人乳鐵蛋白單克隆抗體、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人乳鐵蛋白單克隆抗體。由保藏號(hào)為CGMCCNo.6394的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明還提供所述人乳鐵蛋白單克隆抗體的制備方法及應(yīng)用。所述單克隆抗體可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉中的人乳鐵蛋白。本發(fā)明的人乳鐵蛋白單克隆抗體純度高，效價(jià)高，靈敏度高，無(wú)交叉反應(yīng)，專一性強(qiáng)，可特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因樣品，直接對(duì)外源表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，避免了基因提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易污染的問(wèn)題；本發(fā)明檢測(cè)成本低廉，結(jié)果迅速，靈敏可靠，可以穩(wěn)定、方便地提供準(zhǔn)化的試劑，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】人乳鐵蛋白單克隆抗體、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及單克隆抗體的制備與應(yīng)用，尤其涉及一種人乳鐵蛋白單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002]人乳鐵蛋白(hLF)是一種多功能的糖蛋白。它的主要功能有:抑菌與殺菌、抗病毒、增強(qiáng)宿主防御和免疫調(diào)節(jié)工能、促進(jìn)鐵吸收、抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用、影響自由基的生成等。作為機(jī)體防御組分的hLF不僅可用作藥物治療感染、癌癥和免疫低下等病癥，還可作為食品添加劑改善人民的健康。由于天然的人乳鐵蛋白來(lái)源有限，目前還無(wú)法開(kāi)發(fā)出產(chǎn)品來(lái)滿足巨大的市場(chǎng)需求，科學(xué)家們正致力于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的研究。同時(shí)，與轉(zhuǎn)基因相伴而生的生物安全問(wèn)題引起了公眾和管理部門(mén)的強(qiáng)烈關(guān)注和重視。建立精準(zhǔn)、快速的檢測(cè)技術(shù)并科學(xué)、系統(tǒng)地進(jìn)行生物安全評(píng)價(jià)，可防止轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或產(chǎn)品在研究、生產(chǎn)、銷售時(shí)發(fā)生擴(kuò)散、污染等安全隱患進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備和支撐。這不僅是維護(hù)消費(fèi)者知情權(quán)和在國(guó)際貿(mào)易中維護(hù)國(guó)家利益的必要手段，也是我國(guó)履行國(guó)際義務(wù)、維護(hù)國(guó)家形象的重要保障。
[0003]乳鐵蛋白的檢測(cè)方法有很多，其中ELISA檢測(cè)法以其快速、準(zhǔn)確、靈敏且一次能處理多個(gè)樣而倍受關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外用于ELISA檢測(cè)的抗體為多克隆抗體，而以單克隆抗體為基礎(chǔ)建立起的免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種人乳鐵蛋白單克隆抗體。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供能分泌產(chǎn)生所述人乳鐵蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0006]本發(fā)明的再一目的是提供人乳鐵蛋白單克隆抗體在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉中人乳鐵蛋白中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明用重組蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA法進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選、通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗hLF的4株細(xì)胞1C2、2G11、3A6、3D12。取雜交瘤細(xì)胞(效價(jià)較高同時(shí)細(xì)胞狀態(tài)好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化得單克隆抗體。
[0008]經(jīng)鑒定腹水制備前細(xì)胞上清效價(jià)檢測(cè)顯示細(xì)胞3D12效價(jià)最高。3D12細(xì)胞亞型為IgGl+kappa。3D12細(xì)胞能與免疫原h(huán)LF反應(yīng)，不與篩選原牛乳鐵蛋白(bLF)反應(yīng)。用細(xì)胞3D12制備腹水，檢測(cè)腹水效價(jià)為1:81000，腹水純化檢測(cè)單克隆抗體效價(jià)為1:81000，抗體純度高于95%。
[0009]雜交瘤細(xì)胞ZZY hLF 3D12的保藏號(hào)為:CGMCC N0.6394 ;保藏時(shí)間:2012年7月20日；保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC);保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。[0010]所述人乳鐵蛋白單克隆抗體可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛奶中表達(dá)量數(shù)量級(jí)為g/L的人乳鐵蛋白。Western Blot檢測(cè)顯示抗體3D12只與轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉反應(yīng)，不與非轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉反應(yīng)。
[0011]本發(fā)明還提供以人乳鐵蛋白作為免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加強(qiáng)免疫后7天收集血清，分離純化得到人乳鐵蛋白多克隆抗體。純化抗體通過(guò)考馬斯亮藍(lán)驗(yàn)證，多克隆抗體能滿足要求，濃度約為2mg/mL。采用間接ELISA法對(duì)抗體IgG進(jìn)行鑒定，抗體效價(jià)達(dá)到I: 200,000。
[0012]本發(fā)明還提供人乳鐵蛋白的夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，包括包被抗體和酶標(biāo)抗體，其中所述包被抗體為人乳鐵蛋白多克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為人乳鐵蛋白單克隆抗體。
[0013]其中，檢測(cè)樣本中免疫抗原檢測(cè)限為25ng/mL。
[0014]所述人乳鐵蛋白的夾心ELISA檢測(cè)試劑盒還包括以下試劑中的一種或多種:
[0015]I)洗滌液；
[0016]2)底物顯色液； [0017]3)反應(yīng)終止液；
[0018]4)人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0019]所述酶標(biāo)抗體的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶。
[0020]所述洗滌液為PBST，所述底物顯色液為T(mén)MB，所述反應(yīng)終止液為2mol/L H2S04。
[0021]所述試劑盒檢測(cè)人乳鐵蛋白的方法，包括如下步驟:
[0022]I)向包被人乳鐵蛋白多克隆抗體的酶聯(lián)板中加入人乳鐵蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)樣品，洗滌液洗板；
[0023]2)加入酶標(biāo)人乳鐵蛋白單克隆抗體，洗滌液洗板；
[0024]3)加入底物顯色液顯色,加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng),測(cè)定0D450值；
[0025]4)以人乳鐵蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-效應(yīng)曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品人乳鐵蛋白的含量。
[0026]具體包括以下步驟:
[0027]I IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:
[0028]將人乳鐵蛋白多克隆抗體包被于酶聯(lián)板上，洗板；封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板，洗板；加入不同濃度的人乳鐵蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液，洗板；加入酶標(biāo)人乳鐵蛋白單克隆抗體，洗板；加底物顯色；終止反應(yīng)；測(cè)定0D450值，以與陰性對(duì)照孔OD值的比值大于2.1為限，作為判斷為陽(yáng)性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0029]II檢測(cè)樣品中人乳鐵蛋白的含量:
[0030]將人乳鐵蛋白多克隆抗體包被于酶聯(lián)板上，洗板；封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板，洗板；加入待檢測(cè)樣品，洗板；加入酶標(biāo)人乳鐵蛋白單克隆抗體，洗板；加底物顯色；終止反應(yīng)；測(cè)定0D450值，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，定量檢測(cè)人乳鐵蛋白。
[0031]優(yōu)選地，人乳鐵蛋白多克隆抗體濃度為5 u g/mL,包被液為pH9.6磷酸緩沖液，酶標(biāo)人乳鐵蛋白單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1:500。
[0032]具體實(shí)施步驟如下:
[0033]I IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:
[0034](I)包被:濃度為5 ii g/mL兔多克隆抗體，100 y L/孔，4°C過(guò)夜，洗液洗滌3次；[0035](2)封閉:加1501117孔封閉液，371:2小時(shí)后，洗滌3次，拍干，置41:冰箱保存?zhèn)溆茫籟0036](3)加標(biāo)準(zhǔn)樣品:
[0037]混合轉(zhuǎn)基因樣品和非轉(zhuǎn)基因樣品制備人乳鐵蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品原始濃度為0.2mg/mL，分別按照 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000 稀釋，PBS作為陰性對(duì)照；加入不同濃度的人乳鐵蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液IOOiI L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；
[0038](4)加二抗:小鼠單克隆抗體-HRP抗體，按1:500的稀釋比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；
[0039](5)顯色:TMB 按 100 y L/孔加入，37°C顯色 15_30min ；
[0040](6)終止:加入終止液2M H2S0450 U L/孔；
[0041](7)讀數(shù):以450nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值，以與陰性對(duì)照孔OD值的比值大于2.1為限，作為判斷為陽(yáng)性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0042]II檢測(cè)樣品中人乳鐵蛋白的含量:
[0043](I)包被:濃度為5 ii g/mL兔多克隆抗體，100 y L/孔，4°C過(guò)夜，洗液洗滌3次；
[0044](2)封閉:加1501117孔封閉液，371:2小時(shí)后，洗滌3次，拍干，置41:冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0045](3)加待測(cè)樣品:
[0046]加入待測(cè)樣品，100 U L/孔，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；
[0047](4)加二抗:小鼠單克隆抗體-HRP抗體，按1:500的稀釋比例加入，37 °C孵育20min,洗板4次，拍干；
[0048](5)顯色:TMB 按 100 y L/孔加入，37°C顯色 15_30min ；
[0049](6)終止:加入終止液2M H2SO4 50 U L/孔;
[0050](7)讀數(shù):以450nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，定量檢測(cè)人乳鐵蛋白。
[0051]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的人乳鐵蛋白單克隆抗體純度高，效價(jià)高，靈敏度高，無(wú)交叉反應(yīng)，專一性強(qiáng)，可特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因樣品，可直接對(duì)外源表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)避免了核酸檢測(cè)方法中，基因提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易污染的問(wèn)題。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因牛奶及奶制品中人乳鐵蛋白的定量檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線在25~200ng/mL范圍內(nèi)線性良好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高特異性和高靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)成本低廉，結(jié)果迅速，靈敏可靠，而且可以穩(wěn)定、方便地提供準(zhǔn)化的試劑，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052]圖1為免疫后小鼠血清WB檢測(cè)結(jié)果圖；其中Al:l#l:1000 ;A2:1#1:3000 ;A3:2#1:1000 ；A4:2#1:3000 ；A5:3#1:1000 ；A6:3#1:3000 ;A7:4#1:1000 ;A8:4#1:3000 ；A9:5#l:1000 ；A10:5#1:3000 ；
[0053]圖2為腹水制備前細(xì)胞上清WB檢測(cè)結(jié)果圖；其中1:1C2 ；2:2G11 ；3:3A6 ；4:3D12 ；5:1C2 ；6:2G11 ；7:3A6 ；8:3D12 ；
[0054]其中，1-4道上樣 hLF g ;5-8 道上樣 bLF 4u g ；[0055]圖3為SDS-PAGE檢測(cè)純化后抗體純度檢測(cè)結(jié)果圖；其中1:蛋白marker ；2:3D12小鼠單克隆抗體；
[0056]圖4為單克隆抗體檢測(cè)樣品結(jié)果圖；其中1:轉(zhuǎn)基因牛奶；2:轉(zhuǎn)基因牛奶；3:轉(zhuǎn)基因牛奶；4:轉(zhuǎn)基因奶粉(管壁)；5:轉(zhuǎn)基因奶粉(管頂)；6:非轉(zhuǎn)基因脫脂奶粉；7:非轉(zhuǎn)基因脫脂奶粉；8:非轉(zhuǎn)基因牛奶；9:非轉(zhuǎn)基因牛奶；
[0057]圖5為hLF多克隆抗體純化考馬斯亮藍(lán)染色圖；
[0058]其中，1-1:BSA2mg/mL ； 1-2:BSAlmg/mL ； 1-3:BSA0.5mg/mL ； 1-4:BSA0.25mg/mL ；
1-5:BSA0.125mg/mL ;1_6:BSA0.0625mg/mL:2~1:洗脫管 I ;2_2:洗脫管 2 ;2_3:洗脫管 3 ； 2-4:洗脫管4 ；2-5:洗脫管5 ；2-6:洗脫管6 ；
[0059]圖6為hLF多克隆抗體效價(jià)圖；
[0060]圖7為hLF標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0061]圖8為模擬樣品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0062]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0063]轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因奶牛樣品來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；日本大耳白兔購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人乳鐵蛋白購(gòu)自Sigma公司。
[0064]人乳鐵蛋白(hLF)，牛乳鐵蛋白(bLF)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；96孔酶標(biāo)板購(gòu)自北京宏捷成生物科技有限公司；四甲基乙二胺(TEMED)購(gòu)自Amresca公司；96孔培養(yǎng)板、25孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、T-25培養(yǎng)瓶、T-75培養(yǎng)瓶、250mL培養(yǎng)瓶、2mL凍存管購(gòu)自corning公司；超濾管購(gòu)自Millipore公司；HAT、100XHT、PEG4000購(gòu)自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibico公司；石臘油購(gòu)自BBI公司；HRP標(biāo)記試劑盒(CatNo31488)購(gòu)自Pierce公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自中杉金橋生物公司；TMB (可溶型)購(gòu)自天根生物公司；IgG純化試劑盒購(gòu)自嘉興行建生物科技有限公司。
[0065]層析柱購(gòu)自Phamacia公司；渦旋儀，購(gòu)自江蘇海門(mén)市其林貝爾公司；高速微量離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;ElixRMilliQRBiocelTM純水系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；舒適性恒溫儀購(gòu)自eppendorf公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)、真空濃縮儀購(gòu)自eppendorf公司；電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自PolyScience公司；NanoDropl000紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自NanoDrop公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱、搖床購(gòu)自中國(guó)智成公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自UVP公司；PYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-31C微型水平電泳槽購(gòu)自北京六一廠；高壓滅菌鍋、_80°C冰箱購(gòu)自日本三洋公司；混合型球磨儀購(gòu)自Retsch公司；酶標(biāo)儀，BIO-RAD ;二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)自SANYO ;蛋白電泳裝置,購(gòu)自BioRad公司；蛋白定量檢測(cè)儀,購(gòu)自AmershamBiosciences公司。
[0066]轉(zhuǎn)基因牛奶、奶粉樣品來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，非轉(zhuǎn)基因牛奶及脫脂奶粉購(gòu)自超市。
[0067]實(shí)施例1hLF單克隆抗體的制備
[0068]1、小鼠抗體的制備
[0069]選擇6周齡同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組5只(1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，對(duì)照組2只。實(shí)驗(yàn)組用hLF進(jìn)行免疫，用PBS緩沖液代替hLF進(jìn)行免疫作為陰性對(duì)照。每只小鼠皮下注射總量為100 u L用佐劑乳化好的抗原(250 u LPBS溶解400 u g抗原后與250 u L弗氏不完全佐劑混合，共500 u L，每只小鼠注射100 u L)。第一次基礎(chǔ)免疫劑量為每只小鼠80 u g，加強(qiáng)免疫免疫劑量為每只小鼠40 ii g，基礎(chǔ)免疫時(shí)使用弗氏完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)用弗氏不完全佐劑乳化。基礎(chǔ)免疫后間隔10天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加強(qiáng)免疫后7天，尾靜脈采血，檢測(cè)血清中抗體滴度(間接ELISA法)，如滴度未達(dá)到1:104，ODl.0以上，則再加強(qiáng)免疫。在抗體滴度達(dá)到I: IO4后的第10天眼眶采血，分離血清，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0070]2、間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠的抗體水平
[0071]以hLF作為包被抗原，包被濃度:20 u g/mL,利用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體水平。實(shí)驗(yàn)組血清稀釋倍數(shù)依次為:1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000 ;對(duì)照組血清1:3000稀釋。
[0072]hLF間接ELISA法測(cè)定的基本操作步驟如下:
[0073](I)包被:將hLF用包被液(磷酸緩沖液pH9.6)稀釋至20 U g/mL，用微量加樣器吸取稀釋后的抗原加入96孔酶標(biāo)板，100 u L/孔，置4°C冰箱過(guò)夜。
[0074](2)洗滌:取出ELISA板，棄去孔內(nèi)液體，在紙巾上輕輕叩打以除去殘留液體，加入PBST洗滌液，300 ii L/孔，靜置Imin，重復(fù)操作3~5次。
[0075](3)封閉:用微量加樣器按200 u L/孔加1%BSA，放入37°C溫箱2h。
[0076](4)洗滌:同步驟2)。
[0077](5)加待檢樣本:用PBS緩沖液將血清稀釋，血清稀釋倍數(shù)依次為:1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:240000、1:720000 ；對(duì)照組血清 1:3000 稀釋，放入37°C溫箱 Ih ；
[0078](6)洗滌:同步驟2)。
[0079](7)加酶標(biāo)抗體:用PBST洗滌液將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋到工作濃度1:5000，每孔加 100 u L，37°C溫箱孵育 45min。
[0080](8)洗滌:同步驟2)。
[0081](9)加底物溶液:避光按100 U L/孔加入TMB底物溶液，室溫孵育15min。
[0082](10)終止反應(yīng):室溫下加終止液50 u L/孔,終止反應(yīng)。
[0083](11)測(cè)0D450值:檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下的OD值。
[0084]表1.經(jīng)三次免疫后小鼠血清效價(jià)的測(cè)定結(jié)果
[0085]
【權(quán)利要求】
1.人乳鐵蛋白單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCCN0.6394的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體經(jīng)親和柱純化得到。
3.權(quán)利要求1所述人乳鐵蛋白單克隆抗體在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉中人乳鐵蛋白中的應(yīng)用。
4.雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCCN0.6394。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK103570833SQ201210279849
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】朱振營(yíng), 劉建, 林祥梅, 吳紹強(qiáng), 付偉, 李風(fēng)翠, 仇松寅 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院