專利名稱：一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及松材線蟲的檢測方法，具體涉及一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
松材線蟲病又稱松樹萎蔫病。是松樹的一種毀滅性流行病。在我國松褐天牛(Monochamus alternatus)是它的主要傳媒昆蟲。致病力強，寄主死亡速度快；一旦發生，治理難度大。松樹感染松材線蟲病40天即可死亡，受害林分從松樹發病到整片松林毀滅只需3-5年的時間，且傳播蔓延迅速。它不僅給國民經濟造成巨大損失，也破壞了自然景觀及生態環境，對我國豐富的松林資源構成嚴重威脅。自1982年發現以來，快速擴散，對我國南方數百萬公頃的松林構成毀滅性威脅。目前仍無有效的防治辦法，被稱為松樹的“癌癥”。國內外均將該病列為重要的植物檢疫對象。 目前松材線蟲的檢驗方法主要是選取木片或木屑，加水浸泡24小時，取下部浸泡液離心，取其沉淀液置于解剖鏡下，對照松材線蟲的形態特征進行檢查鑒定，該方法檢測時間長，對操作人員有一定專業要求。因此迫切需要種，快速、簡便、準確檢測松材線蟲的方法。在中國專利申請200710092787. 9中，公開了一種松材線蟲分子檢測快速制樣方法，是專門針對對林業影響巨大的松材線蟲而建立起的快速制樣的方法。該方法直接提取疫木中松材線蟲DNA，配合PCR技術，可以檢測出I. 5g木屑中的I條松材線蟲，時間僅需要3h，效果穩定可靠，但其儀器比較昂貴。在中國專利申請200810134583. I中，公開了一種交叉引物擴增靶核酸序列的方法及用于擴增靶核酸序列的試劑盒及其應用，其特點是針對靶基因的6個區域設計6種(3對分別為I對交叉擴整引物、I對剝離引物、I對檢測引物)特異引物，引物尾端交叉互換序列，利用鏈置換DNA聚合酶(如，但不限于，Gst DNA聚合酶)在恒溫條件即可完成核酸擴增反應。不需要模板的變性、多次溫度循環等過程。在中國專利申請200610003429. I中，公開了一種核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條及其用途，將特異性抗體A吸附于有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；將另一種特異性抗體一無色抗B抗體固定于膜上形成檢測線；待測核酸進行擴增時，將所使用的探針或是引物用A抗原或B抗原標記，形成擴增物、探針、引物、抗原A、抗原B的復合物，將該復合物與吸附有色顆粒的抗體A結合，得到的該有色顆粒復合物在溶液中通過毛細血管現象眼纖維膜向上流動只抗體B檢測條時，與線條上的抗體B結合，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條。在中國專利申請200610109620. 4中，公開了一種全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置，在其中使用了中國專利申請200610003429. I的試紙條，達到了全封閉檢測的效果
發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種定性檢測松材線蟲的試劑盒，使其具有重復性好、快速、靈敏度高等特點。本發明的另一目的是提供一種利用上述試劑盒定性檢測松材線蟲的方法。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種定性檢測松材線蟲的試劑盒，試劑包括DNA提取液，松材線蟲核酸恒溫擴增反應液，陽性對照和陰性對照；其中，陽性對照為含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質粒，陰性對照為無菌雙蒸水；
所述的松材線蟲核酸恒溫擴增反應液的組成為0. Γ0. 2ymol正向外圍引物，
O.Γ0. 2ymol反向外圍引物，O. Γθ. 5ymol正向交叉引物，O. Γθ. 5ymol反向交叉引物，O. I O. 5 μ mol 正向探針,O. I O. 5 μ mol 反向探針，I 6mmol MgSO4,0. 2 0. 4mmol dNTPs 溶液,6 10U Gst DNA聚合酶,2 μ L 10XThermol buffer,無菌雙蒸水補足到16 μ L。
所述的正向外圍引物序列為5 ’ -TCCTCACCTGGCTCTT-3 ’；反向外圍引物序列為’-CTAAACTCCCCATCTC-3’;兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標記探針5_biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向 3’ 端異硫氰酸熒光素(FitC)標記探針 5- AGGCGTTCACCAGT-FITC ;擴增交叉引物分別為反向交叉引物5’ - GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3 ’，正向交叉弓丨物 5 ’ -GACGTCGCATGTAGC-3，。所述的IOXThermol buffer 的組分為20mM Tris-HClUOmM KClUOmM(NH4)2S04、2mM MgSO4、質量濃度為 0. 1% 的 Triton Χ-100，ρΗ8· 8 ；
所述的含有松材線蟲BxSl基因的DNA片段為長193bp的基因序列，具體序列如SEQ IDNO: 7(TCCTCACCTGGCTCTTCGGCCGTTCCGCTTTGGCCTTATTCCGACGTCGCATGTAGCCGTGGATGGAATGCCGACCCCTGGCCGGTCTTTTCGGCCACACCACCTTCAACGAGGCGTTCACCAGTTGGCCGTCCCGGTTCTCGACCACAGAGTACGATGGAGGAGTAATGGTTGACTGAGATGGGGAGTTTAG)所示。所述的含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質粒，由以下方法制備
(1)利用正向外圍引物和反向外圍引物，以松材線蟲的基因組DNA為模板，進行PCR擴增獲得目的基因的PCR擴增產物；
(2)純化PCR擴增產物；
(3)將純化后的擴增產物通過質粒轉染試劑盒構建質粒；
(4)抽提質粒，定量并稀釋至IO5拷貝，-20°C保存。試劑盒定性檢測松材線蟲的方法，包括以下步驟
a)用DNA提取液從待檢測的標本中提取DNA；
b)以提取得到的DNA作為模板，加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中，對照PCR管中分別加入標準陽性模板和標準陰性模板，在60 65°C下擴增反應60 65min ；
c)將反應后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進行檢測，15min以后判讀結果。步驟b)中，63°C下擴增反應60min。本發明提供了利用核酸恒溫擴增檢測松材線蟲的試劑盒，對不同的反應條件進行了優化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應溫度等的優化，并將本發明與核酸檢測試紙條檢測系統相結合，建立了松材線蟲核酸恒溫擴增定性檢測的方法。該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出100拷貝，可以滿足快速檢測松材線蟲的要求。有益效果與現有技術相比，本發明的定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法，利用核酸恒溫擴增檢測松材線蟲，對不同的反應條件進行了優化，使其靈敏度可在每個反應體系中檢出100拷貝。并通過重復實驗，證實檢測結果無顯著性差異，具有良好的重復性。且對樣本的檢測僅僅需要2h就能完成，大大縮短檢測時間。同時本試劑盒只需要I人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測一個到數百個樣本，這樣也減少了人力的浪費。可以滿足快速檢測松材線蟲的要求，具有很好的實用性。


圖I是利用實施例I試劑盒檢測松材線蟲的特異性的實驗結果圖；圖中，1、2、3、4依次為擬松材線蟲、松材線蟲、陽性對照、陰性對照。圖2是利用實施例I試劑盒檢測松材線蟲的靈敏度的實驗結果圖；圖中，1-6依次為松材線蟲質粒IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、10拷貝、陽性對照(IO5拷貝)、陰性對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。 實施例I
定性檢測松材線蟲的試劑盒,組成如下
(I)DNA提取試劑可以為常規的市售DNA提取試劑，優選使用杭州優思達生物技術有限公司的無儀器核酸提取試劑盒。(2)松材線蟲核酸恒溫擴增反應液兩條外圍引物(各O. I μ mol)，兩條探針(各
O.5 μ mol)，兩條交叉引物(各 O. 5 μ mol)，10 X Thermol buffer, MgSO4 (6mmol)，dNTPs 溶液(O. 4mmol)，Bst DNA聚合酶(IOU)，無菌雙蒸水補足16 μ L。 其中正向外圍引物序列為5 ’ -TCCTCACCTGGCTCTT-3 ’ ；反向外圍引物序列為’-CTAAACTCCCCATCTC-3’;兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標記探針5_biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向 3’ 端異硫氰酸熒光素(FitC)標記探針 5- AGGCGTTCACCAGT-FITC ;擴增交叉引物分別為反向交叉引物5 ’ - GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3 ’，正向交叉弓丨物 5 ’ -GACGTCGCATGTAGC-3，。IOXThermol buffer 的組成20mM Tris-HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4,0. l%Triton X-IOO0以上所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。(3)陽性對照含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質粒。BxSl基因DNA片段序列如 SEQ ID NO:7 所示。陽性對照的制備步驟利用兩條外圍引物和以松材線蟲的基因組DNA模板進行PCR擴增獲得目的基因；用Promega公司的PCR純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化；將純化后的擴增產物通過Promega公司的T_easy質粒試劑盒,構建含有目的基因片段的質粒；用分光光度計測A28tl定量并稀釋至IO5拷貝，_20°C保存。(4)陰性對照無菌雙蒸水。實施例2
用實施例I的試劑盒定性檢測松材線蟲，具體方法為
(I)用DNA提取試劑盒從待檢測的標本中提取DNA。其具體方案參見DNA提取試劑盒使用說明。(2)取4 μ L標本DNA作為模板加入到裝有16 μ L松材線蟲核酸恒溫擴增反應液的PCR管中，對照PCR管中分別加入等體積的陽性對照模板和陰性對照模板，在63°C進行擴增反應60min。(3)將反應后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置(試紙條，參見CN1888902A或者CN1811447A)中進行檢測，15min以后判讀結果。當樣本中含有松材線蟲核酸時，試紙條的檢測線上呈陽性。反復重復實驗3次，檢測結果無顯著性差異，說明本試劑盒的不同批次間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性。上述實施例說明，用本發明的試劑盒來檢測重復性好’且對樣本的檢測僅僅需要2h就能完成，大大縮短檢測時間。同時本試劑盒只需要I人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測一個到數百個樣本，這樣也減少了人力的浪費。
實施例3
用實施例I的試劑盒檢測松材線蟲的專一性。按照實施例2的方法檢測松材線蟲、擬松材線蟲和陽性對照品；結果如圖I。從圖I測試結果可見，用本發明試劑盒檢測松材線蟲核酸具有很強的專一性。實施例4
用實施例I試劑盒檢測松材線蟲核酸的靈敏度。先提取含松材線蟲基因組DNA，然后用兩條外圍擴增引物利用PCR擴增目的基因片段(具體序列如SEQ ID NO: 7所示);再將擴增出來的基因片段用V-easy載體構建含有目的片段的質粒，對其進行定量。并對定量后的質粒，按照濃度梯度稀釋至濃度為IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、10拷貝，采用實施例2的方法來確定實施例I試劑盒用于檢測松材線蟲核酸的靈敏度。結果如圖2所示，圖中1-6分別表示IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、10拷貝、陽性對照和陰性對照，可以發現該試劑盒可在反應體系中檢出IO2拷貝的質粒稀釋液，具有很高的靈敏度，可以滿足快速檢測松材線蟲的要求。
權利要求
1.一種定性檢測松材線蟲的試劑盒，其特征在于，試劑包括DNA提取液，松材線蟲核酸恒溫擴增反應液，陽性對照和陰性對照；其中，陽性對照為含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質粒，陰性對照為無菌雙蒸水； 所述的松材線蟲核酸恒溫擴增反應液的組成為0. Γ0. 2ymol正向外圍引物，·O. Γ0. 2ymol反向外圍引物，O. Γθ. 5ymol正向交叉引物，O. Γθ. 5ymol反向交叉引物，·O.I O. 5 μ mol 正向探針,O. I O. 5 μ mol 反向探針，I 6mmol MgSO4,0. 2 O. 4mmol dNTPs 溶液,6 IOU Gst DNA聚合酶,2 μ L 10XThermol buffer,無菌雙蒸水補足到16 μ L ; 所述的正向外圍引物序列為5’ -TCCTCACCTGGCTCTT-3’ ；反向外圍引物序列為’-CTAAACTCCCCATCTC-3’;兩條探針的序列分別為正向5’端Biotin標記探針5_biotin-TCTTTTCGGCCACACC-3’，正向 3’ 端異硫氰酸熒光素(FitC)標記探針 5- AGGCGTTCACCAGT-FITC ;擴增交叉引物分別為反向交叉引物5’ - GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC-3 ’，正向交叉弓丨物 5 ’ -GACGTCGCATGTAGC-3，。
2.根據權利要求I所述的定性檢測松材線蟲的試劑盒，其特征在于所述的IOXThermol buffer 的組分為20mM Tris-HClUOmM KCl UOmM (NH4) 2S04、2mM MgS04、質量濃度為 O. 1% 的 Triton Χ-100，ρΗ8· 8。
3.根據權利要求I所述的定性檢測松材線蟲的試劑盒，其特征在于所述的含有松材線蟲BxSl基因的DNA片段為長193bp的基因序列，具體序列如下SEQ ID N0:7所示。
4.根據權利要求I或3所述的松材線蟲檢測試劑盒，其特征在于所述的含有松材線蟲BxSl基因DNA片段的質粒，由以下方法制備 (1)利用正向外圍引物和反向外圍引物，以松材線蟲的基因組DNA為模板，進行PCR擴增獲得目的基因的PCR擴增產物； (2)純化PCR擴增產物； (3)將純化后的擴增產物通過質粒轉染試劑盒構建質粒； (4)抽提質粒，定量并稀釋至IO5拷貝，-20°C保存。
5.權利要求I所述的試劑盒定性檢測松材線蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟 a)用DNA提取液從待檢測的標本中提取DNA； b)以提取得到的DNA作為模板，加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中，對照PCR管中分別加入標準陽性模板和標準陰性模板，在60 65°C下擴增反應60 65min ； c)將反應后的PCR管放置到核酸防污染檢測裝置中進行檢測，15min以后判讀結果。
6.根據權利要求5所述的試劑盒定性檢測松材線蟲的方法，其特征在于步驟b)中，·63 °C下擴增反應60min。
全文摘要
本發明公開了一種定性檢測松材線蟲的試劑盒及其檢測方法；試劑盒的試劑包括DNA提取液，松材線蟲核酸恒溫擴增反應液，陽性對照和陰性對照；其中，陽性對照為含有松材線蟲BxS1基因DNA片段的質粒，陰性對照為無菌雙蒸水。該試劑盒利用核酸恒溫擴增檢測松材線蟲，靈敏度可在每個反應體系中檢出100拷貝；經過重復實驗，檢測結果無顯著性差異，具有良好的重復性；且對樣本的檢測僅僅需要2h就能完成，大大縮短檢測時間；同時本試劑盒只需要1人就可以完成所有的操作過程，可一次性檢測一個到數百個樣本，這樣也減少了人力的浪費；可以滿足快速檢測松材線蟲的要求，具有很好的實用性。
文檔編號C12Q1/68GK102827933SQ20121030353
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者葉建仁, 胡林, 陳鳳毛, 侯建華, 吳小芹, 孫波, 黃麟, 詹國輝, 徐高連, 賀君麗, 范椰, 吳芳 申請人:南京林業大學, 杭州優思達生物技術有限公司