專利名稱：小鼠肝竇內皮細胞的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種小鼠肝細胞的提取方法，具體地指一種小鼠肝竇內皮細胞的提取方法。
背景技術：
肝竇內皮細胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cells)屬于肝臟中的非實質性細胞，在肝臟中起到屏障、物質代謝、超濾內吞，抗原呈遞等作用。近年來國內外學者對肝竇內皮細胞分離方法進行了大量的研究，但要獲得純度高，細胞活性好，功能穩定的肝竇內皮細胞仍很困難，尤其是小鼠肝竇內皮細胞。由于小鼠品系豐富，可以更充分的滿足各類研究的需要，所以獲得細胞活性好的小鼠肝竇內皮細胞具有重要意義。目前，小鼠肝竇內皮細胞采用以下三種提取方法兩步原位灌流結合密度梯度離·心法、機械分離結合酶消化及密度離心法、免疫磁珠分選及流式分選法。兩步原位灌流結合密度梯度離心法主要集中于大鼠，由于技術條件的限制，較少應用于小鼠的肝竇內皮細胞分離，且該方法無法將肝竇內皮細胞和枯否細胞(kupffer cells)分離，導致最終獲得的細胞純度受到影響；機械分離結合酶消化及密度離心法對細胞損傷過大，而且會造成組織塊表面消化過度，內部消化不足；免疫磁珠分選及流式分選法所得到的小鼠肝竇內皮細胞雖然純度高，但是由于肝竇內皮細胞缺乏特異性的表面標志物，使得細胞獲得量少，且細胞分選前必須加上某些化學標記有可能造成細胞的分化或凋亡，同時其昂貴的儀器及試劑費用限制了其在各個實驗室的應用。綜上所述，現有的三種小鼠肝竇內皮細胞提取方法均有各自的缺陷，現有技術尚未報道有合適的針對小鼠的肝竇內皮細胞提取方法。

發明內容
本發明的目的在于彌補現有技術針對小鼠肝竇內皮細胞分離時易產生機械損傷，化學預處理導致的細胞活力差，狀態下降及純度不夠等缺陷，提供一種能夠較好的保持細胞完整性和生化活性，且一次提取的肝竇內皮細胞數量較多，純度高小鼠肝竇內皮細胞的提取方法。為實現上述目的，本發明所設計的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，包括以下步驟I)選取小鼠尾靜脈注射氯化釓溶液，氯化釓的日注射量和小鼠體重之比為l(T20mg/25g，連續注射兩日后進行手術,術前一天禁食；2)消毒器械及動物工作臺，36 38°C預溫D_hanks液，1640培養液及膠原酶IV溶液；3 )選取小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉及肝素鈉，戊巴比妥鈉的日注射量和小鼠體重之比為4(Tl00mg/kg，肝素鈉40 60U/只；4)待小鼠完全麻醉后固定于動物手術臺，消毒小鼠腹部，無菌紗布鋪巾防止污染；5)取正中切口進腹，撐開腹腔，將腸管撥向左下腹，暴露門靜脈及下腔靜脈；6)連接五十毫升注射器、灌注泵、延長管及靜脈留置針，開啟灌注泵，讓預溫的D-hanks液充滿延長管及靜脈留置針，排凈空氣；7)靜脈留置針穿刺門靜脈，成功后拔出針芯，雙重絲線結扎，D-hanks液被泵入門靜脈，觀察到肝臟顏色變成土黃色時，剪開下腔靜脈，調整灌流速度為30ml/h ；8)依次剪開肝臟周圍韌帶及膈肌，將肝臟迅速完整的分離下來，勿損傷肝臟，將其置于預先放置了 36 38°C D-hanks液的培養皿中，持續D-hanks液灌注25 40min ；9)然后，將灌流液體換為預溫的膠原酶IV溶液，調整灌流速度為15 17ml/h，灌流2(T30min后，拔出靜脈留置針，將肝臟置于膠原酶IV溶液中于37°C溫箱放置l(T20min ；
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10)從溫箱中取出肝臟，將肝臟置于100目濾網上，減去膽囊及與肝臟相連的膈肌、韌帶、肝門區血管，無損傷鑷剝離肝包膜，挑去其中脈管系統，用預溫的1640培養液反復沖洗將細胞濾過濾網；11)過濾后的細胞懸液低速50g離心3min，使肝臟實質性細胞沉淀，取上清液以800g離心IOmin后，取細胞沉淀以3毫升1640培養液重懸，得細胞懸液備用；12)在離心管中，分別鋪3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml細胞懸液，常溫離心1200g，2(T40min ；13)取兩層percoll液體之間的細胞層，用1640培養液重懸混勻后，2000rmp離心lOmin，去掉上清，所得沉淀用1640培養液重懸并同樣條件再離心一次，取沉淀得到待培養細胞，在體積百分比濃度為20%的胎牛血清中培養；14)觀察待培養細胞的貼壁狀態，待細胞貼壁I小時后，取未貼壁細胞懸液于新容器中培養，12小時后換液，去除未貼壁細胞及死亡細胞，即為肝竇內皮細胞；其中，所述膠原酶IV溶液的質量濃度為O. 05、. 1%，優選為O. 05%。所述氯化禮溶液的濃度為9(Tl20mg/ml,優選為100mg/ml。所述氯化釓溶液的配制方法為按照每Iml無內毒素O. IM磷酸鹽緩沖液或每Iml生理鹽水溶解9(Tl20mg氯化釓的比例配制，并過濾除菌。所述步驟I)中，氯化釓的日注射量和小鼠體重之比優選為10mg/25g。所述25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法為percoll原液高壓消毒，然后，9份percoll原液混合I份質量濃度為8. 5%的生理鹽水，混勻后為100%perCOll溶液；取I. 5ml的100%percoll溶液混合I. 5ml的生理鹽水，配制為50%percoll溶液；取0. 75ml的100%percoll溶液混合2. 25ml的生理鹽水，配制為25%percoll溶液。所述質量濃度為0. 05、. 1%的膠原酶IV溶液的配制方法為每200ml的D-hanks液中溶解IOOlOOmg膠原酶IV，4°C攪拌過夜，過濾除菌后，分裝保存。本發明提供的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法是利用氯化釓注射清除枯否細胞，結合兩步灌流、差速離心、percoll離心、差速貼壁的來實現肝竇內皮細胞的分離。和現有技術相比，本發明采用小鼠預注射氯化釓溶液兩天，以促進KC細胞的凋亡，同時保護肝竇內皮細胞在分離過程中窗孔結構的完整和活性的穩定，從而使提取的細胞純度明顯升高，活性得到保持；選用兩步灌注法保證肝竇內血液充分清除，預防了酶消化不完全及機械損傷。本發明的有益效果所提供的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，簡單易行、細胞純度高、獲得率高，并在體外培養保留完整的結構和功能活性，可用于生化及免疫學。此外，本發明方法使用實驗室常規儀器，成本低可在大部分實驗室推廣。


圖I為以本發明方法分離的肝竇內皮細胞倒置顯微鏡照片。圖2為圖I中肝竇內皮細胞的掃描電鏡圖片。圖3為圖I中肝竇內皮細胞的免疫熒光圖片。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細描述。實施例·針對小鼠提取肝竇內皮細胞的步驟為I)選取正常雄性KM小鼠，周齡約9 10周，體重2(T25g之間，尾靜脈注射氯化釓溶液O. Γ0. 2ml (約IOmg 20mg/25g)連續兩日后進行手術，術前一天禁食，不限水；2)消毒器械及動物工作臺，紫外線預照射實驗臺I小時,37°C預溫D-hanks, 1640培養液，及質量濃度為O. 05%膠原酶IV溶液；3)取小鼠一只腹腔注射O. Iml質量濃度為1% (10mg/ml)的戊巴比妥鈉溶液，約40mg/kg，及O. 2ml濃度為200U/ml的肝素鈉溶液，約40U/只；4)待小鼠完全麻醉后固定于動物手術臺,用質量濃度為75%酒精消毒小鼠腹部三遍，裁剪好無菌紗布鋪巾防止污染；5)取正中切口進腹，用開瞼器撐開腹腔，蚊式止血鉗提起劍突固定，充分暴露腹腔，滴加少許生理鹽水，防止腹腔干燥；將腸管撥向左下腹，暴露門靜脈及下腔靜脈；6)連接五十毫升注射器、灌注泵、延長管及22號靜脈留置針，開啟灌注泵，讓37°C預溫的D-hanks液充滿延長管及靜脈留置針，調整灌注速度為28 32ml/h，排凈空氣；7)門靜脈下方留置絲線2根，靜脈留置針穿刺門靜脈，成功后拔出針芯，雙重絲線結扎，D-hanks液被泵入門靜脈，觀察到肝臟顏色變成土黃色時，剪開下腔靜脈，調整灌流速度為 30ml/h ；8)依次剪開肝臟周圍韌帶及膈肌，將肝臟迅速完整的分離下來，勿損傷肝臟，將其置于預先放置了 37°C預溫D-hanks液的培養皿中，持續D-hanks液灌注30min ；9)然后，將灌流液替換為37°C預溫的膠原酶IV溶液，調整灌流速度為15ml/h，灌流25min后，拔出靜脈留置針，將肝臟置于膠原酶IV溶液中于37°C溫箱放置IOmin保證充分消化；10)從溫箱中取出肝臟，將肝臟置于100目濾網上，減去膽囊及與肝臟相連的膈肌、韌帶、肝門區血管，無損傷鑷剝離肝包膜，挑去其中脈管系統，用預溫的1640培養液反復沖洗將細胞濾過濾網；11)過濾后的細胞懸液低速50g離心3min，使肝臟實質性細胞沉淀，取上清液以800g離心IOmin后，取細胞沉淀以3毫升1640培養液重懸，得細胞懸液備用；12)在15毫升離心管中，先鋪3ml的50%perColl，將管壁傾斜45度角，沿管壁小心加入3ml的25%percoll,細胞懸液3ml置于最上方,加入方法同前,常溫離心1200g,2(T40min，離心過程中使離心機加速度及減速度為最低；13)小心棄去離心管中的上層細胞，取兩層percoll液體之間的細胞層，用1640培養液IOml重懸混勻后,2000rmp離心IOmin,去掉上清,所得沉淀用1640培養液重懸并同樣條件再離心一次，取沉淀得到待培養細胞，在體積百分比濃度為20%的胎牛血清中培養；14)觀察待培養細胞的貼壁狀態，待細胞貼壁I小時后，取未貼壁細胞懸液于目標容器培養，12小時后換液，去除未貼壁細胞及死亡細胞，即為肝竇內皮細胞。其中，上述氯化釓溶液的配制方法為按照每Iml無內毒素O. IM磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解IOOmg氯化釓的比例配制，并過濾除菌。25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法為percoll原液高壓消毒。9份percoll原液+1份質量濃度為8. 5%的生理鹽水，混勻后為100%percoll溶·液；I. 5ml 的 100%percoll 溶液 +1. 5ml 的生理鹽水，配制為 50%percoll 溶液；O. 75ml 的 100%percoll 溶液 +2. 25ml 的生理鹽水，配制為 25%percoll 溶液。質量濃度為O. 05%的膠原酶IV溶液的配制方法為100mg膠原酶IV (sigma)加入200ml的D-hanks液中，4°C攪拌過夜，過濾除菌后按照每次用量分裝保存，每只小鼠用量約 15ml。上述D-hanks液為三蒸水配制，配制方法為KC1 0. 4g, KH2PO4 0. 06g, NaCl
8.Og, NaHCO3 :0. 35g，Na2HPO4 · 7H20 :0. 06g，溶解于三蒸水中定容至IL后，高壓滅菌密封保存。1640培養液配制方法為1640干粉(GIBICO) I包+HEPES (AMERSCO) 3g+碳酸氫鈉2g，溶解后，定容至1L，過濾除菌，分裝為IOOml每瓶冰箱保存。體積百分比濃度為20%的胎牛血清配制方法為胎牛血清20ml+1640培養液80ml混勻。實驗檢測結果實驗例I :顯微鏡觀察將獲得的小鼠肝竇內皮細胞倒置顯微鏡觀察，低倍鏡下可見活細胞呈光亮圓形，飽滿，透光度好，胞核清晰(圖1)，評價每只小鼠可以獲得約2X106個肝竇內皮細胞。 實驗例2 :掃描電鏡(SEM)觀察將實施例I得到的肝竇內皮細胞接種于預鋪了鼠尾膠原I型的細胞爬片上，戊二醛4°C固定過夜，309Γ100%酒精梯度脫水，梯度為10%，每個梯度約2h，脫水結束后真空干燥噴金上環境掃描電鏡檢測(圖2)，可見細胞呈梭形，核大，四周薄，可見大小不一的窗孔結構。實驗例3 :免疫熒光(IF)鑒定I)細胞爬片上滴加I型鼠尾膠原后晾干備用；2)將肝竇內皮細胞(LSEC)接種于細胞爬片上；3)細胞用PBS洗滌5min X 3次；4) 4%多聚甲醛4°C固定I小時；5 ) PBS 洗滌 5min X I 次；6) O. 05% Triton-100 于 4°C破膜 IOmin ；
7) 5%BSA 封閉 4°C I 小時;8) cd31抗體I : 50，濕盒中4°C過夜；9 ) PBS 洗滌 5min X 3 次；10) FITC標記熒光二抗4°C濕盒中孵育I小時；11) DAPI 20ul滴于爬片表面染核IOmin ；12)卩85洗滌511^11\3次；13)甘油封片劑封片，熒光顯微鏡照相。結果見圖3，可見細胞呈梭形，核大，抗體染色集中在胞膜上。
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根據以上實施例及實驗例，一只小鼠平均提取肝竇內皮細胞約2 X IO6,免疫熒光及掃描電鏡鑒定為肝竇內皮細胞且免疫熒光觀察到細胞純度95%以上。說明本發明分離的肝竇內皮細胞純度高，細胞損傷小，獲得率高，并在一定時間內保持肝竇內皮細胞的結構和功能，用于生化及免疫學研究，有利于在一般實驗室推廣。以上所揭露的僅為本發明的優選實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利范圍，因此依本發明申請專利范圍所作的等同變化，仍屬本發明涵蓋的范圍。
權利要求
1.一種小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，包括以下步驟 1)選取小鼠尾靜脈注射氯化釓溶液，氯化釓的日注射量和小鼠體重之比為l(T20mg/25g，連續注射兩日后進行手術,術前一天禁食； 2)消毒器械及動物工作臺，36 38°C預溫D-hanks液，1640培養液及膠原酶IV溶液； 3 )選取小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉及肝素鈉，戊巴比妥鈉的日注射量和小鼠體重之比為40 100mg/kg,肝素鈉40 60U/只； 4)待小鼠完全麻醉后固定于動物手術臺，消毒小鼠腹部，無菌紗布鋪巾防止污染； 5)取正中切口進腹，撐開腹腔，將腸管撥向左下腹，暴露門靜脈及下腔靜脈； 6)連接五十毫升注射器、灌注泵、延長管及靜脈留置針，開啟灌注泵，讓預溫的D-hanks液充滿延長管及靜脈留置針，排凈空氣； 7)靜脈留置針穿刺門靜脈，成功后拔出針芯，雙重絲線結扎，D-hanks液被泵入門靜脈，觀察到肝臟顏色變成土黃色時，剪開下腔靜脈，調整灌流速度為30ml/h ； 8)依次剪開肝臟周圍韌帶及膈肌，將肝臟迅速完整的分離下來，勿損傷肝臟，將其置于預先放置了 36 38°C D-hanks液的培養皿中，持續D-hanks液灌注25 40min ； 9)然后，將灌流液體換為預溫的膠原酶IV溶液，調整灌流速度為15 17ml/h，灌流2(T30min后，拔出靜脈留置針，將肝臟置于膠原酶IV溶液中于37°C溫箱放置l(T20min ； 10)從溫箱中取出肝臟，將肝臟置于100目濾網上，減去膽囊及與肝臟相連的膈肌、韌帶、肝門區血管，無損傷鑷剝離肝包膜，挑去其中脈管系統，用預溫的1640培養液反復沖洗將細胞濾過濾網； 11)過濾后的細胞懸液低速50g離心3min，使肝臟實質性細胞沉淀，取上清液以800g離心IOmin后，取細胞沉淀以3毫升1640培養液重懸，得細胞懸液備用； 12)在離心管中，分別鋪3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液,及3ml細胞懸液，常溫離心1200g, 20 40min ； 13)取兩層percoll液體之間的細胞層，用1640培養液重懸混勻后，2000rmp離心lOmin，去掉上清，所得沉淀用1640培養液重懸并同樣條件再離心一次，取沉淀得到待培養細胞，在體積百分比濃度為20%的胎牛血清中培養； 14)觀察待培養細胞的貼壁狀態，待細胞貼壁I小時后，取未貼壁細胞懸液于新容器中培養，12小時后換液，去除未貼壁細胞及死亡細胞，即為肝竇內皮細胞； 其中，所述膠原酶IV溶液的質量濃度為O. 05、. 1%。
2.根據權利要求I所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述氯化釓溶液的濃度為90 120mg/ml。
3.根據權利要求I所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述氯化釓溶液的濃度為100mg/ml。
4.根據權利要求2或3所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述氯化釓溶液的配制方法為按照每Iml無內毒素0. IM磷酸鹽緩沖液或每Iml生理鹽水溶解9(Tl20mg氯化禮的比例配制,并過濾除菌。
5.根據權利要求I所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述步驟I)中，氯化釓的日注射量和小鼠體重之比為10mg/25g。
6.根據權利要求I所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法為percoll原液高壓消毒，然后,9份percoll原液混合I份質量濃度為8. 5%的生理鹽水，混勻后為100%perCOll溶液；取I. 5ml的100%percoll溶液混合I. 5ml的生理鹽水，配制為50%percoll溶液；取O. 75ml的100%percoll溶液混合2. 25ml的生理鹽水，配制為25%percoll溶液。
7.根據權利要求I所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述膠原酶IV溶液的質量濃度為O. 05%。
8.根據權利要求I或7所述的小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，其特征在于所述質量濃度為O. 05、. 1%的膠原酶IV溶液的配制方法為每200ml的D-hanks液中溶解10(T200mg膠原酶IV，4°C攪拌過夜，過濾除菌后，分裝保存。
全文摘要
本發明公開了一種小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，該方法利用氯化釓注射清除枯否細胞，結合兩步灌流、差速離心、percoll離心、差速貼壁的來實現敢斗內皮細胞的分離。小鼠肝竇內皮細胞的提取方法，簡單易行、細胞純度高、獲得率高，并在體外培養保留完整的結構和功能活性，可用于生化及免疫學。此外，本發明方法使用實驗室常規儀器，成本低可在大部分實驗室推廣。
文檔編號C12N5/071GK102787096SQ20121026809
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者張進祥, 王國梁, 王慧 申請人:張進祥, 王國梁, 王慧