專利名稱：一種提高植物耐鎘的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體地說是一種提高植物耐鎘相關蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及利用該基因增加植物對鎘毒害耐受的方法。
背景技術：
近些年來，由于工業化的空前擴張，大量的礦物能源和資源被被開發，使得這些原本固定在巖石中的重金屬得以大量釋放到生命活動可以觸及的空間。這些重金屬造成的污染不僅會對土壤、水源造成嚴重危害；一旦進入生物體，更會極大損壞機體的正常功能。重金屬造成的水源和土壤污染已對全球的生態環境、食品安全、人類身體健康和農業可持續發展構成嚴重威脅。因此，重金屬污染一直是人類最關心的問題之一，而重金屬對于生物體的毒害也一直是科學研究的熱點。
鎘(Cd)是一種最具毒性的重金屬元素之一，具有很強的生物遷移性，極易被植物吸收并積累。土壤中Cd超過一定濃度時，就會影響植物的生理生化過程和生長發育，如對葉綠素有破壞作用，促進抗壞血酸分解，并能抑制植物各種功能酶活性，從而影響作物產量和品質；更為嚴重的是，Cd2+被作物富集吸收進入食物鏈，進而引起骨質疏松、貧血、高血壓抑及腎損傷等疾病。所以，培育在污染土壤上生長的耐鎘作物新品種成為人們關注的重點。擬南芥作為一種模式植物，廣泛用于植物遺傳學、發育生物學和分子生物學等研究領域。擬南芥的大多數基因在其它植物中都能找到，有關擬南芥的任何發現都能應用于其它植物研究。因此，對擬南芥抗重金屬毒害分子生物學機制的研究對特定區域提高作物的產量和增加食品安全性具有重要的理論與經濟意義。擬南芥基因組已完全測序，根據擬南芥測序數據庫(WWW. arabidopsis. org)尋找和發現新的具有自主知識產權的功能基因是國際植物學研究領域的熱點之一，也是不同國家之間科技競爭的焦點。擬南芥共有約1.3億個堿基對，2. 9萬個基因，其中大部分基因的功能還不清楚，而利用T-DNA插入技術研究基因功能已成為一種有效的方法。面對日益嚴重的重金屬污染尤其是土壤污染問題，尋找耐受重金屬的植物修復基因并闡明其功能具有重要的理論及實踐意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有耐鎘及增加植物鎘吸收的植物耐鎘蛋白及其編碼基因，通過該基因的過量表達可明顯增強轉基因植物對鎘的耐受性。本發明所提供的植物耐鎘及增加植物鎘吸收相關蛋白的編碼基因，命名為XCDl(AT3G10890)，來源于哥倫比亞野生型的擬南芥，其蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(I)序列表中的 SEQ ID No 2 ；(2)將序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列經取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基后衍生的與SEQ ID No :2限定的蛋白質具有相同活性的序列。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。X⑶I的 編碼基因也屬于本發明的保護范圍。X⑶I基因，選自下述核甘酸序列之一；(I)序列表中 SEQ ID No :I 的 DNA 序列；(2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質序列的多核苷酸；(3)在嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No :1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列；(4)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。序列表中的序列I由1546個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5’端第I位至1546位堿基，編碼序列SEQ ID No :2的蛋白質。含有本發明XCDl的表達載體、細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增XCDl中任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。本發明的第二個目的是提供一種利用該基因提高植物耐鎘及增加植物中鎘含量的方法。本發明所提供的提高植物耐鎘及增加植物中鎘含量的方法，是誘導或轉入植物中的上述植物耐鎘蛋白編碼基因的表達。誘導植物中的上述植物耐鎘蛋白編碼基因X⑶I的表達可通過植物轉基因技術的過量表達實現。本發明激活基因表達的方法并不限于此種方法，只要能激活XCDl基因表達均可。利用任何一種可引導外源基因的在植物中表達帶有強啟動子的載體，將本發明所提供的XCDl轉入植物中，植物表現為耐鎘。本發明利用正向遺傳學手段從化學誘導型激活標簽子系統構建的XVE突變體庫中篩選并通過表型鑒定得到功能獲得型耐鎘突變體xcdl，通過Tail-PCR技術獲得其基因序列，經華大基因測序并在NCBI數據庫中Blast比對，最后進行基因定位，獲得一個新的耐鎘基因X⑶I。通過轉基因技術，構建X⑶I基因的過量表達載體，導入根癌農桿菌GV3101菌株中，用花絮浸潰法進行擬南芥植株的遺傳轉化，并用抗生素篩選出3株轉化株，該轉基因植株在鎘脅迫下表現出明顯的耐鎘性狀。本發明的XCDl基因或其反義核酸在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物或雙子葉植物，如水稻、小麥、油菜、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。攜帶有本發明XCDl基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導，農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株。本發明根據擬南芥數據庫公布的基因組序列，X⑶I編碼一個(1，4)-0-甘露聚糖內水解酶。發明人發現在外加激素P-estradiol ( P -雌二醇)誘導下，用鎘處理突變體xcdl，植株表現為對鎘耐受，這表明XCDl基因涉及鎘耐受性的調控。我們研究該基因的表達，分析顯示外加激素誘導下鎘處理可誘導GSHl基因轉錄水平顯著提高，這說明誘導基因XCDl表達可以激活在擬南芥中螯合解毒機制中扮演重要角色的GSHl編碼基因的表達，將鎘螯合到不活躍的細胞器中，從而表現為對鎘耐受。同時，對XCDl基因構建過量表達轉基因植株，發現其亦表現為明顯的鎘耐受。因此，利用轉基因技術克隆重組有XCDl基因的植株不但可提高農作物類耐鎘生長，而且是土壤修復的良好材料。下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。
三

圖I是在含有100 U MCdCl2的1/2MS培養基中水平培養I周篩選到耐鎘突變體株xcdl。 圖2是突變體xcdl和野生型(WT，下同)植株對鎘耐受性比較(圖2A1-A4 分別表示在 1/2MS，1/2MS+10 ii M ^ -estradio, 1/2MS+75 u M CdCl2,1/2MS+10 u M-estradiol+75 u MCdCl2四種培養條件下表型；圖2B是根長比較；圖2C是鮮重比較；圖2D鎘含量比較)。圖3是VEX載體插入位點分析。圖4是X⑶I基因的35S過量表達(圖4A是分子水平鑒定；圖4B1-B3分別表示在1/2MS，1/2MS+50 u M CdCl2,1/2MS+75 u M CdCl2培養條件下的表型分析；圖4C是根長根長比較；圖4D是鮮重比較；圖4E是鎘含量比較)。圖5A-C 是 xcdl 和 WT 在 1/2MS 和 10 y M ^ -estradiol+75 u M CdCl2 條件下相關基因的表達水平。
五具體實施例方式下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。實施例I、X⑶I及其編碼基因的獲得利用化學誘導激活XVE (LexA-VP16-ER)突變體系統(由中國科學院遺傳與發育生物學研究所提供)，從含有100 UMCdCl2的1/2MS培養基中篩選到的擬南芥幼苗為材料(圖
I)，用經典的CTAB法提取的突變體基因組DNA為模板，進行如下Tail-PCR反應(Yao-GuangLiu et al. , 1995)Tail-PCR反應程序(共包括三輪反應，表I)Primary PCR (20pl 反應體系)
DNA(ItMOOngZpl)I pi
10-I>('R b uiTer2 |il
2.5 niMdNTPs1.6 pi
2 liM LcxA2 or Lc\A32 pi
50 jiM AD primer1.2 jil
Taq Polymerase (5 U/pl)0.2 pi
JcIH2Oto 20 pi
Secondary PCR ( 20 pi 反 hk體系)
DNA(1:50 dilution 181 product)I p,l
IOxPCR buffer2 pi
dNTPs (2.5 iiiM each)1.6 jil
LexA^ or I.ox.\4 (2 pM)2 |il
AD primer (50 pM)0.8 |il
Taq Polymerase (5 U/pl)0.15 pi
(JdH2Oto 20 jil
Tertiary PCR (20 pl 反應體.系)
DNA(1:50 dilution 2nd product)I pi
I OxPCR buffer2 pi
dNTPs (2.5 mM each)1.6 jil LexA4 or LexAS (2 mM)2 pi
AD primer (50 j.tM)0.8 j.tl
Taq Polymerase (5 U/pl)0,15 pi
CldH2Oto 20 ill表I Tail-PCR的反應程序
權利要求
1.一種植物耐鋪蛋白，其特征在于蛋白的氣基酸序列如序列表SEQ ID No :2所不或者由SEQ ID No 2經取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基后與SEQ ID No 2限定的蛋白質具有相同活性的序列。
2.如權利要求I所述的植物耐鎘蛋白的編碼基因，其特征在于選自下列核苷酸下列之一 (1)序列表中SEQID No I的DNA序列； (2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質序列的多核苷酸； (3)在嚴謹條件下可與序列表中SEQID No 1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列； (4)與SEQID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
3.根據權利要求2所述的植物耐鎘蛋白的編碼基因，其特征在于所述基因序列的ORF為SEQ ID No 1自5’端第I位至1546位堿基。
4.含有權利要求2所述的植物耐鎘蛋白的編碼基因序列的載體、轉基因細胞系及宿主菌。
5.權利要求2所述的編碼基因在提高植物耐鎘及增加植物中鎘積累的應用，其特征在于是通過誘導或轉入植物中權利要求2所述的植物耐鎘蛋白編碼基因的表達。
全文摘要
本發明公開了一種具有耐鎘及增加植物鎘吸收的植物耐鎘蛋白及其編碼基因，其特征在于該蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No2所示；核苷酸序列如SEQ ID No1所示，本發明通過誘導或轉入植物中上述耐鎘蛋白編碼基因的表達以增強植物對鎘的耐受性，因此可以利用轉基因技術克隆重組有上述基因的植株種植在鎘污染的環境中以修復土壤環境。
文檔編號C12N1/15GK102775484SQ20121028660
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月13日 優先權日2012年8月13日
發明者孫澤華, 曹樹青, 柏曉婭, 王敏, 陽立波 申請人:合肥工業大學