一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白edf-1編碼基因的克隆方法
【專利摘要】一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，屬于生物醫藥【技術領域】。以從蟾蜍的皮膚第一鏈cDNA為模板實施PCR，將獲得的PCR產物與轉化至E.coli感受態細胞，通過篩選陽性的菌落，質粒回收及酶切，獲得能用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因，其工藝簡便，原料充足，獲得的編碼基因性能穩定。
【專利說明】—種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體為一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法。
【背景技術】
[0002]蟾蜍基原的我國傳統中藥材蟾酥、蟾皮和蟾衣等具有消炎、止痛、抗腫瘤等作用。近年的試驗及臨床研究表明，它們可誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞分化以及抑制腫瘤血管 形成等作用。外用蟾酥在治療體表腫瘤及癌癥中也具有良好的療效。現代醫學研究還表明，蟾皮的藥理活性強，在抗腫瘤及治療心血管疾病方面具有重要作用。
[0003]近幾年來，發明人從事蟾蜍皮膚多肽類有效成分的研究，以日本蟾蜍(Bufojaponicus formosus)皮膚 cDNA 質粒文庫為模板，通過菌落 PCR (polymerase chainreaction)篩選具有完整開放閱讀框(open reading frame, 0RF)的cDNA。同時，為拓展中華大蟾蜍(B.gargarizans)的藥用價值及后續研究中的取材方便，合成中華大蟾蜍背部皮膚第一鏈cDNA，進行其相關基因的克隆。內皮分化相關因子-1 (EndothelialDifferentiation-related Factor-1, EDF-1)是一種鈣調素(calmodulin, CaM)結合蛋白，參與抑制內皮細胞的分化的過程。血管生成是指從現有血管形成新的毛細血管的過程，在生理和病理條件下均會發生。而這個復雜的過程需要內皮細胞的遷移和增殖，并分化成管狀結構。所以，從某種角度看，EDF-1參與腫瘤發育和演進過程，并起到抑制作用。

【發明內容】

[0004]針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于設計提供一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法的技術方案，其性能穩定、方法簡單快捷，獲得的EDF-1含量高。
[0005]所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟:
I)將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍9-15h，置于_70°C超低溫冰箱保存備用；
2)稱取步驟I)中一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA，用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA,備用；
3)根據蟾蜍其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取步驟2)中第一鏈cDNA 0.8-1.5 μ L，加滅菌超純水至18-22 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在50-98°C循環實施PCR60-80min ;反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取2-5mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上，并在37°C恒溫培養14-18h，挑取白色菌落接種于10-15mL LB培養基中，實施菌落PCR，將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.2-05mL接種于2-4mL含100mg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養14_18h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，SP可。
[0006]所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于蟾蜍皮膚液氮中速凍時間為10-14h，優選為ll-13h。
[0007]所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于PCR的溫度為60-90°C，優選65-80°C ；PCR的時間為65_75min，優選68-72min。
[0008]所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上后在37°C恒溫培養15-16h。
[0009]所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于菌落振蕩培養時間為15_16h。
[0010]上述一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，以從蟾蜍的皮膚第一鏈cDNA為模板實施PCR，將獲得的PCR產物與轉化至E.coli感受態細胞，通過篩選陽性的菌落，質粒回收及酶切，獲得能用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因，其工藝簡便，原料充足，獲得的編碼基因性能穩定。
[0011]本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，其它的均為純物質的重量百分含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為中華大蟾蜍及F-7 ORF的克隆；
圖2為中華大蟾蜍沒F-7 ORF序列及其推導氨基酸序列；
圖1中M:標準DNA; Al: PCR產物；B1: pGM_T_及F_7 EcoR I和ZAo I酶切產物； 圖2中□為起始密碼子和終止密碼子。
[0013]
【具體實施方式】
[0014]現結合本發明的實施例，進一步說明本發明的有益效果。
[0015]實施例1
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍9h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據其他兩棲類EDF-lcDNA序列確設計上、下游引物，取第一鏈cDNAl.3 μ L，加滅菌超純水至22 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在90°C循環實施PCR60min。反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取
3.5mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養14h。挑取白色菌落接種于IOmLLB培養基中，實施菌落PCR。將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.35mL接種于4mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養15.5h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調素結合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0016]實施例2將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍15h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取第一鏈cDNA 1.1 μ L，加滅菌超純水至18yL，加入與第一鏈00嫩等量的上、下游引物，在561:循環實施？0?801^11。反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取
2.5mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養18h。挑取白色菌落接種于15mLLB培養基中，實施菌落PCR。將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.25mL接種于2mL含IOOmg/HiL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養17h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調素結合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0017]實施例3 將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍10h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取第一鏈cDNA 1.0 μ L，加滅菌超純水至19 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在72°C循環實施PCR72min。反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取4mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養15h。挑取白色菌落接種于IlmL LB培養基中，實施菌落PCR。將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.3mL接種于3mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養16h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調素結合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0018]實施例4
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍lih，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取第一鏈cDNA 0.9 μ L，加滅菌超純水至20 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在78°C循環實施PCR75min。反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取3mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養16h。挑取白色菌落接種于12mL LB培養基中，實施菌落PCR。將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.4mL接種于2.5mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養15h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調素結合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0019]實施例5
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍12h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取第一鏈cDNA 1.5 μ L，加滅菌超純水至21 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在50°C循環實施PCR65min。反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取5mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養17h。挑取白色菌落接種于13mL LB培養基中，實施菌落PCR。將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.5mL接種于3.5mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養18h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調素結合蛋白EDF-1的編碼基因。[0020]實施例6
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍14h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取第一鏈cDNA 0.8 μ L，加滅菌超純水至20.5 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在98°C循環實施PCR63min。反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取2mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養15.5h。挑取白色菌落接種于14mLLB培養基中，實施菌落PCR。將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.2mL接種于2.8mL含100mg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養14h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調素結合蛋白EDF-1的編碼基因。[0021 ] 以下通過試驗進一步說明本發明的有益試驗結果。
[0022]試驗一:
中華大蟾蜍鈣調素結合蛋白EDF-1的克隆:
一)中華大蟾蜍皮膚總RNA的制備及其第一鏈cDNA的合成
從一 70°C 超低溫冰箱中取一小塊中華大蟾蜍背部皮膚，稱重，然后按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA，瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用紫外分光光度計檢測RNA溶液的濃度和純度。用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA。
[0023]二)引物設計及中華大蟾蜍皮膚及F-7 cDNA的克隆
根據其他兩棲類EDF-1 cDNA序列設計上、下游引物Pl (5 ; -TAGAAGGCGAAACATGG-3')和 P2 (5' -GAGCACCGATTTCGAGGCT-3 ')。然后，以中華大蟾蜍皮膚第一鏈cDNA為模板實施PCR。反應體系:2XPCR PrimeStar Max Premix 10.0 μ L，上、下游引物各I UL (2 pmol/mL)，中華大蟾蜍皮膚第一鏈cDNA 1.0 μ L，加滅菌超純水至20 μ L15PCR程序:98°C/2 min, (98°C /10 s,50°C /15 s,72°C /10 s) X 35 循環。反應結束后，將 PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及DNA凝膠回收。然后對PCR產物進行加A反應，并取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至萬.co7i感受態細胞DH5，再將轉化產物均勻涂布于藍白斑篩選用的LB瓊脂盤上(含氨節青霉素Ampicilin: 100 μ g 異丙基-3-D-硫代半乳糖苷 IPTG: 24 μ g*mL-l，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 Χ-gal: 40 μ g *mL-l) ?次日選取白色菌落實施菌落PCR以篩選陽性菌落。
[0024]三)中華大蟾蜍及F-7 ORF的克隆及其編碼蛋白理化性質分析
以Pl和P2為引物，以中華大蟾蜍皮膚第一鏈CDNA為模板實施PCR，結果得到略小于500 bp的PCR產物(圖1的A)。將PCR產物進行連接、轉化并進行陽性菌落篩選和重組質粒回收及限制性內切酶消化(圖1的B)。將確定為陽性的重組質粒委托公司進行測序。
測序結果分析表明，該PCR產物的ORF為447 bp，編碼由148個氨基酸殘基構成的蛋白質(如圖2所示)。其編碼蛋白的氨基酸序列與日本蟾蜍編碼蛋白具僅3個氨基酸殘基不同，對應于日本蟾蜍EDF-1 Ser22、Gln39和Lys88對應的中華大蟾蜍的氨基酸是Ala22、Glu39和Arg88，故命名該克隆為中華大蟾蜍EDF-1。
【權利要求】
1.一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-ι編碼基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟: I)將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍9-15h，置于-70°C超低溫冰箱保存備用； 2)稱取步驟I)中一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說明提取其總RNA，用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA,備用； 3)根據蟾蜍其他兩棲類EDF-lcDNA序列設計上、下游引物，取步驟2)中第一鏈cDNA 0.8-1.5 μ L，加滅菌超純水至18-22 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在50-98°C循環實施PCR60-80min ;反應結束后，取一部分PCR產物與pUCm-T連接，轉化至E.coli感受態細胞DH5，然后取2-5mL轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上，并在37°C恒溫培養14-18h，挑取白色菌落接種于10-15mL LB培養基中，實施菌落PCR，將通過菌落PCR確定為陽性的菌落0.2-05mL接種于2-4mL含100mg/mL氨芐青霉素-的LB培養液中，再次37°C恒溫振蕩培養14_18h，然后使用試劑盒進行質粒回收并對其進行EcoR I和Xho I雙酶切，SP可。
2.如權利要求1所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于蟾蜍皮膚液氮中速凍時間為10-14h，優選為ll-13h。
3.如權利要求1所述 的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于PCR的溫度為60-90°C，優選65-80°C ;PCR的時間為65-75min，優選 68_72min。
4.如權利要求1所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于轉化液均勻涂布于LB瓊脂盤上后在37°C恒溫培養15-16h。
5.如權利要求1所述的一種用于抑制內皮細胞分化的蟾皮鈣調素結合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于菌落振蕩培養時間為15_16h。
【文檔編號】C12N15/12GK103540597SQ201310489681
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】楊仙玉, 方琦璐 申請人:浙江農林大學