擴(kuò)增期階段，等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)量與初始模板量具有線性關(guān)系。由于雜交種葉片中等位基因A、a的初始模板相對(duì)量Xaci :Xa(l=l，可由第n次循環(huán)后等位基因擴(kuò)展產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值推測(cè)該引物在等位基因間的擴(kuò)增效率的關(guān)系(1+￡4)7(1+￡〕1^4/\。若正交種胚乳基因型為44&，反交種胚乳基因型為aaA，則正交種胚乳等位基因的劑量關(guān)系為A a=2 (即胚乳初始模板相對(duì)量Xaci Xa0=2)，反交種胚乳等位基因的劑量關(guān)系A(chǔ) :a=0. 5 (即胚乳初始模板相對(duì)量Xaci :Xa(l=0. 5)。對(duì)于同一弓丨物相同批次的以雜交種葉片DNA及胚乳DNA為模板的PCR反應(yīng)，由于反應(yīng)條件一致，雜交種葉片及胚乳基因組等位基因的擴(kuò)增效率關(guān)系能夠最大限度地保持穩(wěn)定。因此，第n次循環(huán)后雜交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值與雜交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值即可建立如下關(guān)系正交種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值XA’/Xa’=2X,
八力葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值Xa/^同一批次樣品重復(fù)間的平均值)；反交種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值XA’/Xa’=0. 5 m互交種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論
值與其實(shí)測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，若理論值與實(shí)測(cè)值無顯著性差異，則判定為正交種或反交種。統(tǒng)計(jì)分析
利用卡方(X2)測(cè)驗(yàn)對(duì)互交種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值與其實(shí)測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算概率凡若實(shí)測(cè)值與正交種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值的統(tǒng)計(jì)/^>0. 05且與反交種等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值的統(tǒng)計(jì)/7 < 0. 05，則判定為正交種，反之則為反交種。二結(jié)果與分析
2.I InDel分子標(biāo)記的開發(fā)與共顯性標(biāo)記的篩選 經(jīng)過分析，B73、Mol7之間約11 400個(gè)長度小于IOObp的InDel位點(diǎn)(深度>3)可以進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)。為了便于發(fā)展的標(biāo)記進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，從中剔除了長度小于20bp的InDel,選取了部分長度大于20bp的InDel位點(diǎn)發(fā)展標(biāo)記。對(duì)新發(fā)展的143對(duì)InDel標(biāo)記通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，其中118對(duì)引物可以清晰地揭示B73與Mo 17 DNA之間的多態(tài)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)測(cè)大小完全吻合。根據(jù)B73基因組序列對(duì)新發(fā)展的標(biāo)記進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)InDel長度多在20bp 80bp之間，PCR產(chǎn)物長度在141bp 361bp之間。從中選取8個(gè)B73、Mol7間特異擴(kuò)增的共顯性InDel標(biāo)記(圖1)，用于互交種BM及MB葉片基因組等位基因的擴(kuò)增，驗(yàn)證標(biāo)記在互交種葉片基因組等位基因的擴(kuò)增質(zhì)量(圖2)。標(biāo)記在等位基因間的擴(kuò)增質(zhì)量由ImageJ圖像軟件生成的波形圖判定，擴(kuò)增質(zhì)量高的引物的波形圖應(yīng)具有兩個(gè)特征1)波形圖曲線圓滑且波峰波谷獨(dú)立，便于準(zhǔn)確確定擴(kuò)增主帶區(qū)間；2)互交種等位基因波形圖一致，顯示了標(biāo)記在互交種等位基因間擴(kuò)增的穩(wěn)定性。圖2中標(biāo)記18的波峰波谷區(qū)分不明顯，標(biāo)記54的波形圖出現(xiàn)了明顯的鋸齒狀，曲線不夠圓滑。因此，這兩個(gè)標(biāo)記會(huì)影響到定量的準(zhǔn)確性。其余6個(gè)共顯性標(biāo)記擴(kuò)增穩(wěn)定，波形圖符合定量要求，擴(kuò)增產(chǎn)物長度介于117bp-301bp之間，InDel大小介于43bp_143bp之間(表I),用于后續(xù)分析。表I篩選的共顯性InDel標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物信息
權(quán)利要求
1.一種利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法，包括，提取玉米待檢互交種DNA，提取的DNA樣本測(cè)定濃度并用瓊脂糖凝膠檢測(cè)質(zhì)量；根據(jù)待檢親本全基因組序列及基因組二代測(cè)序序列存在的差異發(fā)展InDel標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增，篩選出親本葉片DNA之間存在共顯性差異的InDel標(biāo)記，其特征在于 a、提取玉米待檢互交種胚乳、葉片及其親本葉片DNA，提取的DNA樣本測(cè)定濃度并用瓊脂糖凝膠檢測(cè)質(zhì)量； b、根據(jù)待檢互交種親本全基因組序列及基因組二代測(cè)序序列存在的差異發(fā)展InDel標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增，篩選出親本葉片DNA之間存在共顯性差異的InDel標(biāo)記； C、以互交種葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)瓊脂糖凝膠電泳條帶進(jìn)行圖像識(shí)別以分析等位基因擴(kuò)增質(zhì)量，識(shí)別圖像曲線圓滑、波峰波谷獨(dú)立且互交種等位基因識(shí)別圖像一致的共顯性InDel標(biāo)記被確定為鑒定互交種的分子標(biāo)記； d、利用確定的共顯性InDel標(biāo)記對(duì)待檢互交種胚乳及葉片DNA進(jìn)行同一批次PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)為處于指數(shù)擴(kuò)增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴(kuò)增條帶的PCR循環(huán)數(shù)； e、對(duì)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行定量分析，獲得待檢互交種葉片及胚乳DNA等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值，并由葉片DNA等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值獲得胚乳DNA等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值，當(dāng)XA’/Xa’=2X, / X時(shí)獲得正交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值，當(dāng)XA’/Xa’=0. 5 Xh / X時(shí)獲得反交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值，式中 x；/x；分別為正交種或反交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值； 1./5;為同一批次互交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值重復(fù)間的平均值； f、利用卡方測(cè)驗(yàn)對(duì)待檢互交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的實(shí)測(cè)值與其理論值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算概率八若實(shí)測(cè)值與正交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值的統(tǒng)計(jì)概率產(chǎn)>0. 05且與反交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值的統(tǒng)計(jì)概率/7 < 0. 05，則判定為正交種，反之則為反交種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法，共顯性InDel分子標(biāo)記是這樣獲得的二代原始序列經(jīng)過整理后，刪除在另一親本全基因組序列中對(duì)應(yīng)多個(gè)位點(diǎn)的二代測(cè)序序列，再根據(jù)InDel差異發(fā)展標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，篩選親本基因組間存在共顯性差異的InDel標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于，所述的待檢互交種胚乳及葉片DNA進(jìn)行同一批次PCR擴(kuò)增是指利用相同的InDel標(biāo)記對(duì)待檢互交種胚乳及葉片DNA同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)體系配制時(shí)采用統(tǒng)一混合然后分裝的方法，即根據(jù)總反應(yīng)量先混合除DNA模板以外的所有PCR組分形成PCR反應(yīng)混合液，然后按照待檢互交種胚乳及葉片DNA模板的樣本量分裝PCR反應(yīng)混合液，在分裝的混合液里加入相應(yīng)的待檢互交種胚乳或葉片DNA模板形成完整的PCR反應(yīng)體系，將完整的PCR反應(yīng)體系分裝為若干重復(fù)即可在同一臺(tái)PCR儀器上以相同的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可使同一標(biāo)記在互交種葉片DNA及互交種胚乳DNA中等位基因擴(kuò)增效率保持穩(wěn)定，即可利用互交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值獲得互交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量的理論值。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于，所述的PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)為處于指數(shù)擴(kuò)增期且在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴(kuò)增條帶的PCR循環(huán)數(shù)是指對(duì)相應(yīng)標(biāo)記以不同的循環(huán)數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)隨著循環(huán)數(shù)的增加擴(kuò)增條帶的亮度逐漸增強(qiáng)，則該P(yáng)CR階段處于指數(shù)擴(kuò)增期，以該階段在瓊脂糖凝膠上能夠清晰表現(xiàn)擴(kuò)增條帶的PCR循環(huán)數(shù)作為鑒定玉米互交種的PCR循環(huán)數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用分子標(biāo)記鑒定玉米互交種的方法，其特征在于提取玉米待檢互交種胚乳、葉片及親本葉片DNA；根據(jù)親本基因組序列差異發(fā)展InDel標(biāo)記并篩選親本間共顯性標(biāo)記；分析互交種葉片DNA等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量確定鑒定玉米互交種的分子標(biāo)記；摸索標(biāo)記的PCR指數(shù)擴(kuò)增期及在瓊脂糖凝膠上清晰表現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)數(shù)，對(duì)互交種胚乳及葉片DNA進(jìn)行同一批次擴(kuò)增；定量分析電泳條帶獲得互交種葉片及胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值；由互交種葉片等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值獲得胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量理論值；利用卡方測(cè)驗(yàn)對(duì)待檢互交種胚乳等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)量實(shí)測(cè)值與理論值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算概率P，對(duì)互交種進(jìn)行判定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747163SQ201210256500
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者張?bào)w付, 蔣璐, 趙涵 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院