專利名稱：一組環狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組環狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
環狀糊精的英文為cyclodextrin，簡稱⑶。環糊精是環糊精轉葡萄糖基酶(CGTase)作用于淀粉的產物，是六個以上葡萄糖以α — 1，4一糖苷鍵連結的環狀寡聚糖，其中最常見、研究最多的是<1-環糊精((1-^)、0-環糊精(0_00)、Y _環糊精(Y -⑶)，分別由六個、七個和八個葡萄糖分子構成，是相對大和相對柔性的分·子。α -環狀糊精為淀粉深加工的一類高值化產品，由六個葡萄糖基通過α _1，4葡萄糖苷鍵連接而成的環狀低聚糖。在結構上，α-⑶的立體結構呈圓筒形(一端大，一端小)，具有“外親水，內疏水”的特殊性及無毒的優良性能，可與多種客體化合物采用適當方法進行包結，從而改變被包結物質的溶解度、揮發性及化學反應性能等理化性質，提供一些非常有用的功能。α -⑶是一種有潛力的食品添加劑，特別是可以作為目前已經生產的β -環狀糊精(β_⑶)的替代產品。β_⑶已有大規模生產，但在使用過程中發現它有臟器沉積的風險，以及包接效率低下的問題。概括起來，α -CD在食品工業有如下應用前景(I)將水不溶性或溶解度低的化合物制成水溶解度高的包封化合物；(2)使包封的化合物具有良好的穩定性(如保色、保香，耐熱、耐酸、耐水解、抗氧化、防揮發等)；(3)屏蔽作用(掩蓋食品中不愉快氣味和苦味)；(4)除去食品中不需要的成分(如咖啡因、膽固醇等)；(5)具有乳化、發泡作用，可作乳化劑和發泡劑；(6)使液體狀、油狀、揮發性物料固化。目前，α-⑶開發和應用的最大障礙是缺乏具有高α _環糊精轉化活力的酶制劑，使得該產品的成本和價格高出β -CD的三倍，限制了其大規模應用。α -⑶的生成,主要是以淀粉為原料,經過環狀糊精葡糖基轉移酶(cyclodextringlucano-transferase簡稱CGTases)的糖基轉化作用而來。CGTases的專一性較低，在大多數情況下同時產生Y-⑶三種產物。采用不同的CGTases產生的三種產物比例不同，現有的CGTases的主要轉化產物是β _⑶，同時也產生一定量的α-和Υ-⑶。現有的研究方向主要是兩個方面其一是從自然資源中尋求催化效果更好或專一性更高的酶；其二是對現有的酶蛋白進行定向改造從而獲得催化效果更好或專一性更高的酶。

發明內容
本發明的目的是提供一組環狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用。本發明提供的環狀糊精葡糖基轉移酶，來自軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans),是將序列表的序列I所示蛋白質進行如下(a)和(b)兩個突變得到的蛋白質(a)將序列表的序列I自N末端第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸；(b)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基進行突變。
所述(b)中所述突變為如下(I)至(17)中的任意一種(I)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為三個連續的組氨酸；(2)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為兩個連續的組氨酸；(3)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為組氨酸；(4)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基(酪氨酸)缺失；(5)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為脯氨酸；(6)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為甘氨酸； (7)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為蘇氨酸；(8)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為谷氨酸；(9)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為天冬酰胺；(10)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為絲氨酸；(11)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為苯丙氨酸；(12)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為纈氨酸；(13)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為半胱氨酸；(14)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為精氨酸；(15)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為亮氨酸；(16)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為賴氨酸；(17)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為色氨酸。上述突變如無特殊說明，均為單個氨基酸殘基。編碼所述蛋白質的基因也屬于本發明的保護范圍。所述基因具體可為將序列表的序列2所示蛋白質進行如下(C)和(d)兩個突變得到的DNA分子(c)將序列表的序列2自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ；(d)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸進行突變。所述(d)中的所述突變為如下如下(I)至(17)中的任意一種(I)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CACCACCAC ；(2)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CACCAC ；(3)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CAC ；(4)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸(TAC)缺失；(5)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CCA ；(6)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為GGT ；(7)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為ACA ；(8)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為GAG ；(9)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為AAT ；(10)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TCA ；(11)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TTT ；(12)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為GTA ；
(13)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TGC ；(14)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CGA ；(15)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CTA ；(16)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為AAG ；(17)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TGG。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體具體可為將所述基因插入載體pET_22b (+)的多克隆位點得到的重組質粒。所述重組表達載體具體可為將所述基因插入載體pET-22b (+)的BamHI和XhoI酶切位點之間得到的重組質粒。 所述重組菌具體可為將所述重組表達載體導入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發明還保護一種制備所述蛋白質的方法，是培養所述重組菌，得到所述蛋白質。所述培養的過程具體如下將所述重組菌接種至TB培養基，37°C、220rpm振蕩培養至( 600Μ=0. 6 (O. 6-0. 8均可)；加IPTG，使其在培養體系中的濃度為O.OlmM，然后16。。、220rpm振蕩培養96h ;將培養體系4°C、8000rpm離心10分鐘，收集上清液。本發明還保護所述蛋白質的應用，為如下(I )或(II)或(III)( I )制備環狀糊精葡糖基轉移酶；( II )降解淀粉(如可溶性淀粉)；(III)生產α-環狀糊精。本發明提供的蛋白質，生產α -⑶的專一性更高，生產效率更高，對生產具有重大價值。


圖I為重組質粒甲的結構示意圖。圖2為α -CD標準曲線。圖3為β -CD標準曲線。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。可溶性淀粉北京現代東方精細化學品有限公司，批號20070216。載體pET-22b(+)Novagen，產品目錄號為69744-3。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為CD601-01。TB培養基(g/L):胰蛋白胨12、酵母提取膏24、甘油4mL，蒸餾水定容。實施例I、突變蛋白及其編碼基因的發現從自然界篩選到一株軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans)，可以生產環糊精糖基轉移酶，該菌株中的環糊精糖基轉移酶基因如序列表的序列2所不，編碼序列表的序列I所不的蛋白質。將序列I所不蛋白質命名為ct _CGTase_l蛋白，將其編碼基因命名為a-CGTase-1基因(如序列2所不)。將序列3所不蛋白質命名為a-CGTase-WT蛋白(NCBI中公開的序列)，將其編碼基因命名為α _CGTase-WT基因(如序列4所不)。序列I與序列3的差異僅在于第590位氨基酸殘基(Μ/V)和第677位氨基酸殘基(S/G)。序列2與序列4的差異僅在于第1768位核苷酸(A/G)和第2029位核苷酸(A/G)。以序列表的序列I所示雙鏈DNA為模板，進行易錯PCR，得到突變體庫。通過對突變體庫中各個基因表達的蛋白進行酶活鑒定，發現了一系列酶的產物專一性區別于序列3所示a-CGTase-WT蛋白的突變蛋白及其編碼基因。實施例2、酶活鑒定
一、分別人工合成如下雙鏈DNA分子(I)雙鏈DNA分子I :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 TGG，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為色氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子I編碼的蛋白命名為蛋白I。(2)雙鏈DNA分子2 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 TGC，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為半胱氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子2編碼的蛋白命名為蛋白2。(3)雙鏈DNA分子3 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 CTA，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為亮氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子3編碼的蛋白命名為蛋白3。(4)雙鏈DNA分子4 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 GTA，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為纈氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子4編碼的蛋白命名為蛋白4。(5)雙鏈DNA分子5 :與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 GGT，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為甘氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子5編碼的蛋白命名為蛋白5。(6)雙鏈DNA分子6 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 CGA，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為精氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子6編碼的蛋白命名為蛋白6。(7)雙鏈DNA分子7 :與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 GAG，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為谷氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子7編碼的蛋白命名為蛋白7。
(8)雙鏈DNA分子8 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 AAT，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為天冬酰胺，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子8編碼的蛋白命名為蛋白8。(9)雙鏈DNA分子9 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 CAC，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為組氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子9編碼的蛋白命名為蛋白9。(10)雙鏈DNA分子10 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 CCA，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為脯氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子10編碼的蛋白命名為蛋白10。 (11)雙鏈DNA分子11 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 ACA，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為蘇氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子11編碼的蛋白命名為蛋白11。(12)雙鏈DNA分子12 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 TCA，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為絲氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子12編碼的蛋白命名為蛋白12。(13)雙鏈DNA分子13 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 TTT，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為苯丙氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子13編碼的蛋白命名為蛋白13。(14)雙鏈DNA分子14 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 AAG，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為賴氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子14編碼的蛋白命名為蛋白14。(15)雙鏈DNA分子15 :與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸(TAC)缺失，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ；相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基(酪氨酸)缺失，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子15編碼的蛋白命名為蛋白15。(16)雙鏈DNA分子16 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 CACCAC，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為兩個連續的組氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子16編碼的蛋白命名為蛋白16。(17)雙鏈DNA分子17 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為了 CACCACCAC，并將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為三個連續的組氨酸，并將第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子17編碼的蛋白命名為蛋白17。(18)雙鏈DNA分子18 :與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG ;相應的將序列I中的第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸。雙鏈DNA分子18編碼的蛋白命名為蛋白18。(19)雙鏈DNA分子19 即序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。(20)雙鏈DNA分子20 :即序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。二、重組質粒的構建(結構示意圖見圖I)I、設計一對引物，由S2和A3組成。
權利要求
1.將序列表的序列I所示蛋白質進行如下(a)和(b)兩個突變得到的蛋白質Ca)將序列表的序列I自N末端第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸；(b)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基進行突變。
2.如權利要求I所述的蛋白質，其特征在于所述(b)中的所述突變為如下(I)至(17)中的任意ー種(1)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為三個連續的組氨酸；(2)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為兩個連續的組氨酸；(3)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為組氨酸；(4)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基缺失；(5)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為脯氨酸；(6)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為甘氨酸；(7)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為蘇氨酸；(8)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為谷氨酸；(9)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為天冬酰胺；(10)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為絲氨酸；(11)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為苯丙氨酸；(12)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為纈氨酸；(13)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為半胱氨酸；(14)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為精氨酸；(15)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為亮氨酸；(16)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為賴氨酸；(17)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變為色氨酸。
3.編碼權利要求I或2所述蛋白質的基因。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于所述基因為將序列表的序列2所示蛋白質進行如下(c)和(d)兩個突變得到的DNA分子(c)將序列表的序列2自5’末端第1606-1608位核苷酸由GCG突變為GTG；Cd)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸進行突變。
5.如權利要求4所述的基因，其特征在于所述(d)中的所述突變為如下如下(I)至(17)中的任意ー種(1)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CACCACCAC；(2)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CACCAC；(3)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CAC；(4)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸缺失；(5)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CCA；(6)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為GGT；(7)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為ACA；(8)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為GAG；(9)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為AAT； (10)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TCA； (11)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TTT； (12)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為GTA； (13)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TGC； (14)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CGA； (15)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為CTA； (16)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為AAG； (17)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變為TGG。
6.含有權利要求3或4或5所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.如權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將所述基因插入載體pET-22b (+)的多克隆位點得到的重組質粒。
8.如權利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權利要求7所述重組表達載體導入大腸桿菌得到的重組菌。
9.一種制備權利要求I或2所述蛋白質的方法，是培養權利要求6或8所述重組菌，得到權利要求I或2所述蛋白質。
10.權利要求I或2所述蛋白質的應用，為如下(I)或(II)或(III) (I )制備環狀糊精葡糖基轉移酶； (II)降解淀粉； (III)生產α-環狀糊精。
全文摘要
本發明公開了一組環狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用。本發明提供的環狀糊精葡糖基轉移酶，來自軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans)，是將序列表的序列1所示蛋白質進行如下(a)和(b)兩個突變得到的蛋白質(a)將序列表的序列1自N末端第536位氨基酸殘基由丙氨酸突變為纈氨酸；(b)將序列表的序列1自N末端第167位氨基酸殘基進行突變。本發明提供的蛋白質，生產α-CD的專一性更高，生產效率更高，對生產具有重大價值。
文檔編號C12N1/21GK102827815SQ20121030316
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者鈔亞鵬, 錢世鈞, 宋炳紅 申請人:中國科學院微生物研究所