專利名稱：雞柔嫩艾美耳球蟲ma1基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及雞柔嫩艾美耳球蟲姻2蛋白(位姻7蛋白)的膜外功能域蛋白Wii^i-Outside domain)及其編碼基因、含有該基因的載體、重組菌株及其應用；還涉及雞柔嫩艾美耳球蟲姻7蛋白及其編碼基因、含有該基因的載體、重組菌株及其應用。
背景技術：
雞球蟲病是一種嚴重危害集約化養雞業、世界性流行的寄生蟲病，在無預防措施或預防失敗(如因抗藥性問題致藥物無效)的情況下，雞發病率可達30%-100%，致死率可高 達80%。全球每年因球蟲病引起的經濟損失超過35億美元以上，我國因球蟲病所致養雞業的經濟損失估計可高達35億元人民幣以上。目前，世界公認的雞球蟲有7種柔嫩艾美耳球蟲(疋te/^77a)，毒害艾美耳球蟲(￡· neca trix ),巨型艾美耳球蟲(i . maxima )，堆型艾美耳球蟲(i . acervulina )，布氏艾美耳球蟲iE. brunette),早熟艾美耳球蟲iE. praecox),和緩艾美耳球蟲(M. mitis),其中柔嫩艾美耳球蟲主要侵害盲腸，是毒力最強、危害最大的雞球蟲，也是研究最多的蟲種。長久以來，國內外雞球蟲病的預防一直采用“在飼料中添加抗球蟲藥、實行以飼料廠為中心控制環節”的技術方法，但該方法已遭遇到球蟲抗藥性的嚴峻挑戰，在某些地區甚至已到無藥可用的困難境地。免疫控制技術作為一種“新型的(novel)可持續的(sustainable) ”的球蟲病控制方法已得到越來越多的應用。盡管以雞球蟲病活卵囊疫苗為主要技術載體的免疫控制技術正在逐步推廣應用，但這類疫苗完全以雞體作為唯一制苗載體，普遍存在生產成本高、保存運輸困難、接種使用后對雞體生長有明顯抑制、散毒危險和難以質量控制等幾乎不可逾越的障礙。因此，開發新藥或新型分子疫苗是球蟲病研究的主要方向，然而迄今為止，人們對艾美耳球蟲的藥物靶標分子或候選疫苗分子都知之甚少。頂膜抗原(Apical Membrane Antigen, ΑΜΑ)是一種在頂復門原蟲中高度保守的微線分泌蛋白，可以和棒狀體分泌的頸部蛋白共同形成“運動結合體(Moving Junction)”,共同完成蟲體與宿主細胞的粘附作用，是協助蟲體進入宿主細胞的關鍵物質。近幾年，通過對雞球蟲基因文庫和蛋白質組的研究，開始對雞球蟲AMAl有所了解，但目前為止未有系統性研究的報道。Ng等在對柔嫩艾美耳球蟲的子孢子和裂殖子的cDNA文庫比較研究時發現，子孢子階段有一條EST序列(基因登陸號BG589)與AMAl具有相似性，而在裂殖子文庫中未找到相同的EST序列。在Bromley等的蛋白組學研究中發現，柔嫩艾美耳球蟲不只一種頂膜抗原，并且出現在不同的發育階段，所以分析可能這些蛋白分別在不同的入侵階段發揮著類似的作用。Blake等利用基因圖譜法對球蟲中免疫力最強的巨型艾美耳球蟲保護性抗原進行篩選，將兩株具有不同生物學特性的巨型艾美耳球蟲在雞體內進行雜交后的基因組，與柔嫩艾美耳球蟲的基因組進行比對，結果發現與AMAl具有同源性的抗原可以優先刺激機體產生免疫力，可以優先作為疫苗和藥物開發的研究靶標。本課題組在對廣東株柔嫩艾美耳球蟲裂殖子cDNA的克隆時，獲得了多個類似頂膜抗原的基因，其中雞柔嫩艾美耳球蟲蛋白(萬—2」的氨基酸序列與EtAMAl具有高度保守的序列，推測為EtAMAl的家族蛋白。在對其功能進行研究時，發現免疫蛋白的膜外功能結構域可以有效預防雞體感染雞球蟲病。而迄今為止，尚無任何其他關于該蛋白對艾美耳球蟲免疫保護性的研究。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種雞柔嫩艾美耳球蟲蛋白(MMA1蛋白)。本發明的另一個目的在于提供編 碼上述萬_2蛋白的基因。本發明的目的在于提供一種位姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utside domain)。本發明的另一個目的在于提供編碼上述膜外功能域蛋白的基因。本發明的另一個目的在于提供含有萬_2蛋白基因或萬_7膜外功能域蛋白基因的克隆載體。本發明的另一個目的在于提供一種萬_2膜外功能域蛋白的制備方法。本發明的另一個目的在于提供萬_2蛋白和/或萬_2膜外功能域蛋白在制備抗艾美耳球蟲藥物中的應用。本發明所采用的技術方案是
雞柔嫩艾美耳球蟲姻7蛋白(扮M7蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，或者是SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。編碼上述位姻7蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。位姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utside domain),其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。編碼上述位姻7膜外功能域蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。一種克隆載體，含有萬—2蛋白的編碼基因或萬—2膜外功能域蛋白的編碼基因。一種表達載體，含有萬_2蛋白的編碼基因或萬膜外功能域蛋白的編碼基因。缺EtMAl膜外功能域蛋白的方法，包括將上述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到萬_7膜外功能域蛋白。EtMAl蛋白或萬_7膜外功能域蛋白在制備抗艾美耳球蟲藥物中的應用。本發明的有益效果在于
通過免疫膜外功能域蛋白，能有效控制雞體感染柔嫩艾美耳球蟲病，大大降低養雞場抗球蟲藥的使用量，有效控制雞球蟲病。


圖I是萬.tenella裂殖子總RNA電泳結果；
圖2是位姻7基因全長ORF的PCR擴增鑒定結果(M. DL 2000 Marker ; I.位姻7的PCR產物);圖3是EtMAl的菌液PCR鑒定結果(M. DL 2000 Marker ；1:位姻7陽性菌)
圖4是EtMAl信號肽切割位點分析 圖5是EtMAl膜外結構域位點分析 圖 6 是位姻7-Outside domain 的 PCR 產物電泳圖(M. DL 2000 Marker ；1,2.EtMAl-Qutside domain 的 PCR 產物)；
圖 7 是位姻7-Outside domain 的菌液 PCR 鑒定電泳圖(E DL 2000 Marker ;5，6.EtMAl-Outside domain 菌液 PCR 結果)；
圖8是pColdl -EtMAl-Qutside domain的酶切鑒定電泳 圖9是pColdI~5Yi^7-0utside domain表達產物SDS-PAGE電泳分析圖(Μ.蛋白質分子質量標準；I.未誘導菌液；2.誘導后菌液；3-9.純化的融合蛋白；10. Western blot)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括PCR擴增、質粒提取、質粒轉化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規的方法，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002,北京科學出版社)。及《現代分子生物學實驗技術》(盧圣棟主編，第2版，北京中國協和醫科大學出版社，1999.)
實施例I
I萬基因序列的克隆
I.I PCR引物設計根據預測的疋tenella棒狀體頸部蛋白扮M2基因的cDNA序列用Premier Primer 5. O軟件設計,上海英駿生物工程公司合成
上游引物 MAlF :5’ ATGGAGGCTCTACGGGAAGGCTTC 3’ (SEQ ID NO: 5);
下游引物 MAlR :5’ TTAGTAGTAGGCGTCGTGGGCGTTG 3’ (SEQ ID N0:6)。I. 2廣東株萬.裂殖子(由廣東省農業科學院獸醫研究所寄生生物研究室保存)的分離和純化方法參照《雞球蟲病學》(索勛，李國清主編，北京中國農業大學出版社，1997.)。I. 3 E. tenella裂殖子總RNA的提取方法參照Invitrogen公司的TRIZOL LS Reagent試劑盒說明書。分光光度計測定RNA濃度為lPg/ml ;電泳結果顯示分共為28S，18S和5S等3個大小不同的片段，條帶清晰(如圖I)。I. 4 RT-PCR 擴增 EtMAl 全長 ORF 序列
以上述步驟抽提的萬.tenella裂殖子的總RNA作為模板，用Takara公司的PrimeScript lst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成 cDNA ;以 cDNA 為模板，MA1F,MAlR為引物，TaKaRa LA Taq 酶進行PCR擴增，反應條件94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，72°C延伸10min，35個循環。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果擴增獲得一條約1600bp的片段(見圖2)。將PCR產物純化回收后按試劑盒說明書連接至PMD18-T載體(Takara公司)，再將連接產物轉化入萬.co7i DH5 α感受態細胞，得到E.coli DH5a (pMD18_T-位姻7 )。在Amp抗性平板上生長的白色菌落為可疑重組子，挑單菌落培養，以菌液為模板，以引物進行菌液PCR擴增，獲得大小約為1600bp的條帶(見圖3)。陽性菌送上海生工生物工程公司測序，EtMAl序列全長為1617bp，如SEQID NO: I 所示。1.5序列的分析
利用在線 Translate tool (http://www. expasy. ch/tools/dna. html)翻譯序列，推測出其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。利用信號肽在線分析軟件SignalP 4.0 Server分析信號肽，利用跨膜結構域在線分析軟件TMHMM Server v. 2. O分析氨基酸序列，確定34aa 35aa為信號肽切割位點(圖4), laa_443aa為膜外結構域(圖5),根據分析結果，本實驗選取35aa 443aa蛋白(SEQ ID NO:4所示，其編碼基因為SEQ ID NO:3)作大EtMAl膜外功能域蛋白(EtMA1-Outside domain),進行表達和動物保護性實驗。2 EtMAl 膜外功能域蛋白 (EtMA1-Outside domain)的制備 2. I EtMAl-QutsiAe domain 的擴增
擴增引物
EtMAl-QutsiAe domainF
5’ GGCGGATCCTCTAACGGCTCACAGGTAGCTTCC 3’ (SEQ ID NO:7)；
EtMAl-QutsiAe domain R
5’ GGCAAGCTTTTAAGGGATGCTGCTGCAGTTGCAGT 3’ (SEQ ID NO:8)。在引物的上游序列中分別引入及 " I酶切位點，在下游引物引入歷酶切位點；并分別加“GGC”3個堿基以保證內切酶發揮作用。以上引物均由廣東英俊生物技術公司合成。以厶coli DH5 a (pMD18_T-位姻7 )為模板，建立如下PCR反應擴增位姻7-Outsidedomain的序列
權利要求
1.雞柔嫩艾美耳球蟲蛋白(ぬ·i蛋白)，其氨基酸序列如SEQID NO: 2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加ー個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。
2.編碼權利要求I所述蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
4.萬(姻7膜外功能域蛋白(i ii^7_0utsidedomain),其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，或者是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加ー個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。
5.編碼權利要求4所述蛋白的基因。
6.根據權利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。
7.ー種克隆載體，含有權利要求2、3、5或6所述的基因。
8.—種表達載體,含有權利要求2、3、5或6所述的基因。
9.電產EtMAl膜外功能域蛋白的方法，包括將權利要求8所述的表達載體導入宿主細胞中，表達得到^'膜外功能域蛋白。
10.權利要求I或4所述的蛋白在制備抗艾美耳球蟲藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了雞柔嫩艾美耳球蟲MA1基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用。EtMA1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，或者是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。本發明還公開了EtMA1膜外功能域蛋白(EtMA1-Outsidedomain)，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等活性的蛋白。EtMA1蛋白和EtMA1膜外功能域蛋白可應用于制備抗艾美耳球蟲藥物，通過免疫EtMA1膜外功能域蛋白，能有效控制雞體感染柔嫩艾美耳球蟲病，大大降低養雞場抗球蟲藥的使用量，有效控制雞球蟲病。
文檔編號C12N15/30GK102816221SQ201210279040
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月6日 優先權日2012年8月6日
發明者戚南山, 孫銘飛, 吳彩艷, 廖申權, 呂敏娜, 溫烈娜, 謝明權 申請人:廣東省農業科學院獸醫研究所