專利名稱：：一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于棉花分子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法，方法易行，操作簡便，費(fèi)用低廉，能高效快捷的發(fā)掘miRNA分子標(biāo)記，而且由于SRAP引物設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，所得的miRNA標(biāo)記可能為功能基因。
背景技術(shù)：
：MicroRNA是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，，長約2025nt，miRNA基因的前體是約為70nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子(Barteetal.1997；Laietal.2003)，它經(jīng)過核糖核酸酶III(Dicer)的剪切加工，形成長約22nt的單鏈miRNA分子，幾乎所有的miRNA都是從前體的一條臂上加工而來，只有極少數(shù)的個(gè)例可以從前體的兩條臂上同時(shí)產(chǎn)生miRNA(Lee，Y.etal.2003)。micix)RNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，而且絕大部分落于基因間隔區(qū)，說明它們的轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他的基因，具有本身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。在植物細(xì)胞中，它參與了基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，主要通過與靶基因mRNA的特定位點(diǎn)結(jié)合，抑制蛋白的合成或誘導(dǎo)mRNA的降解而起作用。自2002年miRNA在植物中發(fā)現(xiàn)以后，植物中越來越多的miRNA相繼被報(bào)道，由于其在植物和動(dòng)物的生命活動(dòng)過程中起著重要的調(diào)控作用而受到越來越廣泛的關(guān)注。miRNA作為一種調(diào)節(jié)分子廣泛的參與到動(dòng)植物的發(fā)育中，研究發(fā)現(xiàn)，植物miRNA作用的目的mRNA大都編碼轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與分生組織的特性、細(xì)胞的分裂、器官的分離、器官的極性相關(guān)，而且某些轉(zhuǎn)錄因子可能與棉花纖維的發(fā)育與伸長有關(guān)，因此miRNA的研究對于提高棉花產(chǎn)量和改善纖維品質(zhì)具有重要的意義。在2002年，miRNA被Science雜志評為十大科技突破第一名，目前miRNA成為研究的熱點(diǎn)之一，但到目前為止對miRNA進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)的文章卻很少，僅2011年P(guān)ang發(fā)表的ComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons—篇。AFLP以其精確有效的特點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用，但是，其步驟相對復(fù)雜，需要經(jīng)過DNA消化、連接、擴(kuò)增等多步反應(yīng)，各步的反應(yīng)條件很難控制，出現(xiàn)假陽性機(jī)率較高，并且AFLP技術(shù)受到專利保護(hù)試劑盒昂貴，成本較高，而且對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高。AFLP譜帶多，但分析程序復(fù)雜、成本高有時(shí)要用到同位素，識(shí)別AATT位點(diǎn)的MseI酶常會(huì)引起一些物種基因組中標(biāo)記分布不均衡，基因組不完全酶切，染色體聚集，這在一定程度上限制了它們的發(fā)展。基于此背景本實(shí)驗(yàn)利用miRNA保守序列設(shè)計(jì)的簡并引物與SRAP引物進(jìn)行組合開發(fā)miRNA分子標(biāo)記，希望能高效快捷的發(fā)掘更多的miRNA分子標(biāo)記。SRAP標(biāo)記具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、可產(chǎn)生共顯性標(biāo)記、便于克隆測序目標(biāo)片段的特點(diǎn)，因此兼具AFLP的多態(tài)性高、產(chǎn)率中等、重復(fù)性好和RAPD的操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。被廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖的構(gòu)建和比較基因組學(xué)等方面，SRAP標(biāo)記引物設(shè)計(jì)原理是利用基因外顯子里GC含量豐富，而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的引物，對開放閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增，因此本miRNA分子標(biāo)記開發(fā)方法所得標(biāo)記可能為功能標(biāo)記，對miRNA的研究具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法，利用miRNA保守序列引物與SRAP引物(Sequence-relatedamplifedpolymorphism)進(jìn)行組合制備miRNA分子標(biāo)記，方法易行，操作簡便，能高效快捷的發(fā)掘miRNA分子標(biāo)記，而且由于SRAP引物設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，所得的miRNA標(biāo)記可能為功能基因,對今后miRNA的研究具有一定的參考價(jià)值。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法，其步驟是(I)利用已知的128個(gè)SRAP引物(劉大軍.陸地棉SRAP圖譜構(gòu)建與種子物理、營養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL定位.博士學(xué)位論文.西南大學(xué)圖書館，2010)，與23個(gè)保守的pre-miRNA引物(弓I物序列見MingxiongPang,ChaozhuXinga,NickAdamsComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons.JournalofPlantPhysiology,168(2011)824-830),利用兩兩組合的方式(共計(jì)2944對引物),在常溫條件下利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對鄂棉22(ZhangYanxin等，CharacteristicsandanalysisofsimplesequencerepeatsinthecottongenomebasedonlinkagemapconstructedfromaBC1populationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense,Genome,2008(51):534-546)和海島棉品系3-79(李武等，海島棉遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析，作物學(xué)報(bào)ACTAAGR0N0MICASINICA2008,34(5):893-898)兩個(gè)親本進(jìn)行三次多態(tài)性篩選，挑選出穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記組合，得到55對親本間呈多態(tài)性的SSR引物，引物多態(tài)性率為I.87%。(2)以陸地棉品種鄂棉22為母本，海島棉品系3-79為父本,雜交得F1，后用鄂棉22給Fl授粉得含141個(gè)單株的海陸種間BC1群體。(3)采集步驟(2)中BC1群體的各單株的葉片和鄂棉22、海島棉品系3-79以及F1的葉片，提取gDNA(方法參照PatersonAH,BrubakerC,WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep,1993,11:122—127)。(4)以兩親本鄂棉22和海島棉品系3-79、F1^Hl個(gè)BC1單株共144個(gè)個(gè)體的DNA為模板，用步驟(I)中篩選出的55對多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%(V/V)變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。(5)記錄下各引物擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上的多態(tài)性信息。具體如下對于共顯性標(biāo)記，用“A”表示母本鄂棉22的純合帶型，用“B”表示父本海島棉品系3-79的純合帶型，用“H”表示兩親本的雜合帶型；；數(shù)據(jù)缺失用表示。(6)在構(gòu)建高密度海陸種間圖譜(Yu,Y,Yuan,D.J.,Liang,S.G.,Li,X.M.,Wang,X.Q.,Lin,Z.X.,andZhang,X.L.2011.Genomestructureofcottonrevealedbyagenome-wideSSRgeneticmapconstructedfromaBClpopulationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense.BMCGenomics,12:15.doi:10.1186/1471-2164-12-15.PMID:21214949)所用的多態(tài)性標(biāo)記的基礎(chǔ)上，結(jié)合新篩選的步驟(I)中的55對多態(tài)性標(biāo)記，利用JoinMap3.O(Stam,P.1993.Constructionofintegratedgeneticlinkagemapsbymeansofanewcomputerpackage:JoinMap.PlantJ.3(5):739-744.doi:10.1111/j.1365-313X.1993.00739.x)為作圖軟件(LOD值設(shè)為5.0)，并用Kosambi函數(shù)(Kosambi,D.D.1944.Theestimationofmapdistancefromrecombinationvalues.Ann.Eugen.12(1):172-175.doi:10.1111/j.1469-1809.1943.tb02321.x)將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳圖距(cM),最后用MapChartV2.2software(Voorrips,R.Ε.2002.MapChan:softwareforthegraphicalpresentationoflinkagemapsandQTLs.J.Hered.93(I):77-78.doi:10.1093/jhered/93.I.77.PMID:12011185)軟件繪制出遺傳連鎖圖譜，最終實(shí)現(xiàn)pre-miRNA的染色體定位。結(jié)果通過對2944對miRNA引物與SRAP引物組合進(jìn)行了篩選，得到55對親本間呈多態(tài)性的SSR引物，引物多態(tài)性率為I.87%;共得到59個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，位點(diǎn)多態(tài)性率為2.00%。其中，57個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)入24條染色體，第I染色體和第22條染色體上未定位到引物組合標(biāo)記，作圖效率為96.61%。對具有多態(tài)性標(biāo)記的親本組合隨機(jī)選擇8對引物組合(miR165-Me21、miR168-Me22、miR164_Me40、miR168_Mel7、miR408_Em7、miR164_Em33、miR169a_Me27和miR159-Me24)挖膠進(jìn)行TA克隆測序驗(yàn)證經(jīng)TA克隆測序結(jié)果檢測，其中有七對引物組合(七對引物組合為miR165-Me21、miR168-Me22、miR164-Me40、miR168-Mel7、miR408-Em7、miR164-Em33、miR169a-Me27)所得產(chǎn)物含有miRNA的保守序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)MicroRNA是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長約2025nt，它參與了基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，主要通過與靶基因mRNA的特定位點(diǎn)結(jié)合，抑制蛋白的合成或誘導(dǎo)mRNA的降解而起作用，調(diào)控棉花纖維的發(fā)育與伸長，目前miRNA的具體作用機(jī)制還不清楚，因此對已預(yù)測或經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的pre-miRNA進(jìn)行定位,對今后的研究具有一定的指導(dǎo)意義。miRNA作為一種調(diào)節(jié)分子廣泛的參與到動(dòng)植物的發(fā)育中，研究發(fā)現(xiàn)，植物miRNA作用的目的mRNA大都編碼轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與分生組織的特性、細(xì)胞的分裂、器官的分離、器官的極性相關(guān)，而且某些轉(zhuǎn)錄因子可能與棉花纖維的發(fā)育與伸長有關(guān)，因此miRNA的研究對于提高棉花產(chǎn)量和改善纖維品質(zhì)具有重要的意義。在2002年，miRNA被Science雜志評為十大科技突破第一名，目前miRNA成為研究的熱點(diǎn)之一，但到目前為止對miRNA進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)的文章卻很少，僅2011年P(guān)ang發(fā)表的ComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons一篇。本發(fā)明首次用miRNA保守序列設(shè)計(jì)的簡并引物與SRAP引物進(jìn)行組合制備miRNA分子標(biāo)記，一方面能夠高效快捷的發(fā)掘miRNA分子標(biāo)記，另一方面由于SRAP引物設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，所得的miRNA標(biāo)記可能為功能基因,對今后miRNA的研究具有一定的參考價(jià)值。圖I為一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法流程圖。圖2為miR171與Em5引物組合對BC1群體的電泳圖。圖3為TA克隆測序結(jié)果。SRAP引物用粗體表示，miRNA引物用粗體加斜體表示。圖4為一種miRNA分子標(biāo)記在連鎖圖譜上的分布示意圖。引物組合標(biāo)記使用粗體表示。同時(shí)，圖譜兩端的標(biāo)記以及與引物組合標(biāo)記相鄰的SSR標(biāo)記也被保留下來。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I:I、構(gòu)建海陸種間BC1群體用于遺傳作圖所用的海陸種間BC1群體參見文獻(xiàn)(ZhangYanxinCharacteristicsandanalysisofsimplesequencerepeatsinthecottongenomebasedonlinkagemapconstructedfromaBC1populationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense,Genome,2008(51):534-546)。具體構(gòu)建方法如下以陸地棉品種鄂棉22(ZhangYanxin等，CharacteristicsandanalysisofsimplesequencerepeatsinthecottongenomebasedonlinkagemapconstructedfromaBC1populationbetweenGossypiumhirsutumandG.barbadense,Genome，2008(51):534-546)為母本，海島棉品系3_79(李武等，海島棉遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析，作物學(xué)報(bào)ACTAAGR0N0MICASINICA2008,34(5):893-898)為父本，雜交得F1，后用鄂棉22給F1授粉得含141個(gè)單株的海陸種間BC1群體，以該BC1群體為作圖群體構(gòu)建棉花海陸種間遺傳連鎖圖。其中，陸地棉品種“鄂棉22”是湖北黃岡農(nóng)科所從雜交組合鄂荊I號(hào)XFD2165后代中選育的高產(chǎn)品種，但纖維品質(zhì)較差，且不抗枯、黃萎病；海島棉品系“3-79”是海島棉的遺傳標(biāo)準(zhǔn)系，纖維品質(zhì)優(yōu)良，黃萎病抗性強(qiáng)，但產(chǎn)量水平低。2、采集上述步驟中BC1群體的各單株的葉片和鄂棉22、海島棉品系3_79以及F1的葉片，提取gDNA(方法參照PatersonAH,BrubakerC，WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep,1993,11:122—127)。3,miRNA引物與SRAP引物組合在6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下的親本多態(tài)性篩選。對2944對miRNA引物(MingxiongPang,ChaozhuXinga,NickAdams等，ComparativeexpressionofmiRNAgenesandmiRNA-basedAFLPmarkeranalysisincultivatedtetraploidcottons.JournalofPlantPhysiology,168(2011)824-830)與SRAP引物(劉大軍.陸地棉SRAP圖譜構(gòu)建與種子物理、營養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL定位.博士學(xué)位論文.西南大學(xué)圖書館，2010)組合進(jìn)行了三次篩選，得到55對親本間呈多態(tài)性的SSR引物，引物多態(tài)性率為1.87%。55對多態(tài)性引物組合及單個(gè)引物名稱如下表I所示表ICN102816848>i^s5/7刦miRi60-Mel53iR159miR159-Mci9MiR160miR169a-Mc27miR162miR169a—Em5miRIMIl68-Me22miRl65/166miR168-Em34miRl67miR167-Me7miR168miR167_Me491169aI168—Mel7miRl69bmiR164-Me40miR171miR164-Em20miRl72miR160-Em46miR393miR162-Mel2miR394miR172-Me6miR397Im-Melo1403I171-Me40miRimiR17rEm5EmISiR169b~Em29ES5miR171_Me6￡371171—Mel7EmlOll￡_Mel2EmI2miR165IMC2一jE32()miRJ65丨Em33Em27miR169b,MC45EitP)1172-Me49Em30〔004s7miR172-Em20Em31niiR403-Me20Em33miR403-Me35Em34miR403-Em27Em39raiR169a-Eml2Em46miR397-Me49Em62niiR396-Me43MelmiR159-Me24Me4miR159-Me29Me6miR162-Em39Me7miR394-Em30MelOniiR393-Me4Mel2miR393-EmlMel7miR408-Em7Me19raiR408-Era31Me20miR393-Me42Me21niiR408-Mel9Me22miR169a-Eml0Me24miR168-MelMe27miR171-Era29Me29miR395-Me4Me31niiR394-Me3iMe35miR165-Me54Me40miR396-Me7Me42miR169b-Em11)Mc43miR408-Me49Me45niiR164-Me29Me49miR164-Em33Me54(I)PCR反應(yīng)體系(IOul)如下DNA模板30ng，IxBuffer,2.OmmolL_lMgC12，0.2mmolL-IdNTPsj0.IμmoIL-ImiRNAprimer,0.IμmoIL-ISRAPprimer,0.5UTaqDNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊。(2)PCR擴(kuò)增程序如下開始94°C變性5min,反應(yīng)前4個(gè)循環(huán)在94°Clmin,35°Clmin,72°CImin條件下運(yùn)行；之后34個(gè)循環(huán)在94°Clmin，54°Clmin，72°Clmin條件下運(yùn)行，最后72°C延伸lOmin。(3)6%變性聚丙烯酰胺凝膠的配方如下尿素420.Og,丙烯酰胺57.Og,甲叉雙丙烯酰胺3.Og,丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為19:1，IOxTBElOOml,然后用蒸餾水定容至IL0(4)利用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-12型電泳儀和DYCZ-20型電泳槽，常溫條件下80W恒功率電泳2h，銀染的方法參照Lin等(2005)的方法。4、miRNA弓I物與SRAP弓I物組合對BC1群體進(jìn)行多態(tài)性分析以兩親本鄂棉22和海島棉品系3-79'Fp141個(gè)BC1單株共144個(gè)個(gè)體的DNA為模板，用經(jīng)電泳條件篩選出的多態(tài)性引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(方法同3)。記錄下各引物擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上的多態(tài)性信息。具體如下對于共顯性標(biāo)記，用“A”表示母本鄂棉22的純合帶型，用“B”表示父本海島棉品系3-79的純合帶型，用“H”表示兩親本的雜合帶型；；數(shù)據(jù)缺失用表示。在原有多態(tài)性標(biāo)記的基礎(chǔ)上，結(jié)合新增加的多態(tài)性標(biāo)記，利用JoinMap3.O(Stam,P.1993.Constructionofintegratedgeneticlinkagemapsbymeansofanewcomputerpackage:JoinMap.PlantJ.3(5):739-744.doi:10.1111/j.1365-313X.1993.00739.x)為作圖軟件(L0D值設(shè)為5.0)，并用Kosambi函數(shù)(Kosambi,D.D.1944.Theestimationofmapdistancefromrecombinationvalues.Ann.Eugen.12(1):172-175.doi:10.1111/j.1469-1809.1943.tb02321.x)將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳圖距(cM),最后用MapChartV2.2software(Voorrips,R.E.2002.MapChart:softwareforthegraphicalpresentationoflinkagemapsandQTLs.J.Hered.93(1):77-78.doi:10.1093/jhered/93.I.77.PMID:12011185)軟件繪制出遺傳連鎖圖譜，最終實(shí)現(xiàn)pre-miRNA的染色體定位。本實(shí)驗(yàn)對2944對miRNA引物與SRAP引物組合進(jìn)行了篩選，得到55對親本間呈多態(tài)性的SSR引物，引物多態(tài)性率為I.87%;共得到59個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，位點(diǎn)多態(tài)性率為2.00%。其中，57個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)入24條染色體，第I染色體和第22條染色體上未定位到引物組合標(biāo)記，作圖效率為96.61%。各標(biāo)記在連鎖圖上的分布見圖4。5、TA克隆驗(yàn)證隨機(jī)選擇八對引物(miR165-Me21、miR168_Me22、miR164_Me40、miR168_Mel7、miR408-Em7、miR164_Em33、miR169a_Me27和miR159_Me24),對其進(jìn)行TA克隆，最終對陽性檢測呈陽性的進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示八對引物組合中有七對組合(七對引物組合為miR165-Me2UmiR168_Me22、miR164_Me40、miR168_Mel7、miR408_Em7、miR164_Em33、miR169a-Me27)所得產(chǎn)物含有miRNA的保守序列(圖3)。權(quán)利要求1.一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法,其步驟是(1)用已知的128個(gè)SRAP引物與23個(gè)保守的pre_miRNA引物，利用兩兩組合的方式共計(jì)2944對引物，通過常規(guī)電泳方法對鄂棉22和海島棉品系3-79兩個(gè)親本進(jìn)行三次多態(tài)性篩選，挑選出穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記組合，得到55對親本間呈多態(tài)性的SSR引物，引物多態(tài)性率為I.87%；(2)以陸地棉品種鄂棉22為母本，海島棉品系3-79為父本，雜交得F1，后用鄂棉22給Fl授粉得含141個(gè)單株的海陸種間BCl群體；(3)采集步驟(2)中BCl群體的各單株的葉片和鄂棉22、海島棉品系3-79以及Fl的葉片，提取gDNA；(4)以兩親本鄂棉22和海島棉品系3-79、Fl、141個(gè)BCl單株共144個(gè)個(gè)體的DNA為模板，用步驟(I)中篩選出的55對多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%V/V變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；(5)記錄下各引物擴(kuò)增產(chǎn)物在6%V/V變性聚丙烯酰胺凝膠上的多態(tài)性信息，具體如下對于共顯性標(biāo)記，用A表示母本鄂棉22的純合帶型，用B表示父本海島棉品系3-79的純合帶型，用H表示兩親本的雜合帶型；數(shù)據(jù)缺失用-表示；(6)在構(gòu)建高密度海陸種間圖譜所用的多態(tài)性標(biāo)記的基礎(chǔ)上，結(jié)合步驟(I)篩選出的中的55對多態(tài)性標(biāo)記，利用JoinMap3.O為作圖軟件，LOD值設(shè)為5.O,并用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳圖距，最后用MapChartV2.2software軟件繪制出遺傳連鎖圖譜，獲得pre-miRNA的染色體定位。全文摘要本發(fā)明公開了一種miRNA分子標(biāo)記的制備方法，其步驟是1)用已知的128個(gè)SRAP引物與23個(gè)保守的pre-miRNA引物，利用兩兩組合的方式對鄂棉22和海島棉品系3-79兩個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性篩選；2)兩個(gè)親本雜交獲得F1代，然后用鄂棉22做父本回交獲得BC1群體；3)提取兩個(gè)親本，F(xiàn)1代和BC1群體的gDNA；4)用步驟1)中篩選出的多態(tài)性引物對3)中的gDNA進(jìn)行多態(tài)性篩選；5)記錄擴(kuò)增產(chǎn)物信息；6)利用作圖軟件獲得pre-miRNA的染色體定位。方法易行，操作簡便，費(fèi)用低廉，能高效快捷的發(fā)掘miRNA分子標(biāo)記，而且由于SRAP引物設(shè)計(jì)的特點(diǎn)，所得的miRNA標(biāo)記可能為功能基因，對今后miRNA的研究具有一定的參考價(jià)值。文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816848SQ201210302878公開日2012年12月12日申請日期2012年8月24日優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日發(fā)明者林忠旭,張獻(xiàn)龍,陳學(xué)梅申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)