擬南芥jav1蛋白及其編碼基因在調控植物抗病和抗蟲性中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了擬南芥JAV1蛋白及其編碼基因在調控植物抗病和抗蟲性中的應用。本發明還提供了一種提高植物抗病和抗蟲性的方法及用于降低JAV1基因表達物質的發夾RNA、小干擾RNA及干擾載體和干擾片段。實驗證明，與野生型和轉空載體對照相比，T3代轉pBI121-JAV1-RNAi的擬南芥株系JAV1基因的相對表達量明顯降低；接種灰霉菌后的侵染葉片面積為0.25-0.27平方厘米，明顯小于野生型和轉空載體對照；用生長5周的葉片飼喂的甜菜夜蛾幼蟲，6天后體重增加1.58—2.03毫克，明顯低于野生型和轉空載體對照；用遲眼蕈蚊幼蟲放入生長有18天的各株系單株的土壤中，12天后植株仍能正常生長。本發明為培育抗病抗蟲植物提供了一條新的途徑，在農業生產領域具有廣闊的應用空間和市場前景。
【專利說明】擬南芥JAV1蛋白及其編碼基因在調控植物抗病和抗蟲性中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種擬南芥JAVl蛋白及其編碼基因在調控植物抗病和抗蟲性中的應用。
【背景技術】
[0002]植物在進化過程中會形成對害蟲或病原菌危害所產生的一定程度的避害、耐害或抗生的生態適應性。根據植物抗性研究開展的植物抗性基因工程是利用分子遺傳學原理，鑒定和分離抗性基因，并將抗性基因導入受體，獲得抗性穩定表達并遺傳的再生個體的生物技術。抗性基因多來自于天然的抗逆性生物，或是植物在逆境中產生的起保護作用的基因。將這些基因轉移到抗性差的品種中，就可以提高抗逆性。該技術多以過表達外源抗性基因為主，不同物種之間的差異可能會影響抗性效果。擬南芥(Arabidopsis thaliana)隸屬被子植物門雙子葉植物綱十字花科，是現代國際和國內進行植株生物學研究的模式植物。擬南芥作為研究的模式植物得益于幾個特點:基因組小，僅有5條染色體，約24000個基因；植株小；結子多；適于人工培養。對擬南芥基因功能的深入研究將有助于作物性狀的遺傳改良。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供擬南芥JAVl蛋白的新用途。該蛋白的氨基酸序列如序列表序列I所示，所述新用途即所述蛋白可用于調控目的植物的病害抗性和/或蟲害抗性，或調節序列表序列I所示蛋白表達量的物質或方法可用于調控目的植物的病害抗性和/或蟲害抗性。
[0004]所述病害可為傳染性病害或非傳染性病害；所述傳染性病害的生物病原物可為真菌、細菌、病毒和線蟲；所述真菌具體可為灰霉菌(Botrytis cinerea)。
[0005]所述蟲害的致病害蟲可為夜蛾、蕈蚊或蚜蟲；
[0006]所述夜蛾具體可為甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜紋夜蛾(SpodopteraIitura)或棉鈴蟲(Heliothis armigera)；
[0007]所述蕈蚊具體可為遲眼蕈蚊(Bradysia impatiens)或韭菜遲眼蕈蚊(Bradysiaodoriphage)；
[0008]所述姆蟲具體可為桃姆(Myzus persicae Siilzer)。
[0009]本發明提供一種發夾RNA，其核苷酸序列由一個莖環序列及位于所述莖環序列兩側的序列A和序列B組成，所述序列A和序列B反向互補；所述序列A為序列表序列I所示蛋白的編碼基因中200-500bp DNA轉錄得到的RNA序列。
[0010]所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA中不含有所述蛋白的編碼基因的5，UTR區或3’ UTR區序列。
[0011 ] 所述蛋白的編碼基因具體可為序列表序列2所示的DNA分子；其中，所述5’UTR區為序列表序列2的自5’末端第I位至第259位核苷酸；所述3’ UTR區為序列表序列2的自5’末端第839位至第1129位核苷酸。
[0012]所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA具體可為序列表序列2的第260-559位核苷酸序列所示的DNA。
[0013]由上述任一所述發夾RNA衍生的小干擾RNA也屬于本發明的保護范圍。
[0014]所述發夾RNA具體可為由如下序列依次相連組成的DNA片段轉錄形成的RNA --序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補序列。
[0015]本發明提供上述任一所述RNA (發夾RNA或小干擾RNA)的編碼基因。
[0016]所述RNA的編碼基因具體為如下I)或2)的DNA分子:
[0017]I)式I所示的DNA片段，(I) SEQ正向-X-SEQ反向，
[0018]所述SEQtt是序列表序列2中包括第260位至第559位的核苷酸段，
[0019]所述SEQg的序列與所述SEQtt的序列反向互補，
[0020]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互補；
[0021]2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋·白表達的DNA分子。
[0022]所述SEQ1^1的核苷酸序列具體可為序列表序列2中第260位至第559位核苷酸序列。
[0023]本發明保護下述3)或4)的DNA分子:
[0024]3)其核苷酸序列為序列表序列2的第260位至第559位核苷酸段；
[0025]4)在嚴格條件下與3)限定的DNA序列雜交的DNA分子；
[0026]本發明保護含有上述任一所述RNA的編碼基因或DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系、轉基因植物、重組菌或重組病毒。
[0027]所述重組載體具體可為載體pBI121-JAVl-RNAi 和 pTCK303_JAVl_RNAi ；
[0028]所述載體pBI121-JAVl_RNAi為在載體pBI121的Xba I和Sac I位點間插入了由如下序列依次相連組成的DNA片段:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補序列；
[0029]所述載體pTCK303-JAVl_RNAi為在載體pTCK303的Xba I和Sac I位點間插入了由如下序列依次相連組成的DNA片段:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補序列。
[0030]本發明提供一種提高植物的病害抗性和/或蟲害抗性的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達，得到病害抗性和/或蟲害抗性高于所述目的植物的轉基因植物；
[0031]所述病害的致病菌可為灰霉菌(Botrytis cinerea)；
[0032]所述蟲害的致病害蟲可為夜蛾或蕈蚊；[0033]所述夜蛾具體可為甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),所述蕈蚊具體可為遲眼蕈蚊(Bradysia impatiens)。
[0034]所述病害抗性高于所述目的植物表現可為:所述轉基因植物葉片接種所述病害的病原物后的侵染面積小于所述目的植物葉片接種所述病害的病原物后的侵染面積；
[0035]所述蟲害抗性高于所述目的植物表現可為:用所述轉基因植物葉片飼喂的所述致病害蟲的重量增加量小于用所述目的植物葉片飼喂的所述致病害蟲的重量增加量。
[0036]所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達具體是通過將上述任一所述RNA的編碼基因導入目的植物中表達上述任一所述RNA實現的。
[0037]本發明還提供另一種降低植物病害抗性和/或蟲害抗性的方法，是將序列表序列I所示蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到病害抗性和/或蟲害抗性低于所述目的植物的轉基因植物；
[0038]所述病害的致病菌可為灰霉菌(Botrytis cinerea)；
[0039]所述蟲害的致病害蟲可為夜蛾或蕈蚊；
[0040]所述夜蛾具體可為甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，所述蕈蚊具體可為遲眼蕈蚊(Bradysia impatiens)。
[0041]所述序列表序列I所示蛋白的編碼基因可為如下I)或2)或3)的基因:
[0042]I)序列表序列2中第260位至838位所示的DNA分子；
[0043]2 )序列表序列2所示的DNA分子；
[0044]3)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0045]4)在嚴格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子；
[0046]所述嚴格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.1 X SSC,
0.1%SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 XSSC,0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0047]所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；
[0048]所述雙子葉植物具體可為擬南芥或卷心菜；
[0049]所述單子葉植物具體可為玉米或水稻。
[0050]本發明保護通過上述任一所述方法所獲得的轉基因植物。
[0051]實驗證明，與野生型和轉空載體對照相比，T3代轉pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系JAVl基因的相對表達量明顯降低；接種灰霉菌后的侵染葉片面積為0.25-0.27平方厘米，明顯小于野生型和轉空載體對照的1.07和1.1平方厘米；用生長5周的葉片飼喂的甜菜夜蛾幼蟲，6天后體重增加1.58—2.03毫克，明顯低于野生型和轉空載體對照的2.9和3.0毫克；用遲眼蕈蚊幼蟲放入生長有18天的各株系單株的土壤中，12天后植株仍能正常生長而野生型植株矮小。本發明為培育抗病抗蟲植物提供了一條新的途徑，在農業生產領域具有廣闊的應用空間和市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1 為 RNAi 載體 pBI121-JAVl-RNAi 的 T-DNA 結構示意圖。
[0053]圖2為T1代轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株PCR鑒定電泳圖。其中，M代表分子量標準，WT為野生型擬南芥，P為質粒pBI121-JAVl-RNAi陽性對照，1-10為待測轉基因植株，含有目的條帶的為陽性轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株。 [0054]圖3為1\代轉空載體pBI121的擬南芥植株PCR鑒定電泳圖。其中，M代表分子量標準，WT為野生型擬南芥，P為質粒PBI121陽性對照，其余1-4為待測轉基因植株，含有目的條帶的為陽性轉空載體PBI121的擬南芥植株。
[0055]圖4為轉基因擬南芥的JAVl基因的相對表達量結果。其中，WT為野生型擬南芥，CK為轉空載體PBI121的擬南芥株系，L1-L7為7個1~3代轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株
系O
[0056]圖5為T3代轉pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系噴灑灰霉菌菌液的表型。其中，框中的植株為轉pBI121-JAVl-RNAi擬南芥，表現為對灰霉菌有一定抗性；其余植株為野生型及轉空載體的擬南芥，表現為對灰霉菌的侵染十分敏感。
[0057]圖6為T3代轉pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系滴加灰霉菌菌液的表型。其中，標尺代表2毫米。
[0058]圖7為T3代轉pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系的甜菜夜蛾幼蟲抗性鑒定結果。其中，標尺代表2毫米。
[0059]圖8為T3代轉pBI121-JAVl_RNAi的擬南芥株系的遲眼蕈蚊幼蟲抗性鑒定結果。其中，標尺代表2毫米。
【具體實施方式】
[0060]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0061]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0062]根癌農桿菌GV3101 (Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101):參考文獻:Cheng Huij Song Sushengj Xiao Langtaoj Soo Hui Mengj Cheng Zhiweij Xie Daoxinj PengJinrong.Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression ofMYB21, MYB24 and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis.PLoSGenetics.2009，5(3):e 1000440.公眾可從清華大學獲得。
[0063]pBI121:參考文獻:Zhiwei Cheng, Li Sun, Tiancong Qij Bosen Zhang, DaoxinXie.The bHLH Transcription Factor MYC3 Interacts with the JasmonateZIM-Domain Proteins to Mediate Jasmonate Response in Arabidopsis.Mol.Plant.2011,4(2):279-288.公眾可從清華大學獲得。
[0064]pTCK303:參考文獻:Zhen Wang, Changbin Chen, Yunyuan Xuj Rongxi Jiang, YeHan，Zhihong Xu and Kang Chong.A practical vector for efficient knockdownof gene expression in rice(Oryza sativa L.).Plant Molecular BiologyReporter.2004, 4(22):409-417.公眾可從清華大學獲得。
[0065]實施例1、擬南芥JAVl基因的獲得
[0066]提取擬南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia_0 生態型(ArabidopsisBiological Resource Center (ABRC),種子號:CS6673)花的總 RNA,反轉錄得至Ij cDNA,以該 cDNA 為模板，以引物 1:5’ -CGAATCAAATTAAACATTGT-3’ 和引物 2:5’ -AAAACATTTTTATTTATTT-3’進行PCR擴增。將得到的PCR產物測序，結果如序列表序列2所示。序列表序列2為擬南芥JAVl基因的全長cDNA序列，其中，自序列表序列2的第260-838位為開放閱讀框，編碼序列表序列I所示的由192個氨基酸組成JAVl蛋白；自序列表序列2的5’末端第I位至第259位為5’ UTR區；自序列表序列2的3’末端第839位至第1129位為3’ UTR區。
[0067]也可人工合成序列表中的序列2。
[0068]實施例2、利用JAVl的RNAi載體培育抗蟲抗病轉基因擬南芥
[0069]1、RNAi 載體 pBI121-JAVl_RNAi 的獲得
[0070]以實施例1 的擬南芥 cDNA 為模板，用引物 3:5，-GCTCTAGAATGGCTAACCCCAACGAGTG-3’(下劃線堿基為 Xba I 識別序列)和引物 4:5’-TTGGTACCAGCAGAAGTAGTATTACCGG-3’ (下劃線堿基為Kpn I識別序列)進行PCR擴增，獲得300bp左右的DNA片段，將該片段用XbaI和Kpn I雙酶切，與經過Xba I和Kpn I雙酶切的載體pTCK303的載體骨架片段相連，獲得中間載體I。
[0071]以實施例1 的擬南芥 cDNA 為模板，用引物 5:5，-CCACTAGTAGCAGAAGTAGTATTACCGG-3’(下劃線堿基為 Spe I 識別序列)和引物 6:5’-TAGAGCTCATGGCTAACCCCAACGAGTG-3’ (下劃線堿基為Sac I識別序列)進行P`CR擴增，獲得300bp左右的DNA片段，將該片段用SpeI和Sac I雙酶切，與經過Spe I和Sac I雙酶切的中間載體的載體骨架片段相連，獲得載體 pTCK303-JAVl-RNAi，經測序證實，載體 pTCK303_JAVl_RNAi 為在載體 pTCK303 的 Xba I和Sac I位點間插入了由如下序列依次相連組成的DNA:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補序列。
[0072]將載體pTCK303-JAVl_RNAi用Xba I和Sac I雙酶切后，回收Ikb左右的片段，與經過Xba I和Sac I雙酶切的pBI121載體骨架片段相連，獲得RNAi干擾載體pBI121-JAVl-RNAi，經測序證實，載體 pBI121_JAVl_RNAi 為在載體 pBI121 的 Xba I 和 SacI位點間插入了由如下序列依次相連組成的DNA:序列表序列2的第260-559位核苷酸序列、載體PTCK303的Kpn I和Spe I位點間的核苷酸序列和序列表序列2的第260-559位核苷酸序列的反向互補序列。該插入片段編碼具有莖環結構的發夾RNA，可產生20bp左右的小干擾RNA，該小干擾RNA再與目的基因JAZl的mRNA結合，最終沉默JAZl的表達。載體pBI121-JAVl-RNAi的T-DNA區結構示意圖如圖1所示。
[0073]2、轉基因擬南芥的獲得
[0074]I)重組根癌農桿菌的獲得
[0075]將載體pBI121_JAVl_RNAi用電擊法轉入根癌農桿菌GV3101 (Agrobacteriumtumefaciens Strain GV3101)中，提取陽性轉化子的質粒進行測序，證實該質粒為pBI121-JAVl-RNAi。將含有質粒pBI121-JAVl_RNAi的陽性轉化子即重組根癌農桿菌命名為 GV3101/pBI121-JAVl-RNAi。
[0076]2)轉基因擬南芥的獲得
[0077]用步驟I)得到的重組根癌農桿菌GV3101/pBI121-JAVl_RNAi浸花法轉化擬南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia-O生態型,收獲轉化當代擬南芥植株上所結的種子，播種于含卡那霉素20mg/L的MS篩選培養基上，得到123株具有卡那霉素抗性的T1代轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株。待T1代轉pBI121-JAVl_RNAi擬南芥植株長至4_6葉時移到蛭石上生長60天，光照時間(24°C:16小時/光照+8小時/黑暗)。
[0078]分別提取上述123株T1代轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株葉片基因組DNA，用CaMV35S啟動子上的特異引物5’ -ACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3’和JAVl基因上的一條反向引物5’-GTCGGTGTTGAGAAGCGT-3’進行PCR擴增，預測產物大小為420bp，共得到55株T1代陽性轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥植株，部分檢測結果如圖2所示。
[0079]采用同樣的方法，將空載體pBI121轉入擬南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-O生態型中，得到T1代轉空載體擬南芥植株。提取抗卡那霉素的T1代轉空載體擬南芥葉片的基因組DNA，用pBI121載體上CaMV35S啟動子上特異引物5’ -ACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3’ 和該載體上另條引物 5’ -TTAITTTATCAATAAATATT-3’ 進行PCR,預測產物大小為300bp，共得到10株T1代陽性轉空載體的擬南芥植株，部分檢測結果如圖3所示。
[0080]T1代表示轉化當代植株自交產生的種子及由它所長成的植株；T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株；τ3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株。
[0081]按照上述PCR檢測方法，檢測T1代PCR呈陽性的轉基因株系的T2代及T3代植株，將T3代植株全部呈PCR陽性的株系確定為純合轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株系或純合轉空載體的擬南芥株系。
[0082]3、轉基因擬南芥的熒光實時定量PCR檢測
[0083]取同一正常培養環境中生長21天的、步驟2獲得的7個T3代純合轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株系(編號為LI一L7)、T3代純合轉空載體擬南芥株系(CK)和野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia-O生態型(WT)的植株葉片，分別提取總RNA,反轉錄得到cDNA，再以此cDNA為模板，以JAVl基因特異引物7和8進行實時熒光定量PCR擴增，分析各株系植株內JAVl基因的表達情況，以Actin8為內參基因，引物為F和R。實時熒光定量PCR在ABI PRISlf 7500實時熒光定量PCR儀上進行，一次平行試驗設3次重復。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)報道的方法，即2_Δ Δετ計算相對表達量。
[0084]Δ Δ Cj^T.Actin^ Time x ^ ^T.Target ^T.Actin^ Time 0
[0085]Time x表示任意時間點，Time0表示經act in校正后I倍量的目標基因表達。
[0086]JAVl基因的特異引物序列如下(靶序列為序列表序列2的第260-835位):
[0087]引物7:5，-ATGGCTAACCCCAACGAG-3，；
[0088]引物8:5，-TTGCAACCTCGAAGA-3’ ；
[0089]內參基因Actin8的特異引物序列如下:
[0090]F:5’-TCAGCACTTTCCAGCAGATG-3’ ；
[0091 ] R:5’-CTGTGGACAATGCCTGGAC-3’。[0092]結果如圖4所示，野生型擬南芥JAVl基因的相對表達量為1.0 ;轉pBI121-JAVl-RNAi的擬南芥株系(L1-L7)的相對表達量均明顯小于I。野生型擬南芥(WT)和轉空載體擬南芥(CK)的結果無顯著差異。
[0093]4、轉基因擬南芥的抗病性鑒定
[0094]取步驟2中的4個編號為LI一L4的T3代純合轉pBI121_JAVl_RNAi的擬南芥株系、野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0生態型(WT)和T3代純合轉空載體擬南芥株系(CK)(每個株系取30個單株，設三次重復)按照如下方法進行灰霉菌抗性檢測:
[0095]I)灰霉菌(Botrytis cinerea)(文獻:Mercedes M.Keller, MiriamD.Cargnel, Patricia V.Demkura, Mieke de Wit, Micaela S.Patitucci, RonaldPierik, CorneM.J.Pieterse and Carlos L.Ballare.Low Red/Far-Red Ratios ReduceArabidopsis Resistance to Botrytis cinerea and Jasmonate Responses via aCOI1-JAZlO-Dependent, Salicylic Acid-1ndependent Mechanism Ignacio Cerrud0.Plant Physiology.2012, 158(4):2042-2052)用馬鈴薯培養基(每升加馬鈴薯200g，取浸出汁加瓊脂20g)，24V、12小時光照培養7到10天，收集孢子至濃度5 X IO5每毫升，按照每株2毫升的量均勻的噴灑于生長18天的擬南芥蓮座葉表面，黑暗放置18-24小時，保濕7天后，拍照，統計各株系內所有單株不同侵染級別的葉片數目(沒有侵染記為“O”;侵染面積在25%以下記為“I”;侵染面積在25%-50%之間的記為“2”;侵染面積大于50%的記為“3”)，分別計算各株系不同侵染級別的葉片數占株系所有葉片數的百分比，取各重復的平均值，結果表1所示。
[0096]表1.灰霉菌抗性檢測結果(不同侵染級別的葉片數百分比)
[0097]
【權利要求】
1.發夾RNA，其核苷酸序列由一個莖環序列及位于所述莖環序列兩側的序列A和序列B組成，所述序列A和序列B反向互補；所述序列A為序列表序列I所不蛋白的編碼基因中200-500bp DNA轉錄得到的RNA序列。
2.根據權利要求1所述的發夾RNA，其特征在于:所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA序列中不含有所述蛋白的編碼基因的5’ UTR區或3’ UTR區的序列； 所述蛋白的編碼基因具體可為序列表序列2所示的DNA分子； 所述蛋白的編碼基因中的200-500bp的DNA具體可為序列表序列2的第260-559位核苷酸序列所示的DNA。
3.由權利要求1或2所述發夾RNA衍生的小干擾RNA。
4.權利要求1-3中任一所述RNA的編碼基因； 所述RNA的編碼基因具體為如下I)或2)的DNA分子: 1)式I所示的DNA片段，(I)SEQm-X-SEQ反向， 所述SEQ1^1是序列表序列2中包括第260位至第559位的核苷酸段， 所述SEQ的序列與所述SEQm的序列反向互補， 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfiJg不互補； 2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%`、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且抑制序列表序列I所示蛋白表達的DNA分子。
5.根據權利要求4所述的編碼基因，其特征在于:所述SEQ1^1的核苷酸序列是序列表序列2中第260位至第559位核苷酸序列。
6.下述3)或4)的DNA分子: 3)其核苷酸序列為序列表序列2的第260位至第559位核苷酸段； 4)在嚴格條件下與3)限定的DNA序列雜交的DNA分子。
7.含有權利要求4-6中任一所述編碼基因或DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒。
8.一種提高植物的病害抗性和/或蟲害抗性的方法，是抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達，得到病害抗性和/或蟲害抗性高于所述目的植物的轉基因植物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述抑制目的植物中序列表序列I所示蛋白的表達具體是通過將權利要求4或5所述編碼基因導入目的植物中表達權利要求1-3中任一所述RNA實現的； 所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體可為擬南芥； 所述病害的致病菌為灰霉菌(Botrytis cinerea)； 所述蟲害的致病害蟲為夜蛾或蕈蚊。
10.序列表序列I所示蛋白在調控目的植物病害抗性和/或蟲害抗性中的應用； 所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥； 所述病害的致病菌為灰霉菌(Botrytis cinerea)； 所述蟲害的致病害蟲為夜蛾或蕈蚊。
【文檔編號】C12N15/84GK103589722SQ201210293627
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月16日 優先權日:2012年8月16日
【發明者】謝道昕, 胡珀, 周武 申請人:清華大學