專利名稱：一組合成抗菌蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー組合成抗菌蛋白、其制備方法及在制備治療細菌、真菌感染的藥物中的應用，該抗菌蛋白對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有顯著而特異的殺菌活性。
背景技術：
抗菌蛋白的功能亞基即抗菌肽，是生物體經誘導產生的ー種具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60個氨基酸組成，分子量在2000-7000D左右。隨著醫學免疫學和分子生物學的迅速發展，抗菌肽的研究越來越成為生物技術與生物醫藥領域中的熱門課題。至今為止，在許多動物(尤其是昆蟲)、植物、微生物和人體上已發現了超過200多種抗菌肽，這類短肽不僅對細菌、真菌有廣譜的殺菌作用，而且對病毒、原蟲及癌細胞也有攻擊作用。臨床試驗也表明，在機體感染病菌或可能導致病菌感染的情況下，抗菌肽能快速殺滅已侵入的病菌，并且能阻止病菌的繼續侵染。但是抗菌肽在快速殺滅致病菌的同吋，也會對人體有 益菌群造成傷害。抗體是ー種高度特異的分泌型免疫蛋白，通過其可變區域內⑶R可迅速而準確地與抗原結合，引發后續免疫反應。研究表明，即使抗體整體結構不完整，在保持其CDR序列完好且構象正常的情況下，仍能夠有效識別抗原。蛋白質重組融合技術可將兩個蛋白質或肽鏈通過小的氨基酸片段進行連接，同時保證兩端的結構和功能不發生明顯改變，此技術不僅可以通過化學合成實現，亦可通過基因工程將待連接蛋白和連接片段DNA序列進行共轉化并在細胞中表達而實現。

發明內容
本發明的目的在于提供ー組合成抗菌蛋白及其制備方法和應用，通過蛋白質融合技術以及基因操作合成，制備的抗菌蛋白可通過質譜或SDS-PAGE鑒定。利用96孔板法檢測合成蛋白的殺菌活性(In Yup Park etc FEBS Letters :437 (1998) 258-262)，以預先合成的天然抗菌蛋白buforin II>cecropin Al為對照,進行殺菌活性檢測。結果表明本發明合成抗菌蛋白的殺菌活性強于所述兩種天然抗菌蛋白的殺菌活性。利用連續培養法檢測合成蛋白的殺菌速率，以預先合成的天然抗菌蛋白buforin II、cecropin Al為對照，結果表明本發明合成抗菌蛋白生效時間比所述兩種天然抗菌蛋白更迅速。同時，使用上述兩種實驗方法還證明具有多個識別亞基或功能亞基的復合抗菌蛋白在識別特異性和殺菌反應速度上均優于天然抗菌蛋白。本發明是這樣構成的ー組合成抗菌蛋白，所述抗菌蛋白由ー個功能亞基通過連接肽與識別亞基相接合；所述識別亞基具有類似抗體的結構，由輕鏈、即L鏈和重鏈、即H鏈通過ニ硫鍵接合構成。前述的合成抗菌蛋白中，所述功能亞基羧基端與連接肽氨基端連接，連接肽羧基端與識別亞基氨基端連接。前述合成抗菌蛋白的結構包含下述氨基酸序列
功能亞基見序列表中序列I ;連接肽見序列表中序列2 ；H鏈序列3A序列4B序列5C序列6 ；L鏈序列7X序列8Y序列9Z序列10 ；所述A為序列11吋，B、C、X、Y、Z分別為序列12、序列13、序列14、序列15、序列16 ；A為序列17時，B、C、X、Y、Z分別為序列18、序列19、序列20、序列21、序列22 ；A為序列23吋，B、C、X、Y、Z分別為序列24、序列25、序列26、序列27、序列28。
前述的合成抗菌蛋白中，所述連接肽的序列優選為Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 或 Gly-Gly-Ala-Ser。前述的合成抗菌蛋白中，所述H鏈26 35、50 65、96 102位及L鏈24 34、49 56、89 97位為CDR序列，用于特異性識別目標細胞；H鏈22位半胱氨酸與L鏈23位半胱氨酸形成的ニ硫鍵將兩條肽鏈連接成為識別亞基。本發明所述的合成抗菌蛋白還包括在所述抗菌蛋白中増加1-2個識別亞基或功能亞基并通過連接肽連接于原有蛋白而得到的功能等同物蛋白。本發明提供的合成抗菌蛋白的制備方法為將編碼所述抗菌蛋白的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得所述抗菌蛋白。制得的抗菌蛋白可通過質譜或SDS-PAGE 鑒定。前述方法中，所述的載體是質粒或病毒中的ー種；所述的宿主細胞是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。本發明所提供的合成抗菌蛋白在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染的藥物中的應用。為證實本發明所合成抗菌蛋白具有高度特異性，申請人進行了抗G+蛋白/杭G-蛋白與G+/G-細菌交叉試驗。通過對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的滅殺試驗，證實目標細菌殺滅率為95%時非目標細菌殺滅率小于3%，表明合成抗菌蛋白具有極高專一性。本發明提供一組新的人工設計合成的抗菌蛋白，可方便地將編碼抗菌蛋白的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得。該合成抗菌蛋白對選定的革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌具有很高的殺傷活性，因此本發明合成抗菌蛋白可應用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物。本發明的優點1、融合抗菌蛋白兼具抗菌蛋白的高殺菌活性和抗體的專ー性，通過對識別亞基H鏈及L鏈上的CDR序列進行設計，可構造出針對某一種或某一類細菌/真菌進行殺滅的特異性蛋白，從而保護其他有益菌群免遭傷害。2、利用識別亞基類似于抗體的結構，可提高抗菌蛋白與目標細胞的結合速度，使其生效更快。3、通過連接肽可將多個功能亞基與識別亞基相連接，這些功能亞基既可以是相同類型也可以是不同類型。借此，可提升單位濃度下殺菌活性。 本發明利用96孔板法檢測合成蛋白的殺菌活性(In Yup Park etc FEBSLetters :437 (1998) 258-262),以預先合成的天然抗菌蛋白 buforin II、cecropin Al 為對照，進行殺菌活性檢測。結果表明本發明合成抗菌蛋白的殺菌活性強于所述兩種天然抗菌蛋白的殺菌活性。利用連續培養法檢測合成蛋白的殺菌速率，以預先合成的天然抗菌蛋白buforin II、cecropin Al為對照，結果表明本發明合成抗菌蛋白生效時間比所述兩種天然抗菌蛋白更迅速。同時，使用上述兩種實驗方法還證明具有多個識別亞基或功能亞基的復合抗菌蛋白在識別特異性和殺菌反應速度上均優于天然抗菌蛋白。


圖I是本發明純化Jacdurin-I抗菌蛋白SDS-PAGE鑒定電泳圖；圖2是最小抑菌濃度時本發明Jacdurin-I、Jacdurin-2、Jacdurin-3抗菌蛋白對各類微生物的抑制程度示意圖；圖3是本發明抗菌蛋白Jacdurin-2抑菌速率檢測示意圖；圖4是多亞基復合抗菌蛋白Jacdurin-Il抗菌活性示意圖；圖5是多亞基復合抗菌蛋白Jacdurin-24抗菌速率示意圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例來進ー步闡述本發明，并通過實驗來驗證本發明的可靠性和有效性。實施例I :抗革蘭氏陽性菌蛋白Jacdurin-I基因在大腸桿菌中的表達，純化及鑒定。首先設計合成編碼抗菌蛋白的Jacdurin-I基因,⑶R序列參見人抗磷壁酸抗體可變區序列，將其克隆到pGEX_6P_l載體上(購自Amersham Pharmcia Biotech公司),然后轉化大腸桿菌JM109,經IPTG誘導表達GST-Jacdurin-I融合蛋白，再經PreScission蛋白酶切割后，得抗菌蛋白Jacdurin-1。實施例中使用的ATP、IPTG、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶、Klenow酶、限制性內切酶除特別指明外均為Biolab公司產品，割膠回收試劑盒為上海生エ公司產品，寡聚核苷酸為上海生エ生物工程技術服務有限公司合成。PreScission酶剪切試劑盒購于SIGMA公司。有關DNA的分離、純化、PCR擴增、酶解、質粒轉化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》進行。大腸桿菌JM109培養在液體或固體的LB培養基中。采用大腸桿菌偏愛的密碼子設計編碼優選抗菌蛋白Jacdurin-I基因的DNA序列，序列如下。在抗菌蛋白Jacdurin-I基因的5’端引入酶切位點BamHI (GGATCC)，在3’端加上終止密碼子(TAG)，所得構建基因的長度為738bp。編碼Jacdurin-I的核苷酸序列見序列表中序列29。通過DNA合成儀直接合成該核苷酸片斷。首先用PCR方法對基因進行擴増。設計一對引物:5，-CCTAGGTTTACCT-3，和 3，-CCGCCTGCTGAA-5，。PCR 反應條件如下94°C,30秒；45°C，45秒；72°C，30秒；反應30個循環。PCR反應后將該片斷經過Klenow酶補平后用BamHI酶切，酶切片斷經過割膠回收后(割膠回收操作參照試劑盒操作說明)與pGEX_6P_l載體的BamHI和SmaI的雙酶切片斷連接后轉化大腸桿菌JM109，轉化子通過SmaI酶切鑒定、篩選。轉化子經過IPTG誘導表達GST-Jacdurin-I融合蛋白。融合蛋白用GST親合柱純化后經PreScission酶切割后得到抗菌蛋白Jacdurin-l,具體操作參照試劑盒操作說明。Jacdurin-I蛋白序列為序列表中序列30(即序列I序列2序列3序列11序列4序列12序列5序列13序列6序列7序列14序列8序列15序列9序列16序列10)
稱量一定量純化的Jacdurin-I蛋白，以PBS為緩沖液，于7%SDS/聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE，結果如圖1，M為分子量標準品，1、3道為Jacdurin-I蛋白，2、4道為經ニ硫蘇糖醇還原半胱氨酸殘基、PredK蛋白酶切割連接肽后獲得的功能亞基與識別亞基輕、重鏈。圖中Jacdurin-I蛋白分子量約30. 5kD，與理論值30. 8kD相近，其亞基片段分子量也符合預期，說明經上述步驟純化所得蛋白確為Jacdurin-I抗革蘭氏陽性菌蛋白。使用同樣方法可獲得識別目標為類脂A的抗革蘭氏陰性菌蛋白Jacdurin-2及識別目標為真菌糖蛋白(本例中為白色念珠菌的表面甘露醇蛋白復合體)的抗真菌蛋白Jacdurin-3 ο其CDR序列見序列表中序列17-序列28。以下實施例中所使用的各種菌株購于中國藥品生物制品檢定所。實施例2 :合成抗菌蛋白的殺菌活性檢測采用96孔板法對合成抗菌蛋白的殺菌活性進行檢測，并用固相化學法合成的 抗菌肽cecropinAl和buforin II作為對照，以評價本發明中作為示例的三種抗菌蛋白 Jacdurin-l、Jacdurin-2 和 Jacdurin-3 的殺菌活性。按以下步驟測定抗菌蛋白的殺菌活性菌種復蘇，接種斜面37°C培養過夜，挑菌于普通LB培養基中，37°C培養過夜，稀釋菌液使菌濃度為104-105CFU/mL，按每孔IOOul菌液接種于96孔板中，將蛋白以一定比例稀釋后，每孔中加入10ul，將96孔板置于37°C培養過夜，酶標儀檢測OD62tl值(In Yup Parketc FEBS Letters :437(1998)258-262)。檢測結果見表 I。含有抗菌蛋白的細菌的生長濃度(OD62tl)與不加抗菌蛋白的細菌的生長濃度的比值大于90%時的抗菌蛋白濃度即為最小抑菌濃度(最小抑菌濃度(MIC)定義為顯著抑制細菌生長的最低的濃度)。表I Jacdurin抗菌蛋白與兩種抗菌肽對微生物的最小抑菌濃度(MIC)
微生物菌株—一:
金黃色葡萄球菌CMCC260031640,646128
枯草桿菌 DB4301261.28856
氏短小芽孢桿菌CMCC632025060.46282
溶壁微球菌 S1.6345082.87484
藤妁微:本 Q CMCC280013081.08092
巾入賜坆令い;::i丨 ATCC809920161422.456
.. 肺炎心:'山’CMCC461171620980.868
I,'.-------
陰乙型副傷寒沙門氏菌CMCC500941214561.2102
性銅綠假甲-胞菌 CMCC1010418201083.2156
.真Cl色念珠菌 ATCC10231503068742.2
ii啤酒酵母 ATCC9736502092561.6表I中的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強。實施例3 融合抗菌蛋白Jacdurin-2抑菌速率檢測
采用連續培養法對合成抗菌蛋白的殺菌速率進行檢測，以固相化學法合成的抗菌肽cecropinAl和buforin II作為對照，大腸埃希氏菌ATCC8099與Jacdurin-2為實驗組，按以下步驟測定抗菌蛋白的殺菌活性菌種復蘇，接種斜面37°C培養過夜，挑菌于普通LB培養基中，37°C培養過夜，稀釋菌液使菌濃度為103-104CFU/mL，置于IOOmL LB液體培養基37°C連續培養，加入IOmL以ー定比例稀釋的蛋白，蛋白濃度為5倍MIC，每隔Ih取樣，用酶標儀檢測OD62tl值(In Yup Parketc FEBS Letters :437(1998)258-262)。檢測結果見圖 3。以空白対照的Logistic擬合曲線作為理論生長曲線(100%)，測定對應微生物被殺滅25%、50%及75%所需時間，結果如表2。表2抗菌蛋白Jacdurin抑菌時間
權利要求
1.一組合成抗菌蛋白，其特征在于所述抗菌蛋白由一個功能亞基通過連接肽與識別亞基相接合；所述識別亞基具有類似抗體的結構，由輕鏈、即L鏈和重鏈、即H鏈通過二硫鍵接合構成。
2.根據權利要求I所述的合成抗菌蛋白，其特征在于所述功能亞基羧基端與連接肽氨基端連接，連接肽羧基端與識別亞基氨基端連接。
3.根據權利要求I所述的合成抗菌蛋白，其特征在于其結構包含下述氨基酸序列 功能亞基見序列表中序列I ; 連接肽見序列表中序列2 ； H鏈序列3A序列4B序列5C序列6 ； L鏈序列7X序列8Y序列9Z序列10 ； 所述A為序列11時，B、C、X、Y、Z分別為序列12、序列13、序列14、序列15、序列16 ；A為序列17時，B、C、X、Y、Z分別為序列18、序列19、序列20、序列21、序列22 ；A為序列23時，B、C、X、Y、Z分別為序列24、序列25、序列26、序列27、序列28。
4.根據權利要求3所述的合成抗菌蛋白，其特征在于所述連接肽的序列為Gly-Gly-Ser > Gly-Gly-Gly-Ser> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 或 Gly-Gly-Ala-Ser。
5.根據權利要求1、2或3所述的合成抗菌蛋白，其特征在于所述H鏈26 35、50 65,96 102位及L鏈24 34、49 56、89 97位為⑶R序列，用于特異性識別目標細胞出鏈22位半胱氨酸與L鏈23位半胱氨酸形成的二硫鍵將兩條肽鏈連接成為識別亞基。
6.根據權利要求I所述的合成抗菌蛋白，其特征在于還包括在所述抗菌蛋白中增加1-2個識別亞基或功能亞基并通過連接肽連接于原有蛋白而得到的功能等同物蛋白。
7.權利要求1-6所述合成抗菌蛋白的制備方法，其特征在于將編碼所述抗菌蛋白的基因克隆到載體上，然后進入宿主細胞中表達后獲得所述抗菌蛋白。
8.根據權利要求7所述合成抗菌蛋白的制備方法，其特征在于所述的載體是質粒或病毒中的一種。
9.根據權利要求7或8所述合成抗菌蛋白的制備方法，其特征在于所述的宿主細胞是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。
10.權利要求1-6所述合成抗菌蛋白的應用，其特征在于所述抗菌蛋白在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一組合成抗菌蛋白及其制備方法和應用，所述抗菌蛋白由一個功能亞基通過連接肽與識別亞基相接合；所述識別亞基具有類似抗體的結構，由輕鏈、即L鏈和重鏈、即H鏈通過二硫鍵接合構成；該合成抗菌蛋白的制備方法是通過基因工程表達獲得。本發明所述合成抗菌蛋白具有比天然抗菌肽更高的抑菌活性和更快的生效速度，并可根據需要選擇性地抑制某類微生物；通過改變其可變結構部分及抗菌肽部分的組合，還可靈活地調控其抗菌活性及抗菌譜范圍。
文檔編號C12R1/125GK102816245SQ201210303670
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者郭鎧 申請人:郭鎧