專利名稱：一種從百合組織中同時(shí)提取dna和rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從百合組織中同時(shí)提取DNA和RNA的方法，尤其是從百合鱗片中同時(shí)提取DNA和RNA的方法。
背景技術(shù)：
提取較高質(zhì)量的DNA和RNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的一項(xiàng)最基本工作，使用一種簡便、高效的核酸提取方法對(duì)提高實(shí)驗(yàn)效率很有必要。目前，植物組織DNA的提取方法主要有CTAB法、SDS法、高鹽低滲法等，RNA提取的主要方法有異硫氰酸胍-酚-氯仿法(一步法)、CTAB法、SDS法和熱硼酸法等。這些提取方法的步驟基本相似，首先充分破碎植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，接著使核蛋白復(fù)合體中的蛋白充分變性，實(shí)現(xiàn)核蛋白與核酸的分離；同時(shí)抑制內(nèi)源和外源核酸酶的活性，防止核酸污染被降解，然后將DNA和RNA與多糖、多酚等雜質(zhì)分離，得到純凈的DNA或RNA，最后進(jìn)行質(zhì)量檢測。目前，常規(guī)的核酸提取方法或使用的試劑盒大都是針對(duì)單獨(dú)的DNA或RNA進(jìn)行提取，較少有用一種方法同時(shí)提取植物組織中的DNA和RNA。百合等植物中富含大量的多糖類物質(zhì)和酚類化合物，同時(shí)還含有較多的成分確定或不確定的次生代謝物。酚類化合物在勻漿和提取過程中極易被氧化成醌類物質(zhì)，與核酸發(fā)生不可逆結(jié)合，嚴(yán)重影響核酸的分離純化。多糖的許多理化性質(zhì)與核酸相似，在提取過程中與核酸共沉淀，很難將它們分尚。在植物生長發(fā)育過程中，包括DNase和RNase在內(nèi)的各種水解酶大量積累，同時(shí)各種次生代謝物質(zhì)大量積累，給植物組織中核酸的提取帶來極大的困難。近年來，有關(guān)從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取DNA或RNA的方法已有較多報(bào)道。葛曉萍等利用CTAB-LiCl法從蘋果和草莓的一些組織中提取到總RNA (一種適合多糖、多酚植物的RNA提取方法。青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28 :6-8)。郭書巧等也利用CTAB-LiCl法從甜葉菊中成功的分離了甜葉菊的總RNA (甜葉菊RNA分離方法研究。基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28 :101-104)。賈晉等確定了 SDS法為提取鹽爪爪核酸的最佳方法，同時(shí)增加了 LiCl和無水乙醇特異沉淀步驟，用于RNA的提取(鹽爪爪核酸提取方法研究。中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26:49-52)。陳肅等通過無水乙醇對(duì)植物材料的預(yù)處理，用CTAB-LiCl-無水乙醇法從一些木本植物組織中得到了質(zhì)量合格的RNA (—種快捷有效的提取樹木RNA方法。遼寧林業(yè)科技，2008，05:25-27)。尹慧等采用改進(jìn)了的CTAB從百合葉片中成功的提取了總RNA (百合葉片總RNA提取方法比較及優(yōu)化。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，13:41-45)。杜中軍等采用改進(jìn)的SDS法，結(jié)合使用無水乙醇和醋酸鉀除去多糖，從富含多糖的芒果組織中提取到完整的總RNA (—種改進(jìn)的富含多糖的芒果組織中完整總RNA的提取方法。植物生理學(xué)通訊，2005, 41:202-204)。楊秀梅等采用CTAB法提取百合鱗片基因組DNA，用去多糖緩沖液除去多糖，得到了高質(zhì)量的基因組DNA (百合鱗片DNA的提取及RGA-PCR體系的優(yōu)化。西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24:266-269)。侯思名等利用加入了抗氧化劑和高鹽溶液的CTAB法成功提取了苧麻組織的DNA (苧麻總DNA提取的CTAB法優(yōu)化方案。西北植物學(xué)報(bào)，2005，25:2193-2197)。占亞光等采用改良的CTAB法從白樺成熟葉片中提取了質(zhì)量較好的DNA (富含多糖的白樺成熟葉片DNA的提取方法。東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，33:24-25)。對(duì)于同時(shí)從一種植物組織中提取DNA和RNA的方法，一些文獻(xiàn)也有所報(bào)道。黃真池等利用鈣鹽分級(jí)沉淀法從尾葉桉葉片中得到了完整的DNA和RNA (—種木本植物RNA和DNA的簡捷提取方法。湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49:773-774)。魏利斌等采用CTAB法同步提取了芝麻中的DNA和RNA (芝麻DNA和RNA同步提取方法。分子植物育種，2008，06:1025-1030)。劉勝洪等利用高鹽低pH的緩沖液提取核酸，再用LiCl選擇性沉淀RNA,從獼猴桃組織中分離得到了 DNA和RNA (—種高效提取獼猴桃DNA和RNA的方法。生物技術(shù)通報(bào)，2011，09:171-175)。王伶平等利用CTAB法提取山藥總核酸，然后總核酸溶液一分為二，一份用于分離RNA，另一份用于分離DNA (—種同時(shí)提取植物DNA和RNA的方法。CN101486747B)。許多植物組織中富含多糖、多酚及次生代謝物質(zhì)，使得核酸提取困難。目前，對(duì)這些植物組織核酸的提取一般只針對(duì)單一的DNA或RNA，很少采用一種方法同時(shí)提取DNA和RNA。當(dāng)植物組織有限或較稀少時(shí)，單一的提取DNA或RNA很難滿足實(shí)驗(yàn)的需要。百合組織 中富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)，特別是百合鱗片中多糖含量極高，給百合組織核酸的提取帶來極大的困難。現(xiàn)有的同步提取植物DNA和RNA的方法存在耗時(shí)長、操作復(fù)雜、分離效率低等不足，而且對(duì)于百合組織DNA和RNA的提取效果并不好。因此，發(fā)展一種應(yīng)用廣、耗時(shí)少、操作簡便的同步提取百合組織中DNA和RNA的方法十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從百合組織中同時(shí)提取DNA和RNA的方法，尤其是從多糖含量很高的百合鱗片中同時(shí)提取DNA和RNA的方法。本發(fā)明共分為三步，第一步利用異硫氰酸胍法結(jié)合高濃度醋酸鉀去除多糖得到總核酸粗提沉淀；第二步采用DEPC處理過的ddH20溶解核酸沉淀，并用堿性的Tris平衡酚和氯仿純化總核酸，得到總核酸溶液；第三步利用氯化鋰和無水乙醇選擇性沉淀RNA，之后用醋酸鈉以及異丙醇沉淀DNA，最終依次獲得了 RNA和DNA。本發(fā)明包括以下具體步驟
(1)取0.5-lg百合植物組織，加入液氮研磨成粉末，按每克組織材料添加12-15ml的異硫氰酸胍提取緩沖液的比例加入預(yù)冷的異硫氰酸胍提取液，充分震蕩混勻，冰浴10_15min，再加入提取液1/10體積3mol L—1醋酸鈉(pH4. 5-5. 5)，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩沖液成分為4. 5mol L—1異硫氰酸胍，25mmol L—1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉，3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩沖液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的混合液中加入與提取液等體積的氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min后于4°C 12000g離心IOmin,取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入1/3提取液體積的8molL—1醋酸鉀(pH4. 5-5. 5，預(yù)冷)，顛倒混勻，冰上放置lOmin，4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入與提取液等體積的異丙醇，混勻后-20°C放置30min,接著4°C 12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；(5)用75%的乙醇清洗沉淀兩次，室溫下干燥20min，用0.5-lmL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.5-lmLTris飽和酚/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1:1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，于40C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(7)向步驟(6)的上清液中加入0.5-lmL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.125-0. 25mL IOmol L—1氯化鋰，混勻后加入
0.25-0. 5mL無水乙醇，上下顛倒混勻后_20°C放置2h沉淀RNA，4°C 14000g離心15min，取上清液置于新的離心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉淀兩次，室溫下干燥lOmin，用60-100y L DEPC處理過的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> (10)向步驟(8)得到的上清液中加入0.875-1.75mL異丙醇和0.0875-0. 175mL 3molL-1醋酸鈉(pH4. 5-5. 5)，混勻后-20°C放置30min沉淀DNA,室溫下12000g離心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下干燥lOmin，用60-100 u L TE緩沖液溶解，于-20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ玫闹参锊牧蠟槊呓俸蟵Lilium regale)的幼嫩鱗片、東方百合{LiIium"Oriental Hybrids")西伯利亞百合的幼嫩葉片、通江百合、Lilium sargentiae)的幼嫩根。本發(fā)明在傳統(tǒng)的異硫氰酸胍法提取RNA的基礎(chǔ)上，針對(duì)百合組織中富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的特點(diǎn)，特別是多糖含量極高的特點(diǎn)，做了以下改進(jìn)
在細(xì)胞裂解后，不直接用酚抽提，而是采取氯仿抽提兩次，能有效的去除次生代謝物質(zhì)。在異丙醇沉淀粗提核酸沉淀之前，兩次利用高濃度醋酸鉀沉淀多糖，能將有效去除溶液中的多糖。在沉淀RNA這一步,利用氯化鋰和無水乙醇協(xié)同選擇性沉淀RNA,使沉淀RNA的時(shí)間大大縮短，且RNA沉淀充分，接著利用異丙醇和醋酸鈉沉淀DNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所得到的RNA沒有DNA的污染，同時(shí)提取的DNA中也沒有RNA的殘留。本發(fā)明操作簡便，耗時(shí)較短，全部過程可在7小時(shí)內(nèi)完成，較好的解決了從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)百合組織提取DNA和RNA過程中多糖和次生代謝物質(zhì)干擾的問題，且可以同時(shí)得到高質(zhì)量的DNA和RNA，為后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了很好的基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明中從岷江百合鱗片中同時(shí)提取基因組DNA和總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道I為岷江百合鱗片基因組DNA ;泳道2為岷江百合鱗片總RNA。圖2為本發(fā)明中從西伯利亞百合葉片中同時(shí)提取的基因組DNA和總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道I為西伯利亞百合葉片基因組DNA ;泳道2為西伯利亞百合葉片總RNA。圖3為本發(fā)明中從通江百合根中同時(shí)提取的基因組DNA和總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中泳道I為通江百合根基因組DNA ;泳道2為通江百合根總RNA。圖4為本發(fā)明中岷江百合鱗片基因組DNA酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker 為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 DNA Marker,由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及IOObp六條DNA片段組成);泳道I為岷江百合鱗片基因組DNA ;泳道2為岷江百合鱗片基因組DNA的&oRI酶切產(chǎn)物；泳道3為岷江百合鱗片基因組DNA的漢^sHI酶切產(chǎn)物。圖5為本發(fā)明中西伯利亞百合葉片基因組DNA酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 DNA Marker);泳道I為西伯利亞百合葉片基因組DNA ；泳道2為西伯利亞百合葉片基因組DNA的及 oRI酶切產(chǎn)物；泳道3為西伯利亞百合葉片基因組DNA的酶切產(chǎn)物。圖6為本發(fā)明中通江百合根基因組DNA酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 DNA Marker);泳道I為通江百合根基因組DNA ;泳道2為通 江百合根基因組DNA的&0RI酶切產(chǎn)物；泳道3為通江百合根基因組DNA的及酶切產(chǎn)物。圖7為本發(fā)明中岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片、通江百合根總RNA用于擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的RT-PCR分析結(jié)果；其中Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 DNA Marker);泳道I為空白對(duì)照(ddH20為模板)；泳道2為岷江百合鱗片總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道3為西伯利亞百合葉片總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道4為通江百合根總RNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物。圖8為本發(fā)明中岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片、通江百合根總RNA用于擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白基因(Kifl)的RT-PCR分析結(jié)果；其中Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 DNAMarker);泳道I為空白對(duì)照(ddH20為模板);泳道2為岷江百合鱗片總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道3為西伯利亞百合葉片總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道4為通江百合根總RNA的RT-PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式下面通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例I :從岷江百合鱗片中同時(shí)提取RNA和DNA的方法，具體操作如下
(1)取液氮速凍的野生岷江百合幼嫩鱗片0.Sg，用液氮研磨成粉末，將樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到離心管中，加入12mL預(yù)冷的異硫氰酸胍提取緩沖液，充分震蕩混勻置于冰上12min，再加入1.2mL 3mol L—1醋酸鈉(pH5. 0)，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩沖液成分為4. 5mol I71異硫氰酸胍，25mmol I/1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉,3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩沖液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的樣品混合液中加入12mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min后于4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入4mL8mol L—1醋酸鉀(pH5. 0,預(yù)冷)，顛倒混勻,冰上放置10min，4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入12mL異丙醇，混勻后_20°C放置30min，接著4°C12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；(5)用75%的乙醇清洗沉淀兩次，室溫下干燥20min，用0.8mL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.8mL Tris飽和酹/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1: 1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，于40C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(7)向步驟(6)的上清液中加入0.8mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.2mLIOmol L—1氯化鋰，混勻后加入0. 4mL無水乙醇，上下顛倒混勻后_20°C放置2h沉淀RNA，40C 14000g離 心15min，取上清液置于新的離心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉淀兩次，室溫下干燥lOmin，用80ii LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> (10)向步驟(8)得到的上清液中加入1.4mL異丙醇和0.14mL 3mol L—1醋酸鈉(pH5. 0)，混勻后-20°C放置30min沉淀DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下干燥lOmin，用80 y L TE緩沖液溶解，于_20°C保存?zhèn)溆谩?yīng)用本發(fā)明的方法，從0. 8g野生岷江百合鱗片中提取了總RNA 63呢，總DNA76Pg，RNA和DNA的得率分別為78. 75Pg/g和95Pg/g。核酸質(zhì)量檢測經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(見圖I)表明從岷江百合鱗片中提取的DNA、RNA完整性好。在紫外分光光度計(jì)上測定260nm和280nm吸光度比值A(chǔ)260ZA280分別為I. 76和I. 95，而DNA和RNA純品的A26(l/A28(l分別為I. 8和2. O，可見利用本發(fā)明的方法從岷江百合鱗片中同時(shí)提取的RNA和DNA純度很高，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
實(shí)施例2 :從西伯利亞百合葉片中同時(shí)提取RNA和DNA的方法，具體操作如下
(1)取液氮速凍的東方百合品種西伯利亞幼嫩葉片lg，用液氮研磨成粉末，將樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到離心管中，加入12mL預(yù)冷的異硫氰酸胍提取緩沖液，充分震蕩混勻置于冰上15min,再加入I. 2mL 3mol L—1醋酸鈉(pH4. 5),顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩沖液成分為4. 5mol I71異硫氰酸胍，25mmol I/1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉,3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩沖液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的樣品混合液中加入12mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min后于4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入4mL8mol L—1醋酸鉀(pH4. 5,預(yù)冷)，顛倒混勻,冰上放置10min，4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入12mL異丙醇，混勻后_20°C放置30min，接著4°C12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；
(5)用75%的乙醇清洗沉淀兩次，室溫下干燥20min，用ImLDEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入ImLTris飽和酹/氯仿混合液,Tris飽和酹/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1:1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，于4°C12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；(7)向步驟(6)的上清液中加入ImL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.25mLIOmol L—1氯化鋰，混勻后加入0. 5mL無水乙醇，上下顛倒混勻后_20°C放置2h沉淀RNA，40C 14000g離心15min，取上清液置于新的離心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉淀兩次，室溫下干燥lOmin，用100y LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> (10)向步驟(8)得到的上清液中加入1.75mL異丙醇和0.175mL 3mol L—1醋酸鈉(pH4. 5)，混勻后-20°C放置30min沉淀DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下干燥lOmin，用100 y L TE緩沖液溶解，于_20°C保存?zhèn)溆谩?yīng)用本發(fā)明所述的方法，從Ig西伯利亞百合葉片中同時(shí)提取獲得了 102呢總RNA，135吒總DNA ；RNA和DNA的得率分別為102l^g/g和135Pg/g。 質(zhì)量檢測經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(見圖2)表明本發(fā)明提取的西伯利亞葉片的RNA、DNA完整性很好，在紫外分光光度計(jì)上測定260nm和280nm吸光度比值A(chǔ)260ZA280分別為
I.77和I. 96，而DNA和RNA純品的A26(l/A28(l分別為I. 8和2. O，可見利用本發(fā)明的方法從西伯利亞百合葉片中同時(shí)提取的RNA和DNA純度很高，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。實(shí)施例3 :從通江百合根中同時(shí)提取RNA和DNA的方法，具體操作如下
(1)取液氮速凍的通江百合幼嫩根0.5g，用液氮研磨成粉末，將樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到離心管中，加入6. 5mL預(yù)冷的異硫氰酸胍提取液，充分震蕩混勻置于冰上lOmin，再加入0. 65mL 3mol L—1醋酸鈉(pH5. 5)，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩沖液成分為4. 5molL—1異硫氰酸胍，25mmol L—1檸檬酸鈉，0. 5% (w/v)十二烷基肌氨酸鈉，3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩沖液加入ImL ^ -巰基乙醇；
(2)在步驟(I)得到的樣品混合液中加入6.5 mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min后于4°C 12000g離心lOmin,取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(3)向步驟(2)中得到的上清液中加入2.17mL 8mol L—1醋酸鉀(pH5. 5，預(yù)冷)，顛倒混勻，冰上放置10min，4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次；
(4)向步驟(3)得到的上清液中加入6.5mL異丙醇，混勻后_20°C放置30min，接著4°C12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；
(5)用75%的乙醇清洗沉淀兩次，室溫下干燥20min，用0.5mL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀；
(6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.5mL Tris飽和酚/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1: 1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，于40C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(7)向步驟(6)的上清液中加入0.5mL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中；
(8)向步驟(7)的上清液中加入0.125mL IOmol L^1氯化鋰，混勻后加入0. 25mL無水乙醇，上下顛倒混勻后_20°C放置2h沉淀RNA，40C 14000g離心15min，取上清液置于新的離心管中；(9)用75%的乙醇清洗步驟(8)得到的RNA沉淀兩次，室溫下干燥lOmin，用60ii LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> (10)向步驟(8)得到的上清液中加入0.875mL異丙醇和0.0875mL3mol L—1醋酸鈉(pH5. 5)，混勻后-20°C放置30min沉淀DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗兩次，在室溫下干燥lOmin，用60 y L TE緩沖液溶解，于_20°C保存?zhèn)溆谩?yīng)用本發(fā)明的方法，從0. 5g通江百合根中同時(shí)提取了總RNA 53呢，總DNA67Pg，RNA和DNA的得率分別為106Pg/g和134Pg/g。質(zhì)量檢測瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(見圖3)表明從通江百合根中同時(shí)提取的RNA、DNA完整性很好，在紫外分光光度計(jì)上測定260nm和280nm吸光度比值A(chǔ)26(l/A28(l分別為I. 76和I. 97，而DNA和RNA純品的A26(l/A28(l分別為I. 8和2. O，可見利用本發(fā)明的方法從通江百合根中同時(shí)提取的RNA和DNA純度很高，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。實(shí)施例4 :從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取基因組DNA 的酶切檢測
對(duì)上述實(shí)施例中應(yīng)用本發(fā)明的方法分別提取的岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根基因組DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，進(jìn)一步檢驗(yàn)所提取DNA的質(zhì)量。酶切反應(yīng)體系為基因組DNA 4吒；限制性內(nèi)切酶15U (.EcoRl或漢); 10XTango Buffer 2ML ;補(bǔ)充ddH20至終體積為20ML。酶切反應(yīng)時(shí)間為12h，酶切結(jié)束后取8ML用于瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果分別如附圖4、5、6所示。表明本發(fā)明從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取基因組DNA均能被&0RI或完全酶切，可見所提取的DNA質(zhì)量高，能滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所需。實(shí)施例5 :從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取總RNA的RT-PCR分析
根據(jù)上述實(shí)施例中測定的RNA濃度，分別將岷江百合鱗片、西伯利亞葉片以及通江百合根總RNA樣品稀釋至0. 5Pg/ML。采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系和操作過程如下分別取總RNA 5u g,加入oligo (dT) 2 u L,加入DEPC處理過的ddH20定容至14 u L0混勻后，70°C加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻
2min,然后加入下列成分5XFirst_stand buffer 4 u L> dNTP (IOmM each) 0. 5 u L>RNasin (40U) 0. 5 u L, M-MLV (200U) I u L0 混勻短時(shí)離心后，42°C溫浴 I. 5h，取出后95°C加熱5min終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于_20°C保存?zhèn)溆谩T-PCR共分析了兩個(gè)基因，百合3-磷酸甘油醛脫氫酶基因iGAPDH、以及肌動(dòng)蛋白基因Udi/ )，引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物長度以及引物退火溫度見表I。PCR反應(yīng)體系如下所示模板(第一鏈 cDNA) 0. 2u L, IOXBuffer 2 u L, dNTP (IOmM each) 0.5iiL，上游引物(IOuM) 0.2iiL，下游引物(IOiiM) 0.2 U L, Taq DNA polymerase (5U) 0.2 U L, ddH2016. 7 u L0 PCR 反應(yīng)條件為 94°C 3 min ；94°C 30s，59°C或 63°C 30s, 72°C 50s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。PCR結(jié)束后，取8 u L PCR產(chǎn)物在I. 2%TAE瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。結(jié)果分別見圖7和圖8，從岷江百合鱗片、西伯利亞百合葉片以及通江百合根中提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA均能成功擴(kuò)增出看家基因GAPDH、Actin的特異片段，兩個(gè)基因片段的大小均與預(yù)期值相符，表明本發(fā)明所提取的RNA質(zhì)量高，適合進(jìn)行RT-PCR及其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。表I :RT-PCR引物序列
權(quán)利要求
1.ー種從百合組織中同時(shí)提取DNA和RNA的方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)取0.5-lg百合植物組織，加入液氮研磨成粉末，按每克組織材料添加12-15ml的異硫氰酸胍提取緩沖液的比例加入預(yù)冷的異硫氰酸胍提取液，充分震蕩混勻，冰浴10_15min，再加入提取液1/10體積的pH4. 5-5. 5、3molじ1醋酸鈉，顛倒混勻；其中異硫氰酸胍提取緩沖液成分為4. 5molじ1異硫氰酸胍，25mmolじ1朽1檬酸鈉,0. 5% (w/v)十二燒基肌氨酸鈉，3% (w/v)可溶性聚こ烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取緩沖液加入ImL ^ -巰基こ醇； (2)在步驟(I)得到的混合液中加入與提取液等體積的氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min后于4°C 12000g離心IOmin,取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次； (3)向步驟(2)中得到的上清液中加入1/3提取液體積的pH4.5-5. 5、8molじ1預(yù)冷醋酸鉀，顛倒混勻，冰上放置lOmin，4°C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中，重復(fù)此步驟一次； (4)向步驟(3)得到的上清液中加入與提取液等體積的異丙醇，混勻后-20°C放置30min,接著4°C 12000g離心lOmin,得到核酸粗提沉淀物； (5)用75%的こ醇清洗沉淀兩次，室溫下干燥20min，用0.5-lmL DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀； (6)在步驟(5)得到的總核酸溶液中加入0.5-lmLTris飽和酚/氯仿混合液，Tris飽和酚/氯仿混合液中Tris飽和酚與氯仿的體積比為1:1，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，于40C 12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中； (7)向步驟(6)的上清液中加入0.5-lmL氯仿，劇烈震蕩混勻，冰上放置5min，4°C12000g離心lOmin，取上清置于新的離心管中； (8)向步驟(7)的上清液中加入0.125-0. 25mL IOmolじ1氯化鋰，混勻后加入0. 25-0. 5mL無水こ醇，上下顛倒混勻后_20°C放置2h沉淀RNA，4°C 14000g離心15min，取上清液置于新的離心管中； (9)用75%的こ醇清洗步驟(8)得到的RNA沉淀兩次，室溫下干燥lOmin，用60-100y LDEPC處理過的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存?zhèn)溆茫? (10)向步驟(8)得到的上清液中加入0.875-1. 75mL異丙醇和0. 0875-0. 175mLpH4. 5-5. 5的3molじ1醋酸鈉，混勻后-20°C放置30min沉淀DNA，室溫下12000g離心15min，得到DNA沉淀，用75%こ醇清洗兩次，在室溫下干燥lOmin，用60-100 u L TE緩沖液溶解，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求I所述的從百合組織中同時(shí)提取DNA和RNA的方法，其特征在于百合植物組織為野生岷江百合幼嫩鱗片、東方百合品種西伯利亞幼嫩葉片、通江百合的幼嫩根中的ー種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)提取百合組織中DNA和RNA的方法，該方法是利用百合組織樣品經(jīng)過相同的步驟粗提和純化，得到總核酸溶液，再依次選擇性沉淀RNA和DNA，得到高質(zhì)量的DNA和RNA；本發(fā)明方法優(yōu)點(diǎn)在于所用時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)快速、穩(wěn)定性好，并且提取的核酸質(zhì)量高；其特點(diǎn)在于兩次利用高濃度醋酸鉀沉淀多糖，能有效地去除百合樣品中的多糖；在DNA和RNA分離過程中，先用氯化鋰和無水乙醇協(xié)同作用選擇性沉淀RNA，然后利用醋酸鈉和異丙醇沉淀DNA，DNA和RNA分離效率高，核酸損失小，且沉淀時(shí)間大大縮短。該方法適用于從富含多糖及其他次生代謝物質(zhì)的百合組織中同時(shí)提取DNA和RNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102776174SQ20121029646
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者劉亞龍, 劉迪秋, 李紅麗, 葛鋒, 陳朝銀, 饒健 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)