一種活性多肽及其在植物根部發育中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種活性多肽及其在植物根部發育中的應用。具體地，發明人發現一種新的分離的多肽及其前體，所述多肽從N’端到C’端依次為：Y、I、Y、T、N。本發明還提供了所述多肽的衍生物及其前體。所述的活性小肽具有種屬特異性，并參與植物根部的發育，能促進擬南芥根部的增長，增加側根的形成，對豆科植物根瘤的形成具有促進作用。
【專利說明】一種活性多肽及其在植物根部發育中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物生理學領域，具體地，本發明涉及一種活性多肽及其在植物根部發育中的應用。
【背景技術】[0002]根是植物在長期適應陸地生活過程中發展起來的器官，擔負著吸收水分和溶質以及使植物固著在基質上的作用。空氣中存在著大量的分子態的氮氣，它們約占空氣成分的80%。據估計，在整個大氣層中，約有4X1015t的分子態氮。然而，絕大多數的植物只能從土壤中吸收結合態氮，用來合成自身的含氮化合物(如蛋白質等)。土壤中的含氮化合物，不是土壤本身固有的，而是在生物生命活動過程中逐漸積累起來的，其中很大一部分來自微生物的生物固氮。據估計,地球表面上每年生物固氮的總量約為10t，其中豆科植物體內根瘤菌的固氮量約為55t，占生物固氮總量的55%左右。根瘤是在植物根系上生長的一種特殊的瘤，是寄生組織中建成共生的固氮細菌形成的，植物的根瘤可以合成自身的含氮化合物，如蛋白質等。
[0003]根瘤的形成過程大致為:聚集在根毛頂端的根瘤菌分泌一種纖維素酶，這種酶將根毛細胞壁溶解掉，根瘤菌從根毛尖端侵入根的內部，產生感染絲，根瘤菌不斷地進入根毛，并且大量繁殖，在根瘤菌侵入的刺激下，根細胞分泌一種纖維素，將感染絲包圍起來，形成一條分枝或不分枝的纖維素鞘，叫做侵入線，侵入線不斷地延伸，直到根的內皮層，根的內皮層處的薄壁細胞，受到根瘤菌分泌物的刺激，產生大量的皮層細胞，從而使該處的組織膨大,最后形成根瘤。
[0004]根瘤菌的固氮作用是在常溫、常壓下進行的。根瘤固氮具有固氮效率高、無污染、成本低、收益高等優點。根瘤菌的固氮能力，不僅取決于土壤條件和農業措施，也取決于植物品種，人工培養的一些根瘤菌品系的固氮能力往往比野生品系的固氮能力高幾倍。
[0005]本領域目前還沒有找到一種可以直接應用的影響植物根部發育特別是影響植物根瘤形成的基因或活性物質。因此迫切需要進行影響農業植物尤其是豆科植物的根部發育的研究及開發。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是提供一種新的植物磺酸化肽及其在植物根部發育中的應用。
[0007]在本發明的第一方面，提供了一種分離的活性多肽，所述的活性多肽任選自下組:
[0008](I)從N，端到C，端依次為Y、1、Y、T、N的多肽；
[0009](2)上述(I)中多肽的衍生物；
[0010](3)上述(I)中多肽或⑵中多肽的衍生物的前體。
[0011]在另一優選例中，所述的活性多肽來源于植物，較佳地來源于豆科植物。
[0012]在另一優選例中，(2)中所述的衍生物為磺酸化衍生物。[0013]在另一優選例中，所述多肽的磺酸化位點為酪氨酸殘基(Y);較佳地，所述多肽的2個酪氨酸殘基都被磺酸化。 [0014]在本發明的第二方面，提供了編碼第一方面所述活性多肽的多核苷酸。
[0015]在另一優選例中，所述的多核苷酸為如SEQ ID N0.: 11_20任一所示的多核苷酸。
[0016]在本發明的第三方面，提供了一種含有本發明第二方面所述多核苷酸的載體。
[0017]在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本發明的第三方面所述的載體，或其基因組中整合有本發明的第二方面所述的多核苷酸。
[0018]在本發明的第五方面，提供了第一方面所述活性多肽，或第二方面所述多核苷酸的用途，所述用途選自下組的一種或多種:
[0019](a)用于調節植物側根數目；
[0020](b)用于調節植物根的長度；
[0021](c)用于調節豆科植物根瘤的形成。
[0022]在本發明的第六方面，提供了一種制備轉基因植物的方法，包括步驟:
[0023]將編碼第一方面所述活性多肽的多核苷酸導入植物細胞中，培養所述植物細胞，再生成植物。
[0024]在另一優選例中，所述的多核苷酸為序列如SEQ ID N0.:11_20任一所不的多核苷酸。
[0025]在另一優選例中，所述的植物為豆科植物，較佳地任選自:大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根、木豆、豌豆、蠶豆、紅豆、綠豆、田菁等。
[0026]在本發明的第七方面，提供了一種制備第一方面所述活性多肽的方法，所述方法任選任自下組:
[0027](I)培養第四方面所述的宿主細胞，收集獲得第一方面所述的活性多肽；
[0028](2)人工化學合成第一方面所述的活性多肽；
[0029](3)從含有第一方面所述活性多肽的植物組織或器官中提取所述的活性多肽。
[0030]在另一優選例中，(3)中所述的植物為豆科植物,較佳地任選自:大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根、木豆、豌豆、蠶豆、紅豆、綠豆、田菁等。
[0031]在另一優選例中，(3)中所述的植物器官為根或根瘤。
[0032]在本發明的第八方面，提供了一種改良植物性狀的方法，所述的植物性狀選自下組:
[0033](a)增加植物側根數目；
[0034](b)增加植物根的長度；
[0035](C)促進豆科植物根瘤的形成，
[0036]包括步驟:提高所述植物中第一方面所述活性多肽或其或其編碼基因的表達水平。
[0037]在另一優選例中，所述植物中第一方面所述活性多肽的表達水平提高10%以上，較佳地提高30%以上，更佳地提高50%以上，更佳地提高70%以上，更佳地提高90%以上，最佳地提高100%以上。
[0038]在本發明的第九方面，提供了一種方法，所述的方法任選自下組:
[0039](a)增加植物側根數目的方法；[0040](b)增加植物根的長度的方法；
[0041](c)促進豆科植物根瘤的形成的方法，
[0042]包括步驟:向所述的植物施用本發明第一方面所述的活性多肽。
[0043]在另一優選例中，所述活性多肽的施用濃度為0.1-1000 μ Μ，較佳地10 μ Μ。
[0044]在另一優選例中，將第一方面所述的活性多肽與所述的植物(優選植物根部)接觸。
[0045]在另一優選例中，(a)或(b)中所述的植物為:擬南芥、水稻、或煙草。
[0046]在另一優選例中，(C)中所述的豆科植物為大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、百脈根、木
豆、豌豆、蠶豆、紅豆、綠豆、田菁等。
[0047]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0049]圖1顯示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)編碼基因的組成和結構。
`[0050]圖2顯示大豆、蒺藜苜蓿和百脈根中NGF小肽(￥603)1￥(503)了幻編碼基因的表達結果；其中，圖2A顯示大豆中NGF編碼基因在根毛、根系和根瘤中表達，其中在根瘤中表達量最高；圖2B顯示在蒺藜苜蓿中，NGF編碼基因在根瘤中特異表達；圖2C顯示百脈根中NGF編碼基因在根系、葉和根瘤中表達，其中在根瘤中表達量最高；圖2D顯示，百脈根中NGF編碼基因在根系中的表達受根瘤菌誘導。
[0051]圖3顯示蒺藜苜蓿中NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)編碼基因擾亂后的結瘤測試結
果O
[0052]圖4顯示NG F小肽(Y(S03) IY(S03)TN)的質譜鑒定結果。
[0053]圖5顯示了在擬南芥(A)、大豆根瘤(B)、百脈根根瘤(C)、紫花苜蓿根瘤(D)、煙草(E)、水稻(F)中NGF的含量，G為化學合成的NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)。
[0054]圖6顯示苜蓿不同組織(A，蒺藜苜蓿的花器官；B，蒺藜苜蓿的葉子；C，紫花苜蓿的葉子；D，紫花苜蓿根瘤；E，蒺藜苜蓿的果莢；F，紫花苜蓿的根系；G，紫花苜蓿的莖)的NGF小肽(Y (S03) IY (S03) TN)含量的分析結果。
[0055]圖7顯示NG小肽(Y(S03) IY(S03) TN) F對擬南芥根系生長的影響結果。
[0056]圖8顯示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)對百脈根和蒺藜苜蓿結瘤的影響。
[0057]圖9顯示NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)對擬南芥側根數目的影響。
【具體實施方式】
[0058]本發明人經過廣泛而深入的研究，具體地，發明人意外發現一種新的活性多肽，所述多肽從N’端到C’端依次為Y (Tyr)、I (lie)、Y (Tyr), T (Thr),N (Gln);本發明還包括所述多肽的衍生物及其前體；所述的活性多肽具有種屬特異性，并參與植物根部的發育，能促進擬南芥根部的增長，增加側根的形成，對豆科植物根瘤的形成具有促進作用。在此基礎上完成了本發明。
[0059]如本文所用，術語“本發明的小肽”，“本發明的活性多肽”，或“本發明的多肽”可以互換使用，都是指N’端到C’端依次為Y、1、Y、T、N的小肽，其中，所述的Y為Tyr，I為He，T 為 Thr，N 為 Gin。
[0060]如本文所用，術語“本發明的多肽衍生物”或“本發明的小肽衍生物”可以互換使用，都是指本發明的具有YIYTN結構的多肽的衍生物；較佳地為磺酸化衍生物；磺酸化位點優選酪氨酸殘基；更優選地，小肽中的所有酪氨酸殘基都被磺酸化。
[0061]如本文所用，術語“NGF小肽”是指結構為(Y(S03)IY(S03)TN)的磺酸化小肽。
[0062]本發明還包括上述多肽(或其衍生物)的前體。
[0063]例如:在部分種屬中，NGF小肽(Y(S03) IY(S03)TN)前體的氨基酸序列見下:
[0064]>GmNGFlab
[0065]MRLSKPTLLL FLVFIFTTVQ GQAVTNERVV GSESVVSFEL RRSGGCEKQG FEYREGNGGL 60
[0066]EDTVLENEDY IYTNSLP77
[0067](SEQ ID N0.:1)
[0068]>GmNGF2
[0069]MRLSKPALLL FLVF IFTVVQ GQAVTNERVV CSKSSTTVRR SGGCEKQGFE YKEGNGGLED 60
[0070]TVLENEDYIY TNFLP75
[0071](SEQ ID N0.:2)
[0072]>LjNGF
[0073]MKLLKPALFL CLVSIFIVVY VVQREAVTNE QVAGGASQSS VTVKRSGCEK QGFECKEGSG 60
[0074]GSQDTVLENE DYIYTNSLP79
[0075](SEQ ID N0.:3)
[0076]>MtNGFl
[0077]MRLSKPTLIL FVFFIFTVTC VVQMEAVINE RVVDAGSGSS SVNVVRRGEC EKQGVECKQV 60
[0078]NGGNEDNDLE SEDYIYTNSV LP82
[0079](SEQ ID N0.:4)
[0080]>PsNGF
[0081]RVVKGGGSGS NSTTVVVRRG ECEKQGVECE KENGENEETD LENEDYIYTN SVLP54
[0082](SEQ ID N0.:5)
[0083]>CcNGFl
[0084]MRLSKPALLL FRRGGCEKQG VECKEGNGGL EDTVLENEDY IYTNSLP47
[0085](SEQ ID N0.:6)
[0086]>CgNGF
[0087]GRAQSKYHEV FETRFFLFLV FCYLTFVSEG KSDTTESFVG SGGASANEGR AECGQGDVEC 60
[0088]KEGSRGSADN LFENEDYIYT NSLP 84
[0089](SEQ ID N0.:7)
[0090]>QpNGF
[0091]NEFSRLAFLL TLAFIYYLIF VAQGKADTNE LLVGSAGTSV NEGRAECSKD AVECKEGNGG 60
[0092]SEENAYENED YIYTNSLP 78[0093](SEQ ID N0.:8)
[0094]>VvNGF
[0095]MRFSGPYMFL FLAFFFYLVF AIQGKEDTNG VTRRKVLSAE KEMEEQKSVF ESEDYIYTNS 60
[0096]LP62 [0097](SEQ ID N0.:9)
[0098]>CsNGF
[0099]MQGRAECGKE QNVECKKRSD QEDDVFEDED YIYTNSLP38
[0100](SEQ ID N0.:10)
[0101]其中，Gm表不 Glycine max (大豆)，Lj 表不 Lotus japonicus (百脈根)，Mt 表不Medicago truncatula (蔡藜苜猜)，Ps 表不 Pisum sativum (豌豆)，Ce 表不 Cajanus cajan(木豆)，Cg 表示 Casuarina glauca (木麻黃)，Qp 表示 Quercus petraea (無梗花櫟)，Vv 表不 Vitis vinifera (葡萄)，Cs 表不 Cannabis sativa (大麻)。
[0102]如本文所用，術語“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和蛋白是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。“分離的多肽”是指所述的小肽基本上不含天然與其相關的其它肽、脂類、糖類或其它物質。
[0103]本領域的技術人員能用常規方法，如標準的小肽純化技術純化。基本上純的小肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶，其純度能用氨基酸序列分析。
[0104]本發明的活性多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主。
[0105]修飾(通常不改變一級結構)的形式包括:體內或體外的化學衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。
[0106]活性多肽的編碼序列
[0107]本發明還提供了編碼本發明活性多肽的多核苷酸，所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0108]術語“編碼本發明活性多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽或其衍生物的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列(如信號肽序列)的多核苷酸。
[0109]本發明還涉及上述多核苷酸的變異體。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0110]本發明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。可以完全通過化學合成來得到編碼本發明的小肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外,還可通過化學合成將突變引入本發明的小肽序列中。用于PCR的引物可根據本文所公開的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。
[0111]在部分種屬中，編碼NGF小肽(Y (S03) IY (S03) TN)的CDS序列如下:
[0112]
【權利要求】
1.一種分離的活性多肽，其特征在于，所述的活性多肽任選自下組:(1)從N’ 端到 C，端依次為 Y (Tyr), I (He)、Y (Tyr), T (Thr), N (Gln)的多肽； (2)上述(I)中多肽的衍生物； (3)上述(I)中多肽或(2)中多肽的衍生物的前體。
2.如權利要求1所述的活性多肽，其特征在于，(2)中所述的衍生物為磺酸化衍生物。
3.編碼權利要求1所述活性多肽的多核苷酸。
4.一種含有權利要求3所述多核苷酸的載體。
5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求4所述的載體，或其基因組中整合有權利要求3所述的多核苷酸。
6.權利要求1所述活性多肽，或權利要求3所述多核苷酸的用途，其特征在于，所述用途選自下組的一種或多種: (a)用于調節植物側根數目； (b)用于調節植物根的長度； (C)用于調節豆科植物根瘤的形成。
7.一種制備轉基因植物的方法，其特征在于，包括步驟: 將編碼權利要求1所述活性多肽的多核苷酸導入植物細胞中，培養所述植物細胞，再生成植物。
8.一種制備權利要求1所述活性多肽的方法，其特征在于，所述方法任選任自下組: (1)培養權利要求5所述的宿主細胞，收集獲得權利要求1所述的活性多肽； (2)人工化學合成權利要求1所述的活性多肽； (3)從含有權利要求1所述活性多肽的植物組織或器官中提取所述的活性多肽。
9.一種改良植物性狀的方法，所述的植物性狀選自下組: (a)增加植物側根數目； (b)增加植物根的長度； (C)促進豆科植物根瘤的形成， 其特征在于，包括步驟:提高所述植物中權利要求1所述活性多肽或其或其編碼基因的表達水平。
10.一種方法，所述的方法任選自下組: (a)增加植物側根數目的方法； (b)增加植物根的長度的方法； (C)促進豆科植物根瘤的形成的方法， 其特征在于，包括步驟:向所述的植物施用權利要求1所述的活性多肽。
【文檔編號】C12N1/21GK103570805SQ201210279537
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優先權日:2012年8月7日
【發明者】羅利, 李曉琳, 徐霽 申請人:中國科學院上海生命科學研究院