專利名稱：一株阿魏酸酯酶生產菌株及應用該菌株生產阿魏酸酯酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株高產阿魏酸酯酶的微生物菌株，特別涉及一株綠木霉及利用該菌生產阿魏酸酯酶的方法。
背景技術：
阿魏酸酯酶也被稱為肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一個亞類，也是一種胞外酶，它可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來。阿魏酸在植物細胞壁結構中起著重要的作用，它可以在植物細胞壁的木質素與木質素之間，木質素與半纖維素之間，半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構成一個骨架結構，使得整個細胞壁變得堅硬。阿魏酸酯酶可以打開細胞壁木質素中阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等分子與半纖維素支鏈形成的致密網狀交聯結構，從空間上對細胞壁中纖維素和半纖維 素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推測認為是消除細胞壁降解限制因子的關鍵酶之一。在造紙工業中，經阿魏酸酯酶處理的原料，木質素更容易脫除，可減少制漿工序的化學藥品用量。而纖維細胞壁經阿魏酸酯酶處理后，表面變得疏松，成紙時可以提高紙品的機械強度。利用阿魏酸酯酶處理紙漿后產生的阿魏酸可作為優質的抗氧化劑，除此之外，阿魏酸還具有的抗腫瘤、消炎、促進傷口愈等保健作用，所以阿魏酸可作為功能因子開發功能性的食品。同時，阿魏酸可以作為合成天然香蘭素的前體，以阿魏酸為原料，利用微生物的方法生產的香蘭素與合成的香蘭素相比具有毒性低，安全性高的特點，可以用作食品和化妝品行業的香料。專利CN200810056477. 6公開了一種阿魏酸酯酶的提取方法，但操作較為復雜，關于阿魏酸酯酶的研究，有很多問題需要解決，主要是目前篩選出的分泌阿魏酸酯酶的微生物的分泌量仍然達不到工業化生產阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取方法有待改進，其工業化生產受到限制。

發明內容
本發明針對上述技術存在的不足,提供一種利用綠色木霉(Trichoderma viride)通過液體發酵生產阿魏酸酯酶的方法，收率較現有文獻報道提高了數倍，所采用的菌株代碼為JBSH-001，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo. 5612 ;該菌株可應用于生產阿魏酸酯酶，該方法發酵所得阿魏酸酯酶酶活可達200mU/ml以上，純化后的阿魏酸酯酶酶活可達50000mU/g以上。本發明提供的具體技術方案是首先獲得了一株新的菌株，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 5612，其具體獲得方法如下( I)出發囷株以本實驗室收減的各種囷株作為起始囷株，其中包括多種木腐囷、軟腐菌、枯萎菌和其他霉菌，分類培養建立菌種庫。
(2)篩選方法以阿魏酸甲酯作為唯一碳源制備平板培養基，接入上述菌株在適宜條件下培養，根據是否產生透明圈進行一級篩分。初步篩選具有產阿魏酸酯酶能力的菌株，然后對初篩菌株進行搖瓶培養，根據液體培養物中阿魏酸酯酶的活性大小篩選出其中的2株產酶活性最高的菌株作為馴化菌株。(3)對2株待馴化菌株的生理生化特性、產酶性能等進行比較深入研究，最終篩選出一株產酶能力強、易于培養并具有穩定的傳代特性的菌株，將其初步命名為JBSH01。(4)以該菌株為出發菌株，采用常規誘變方法，如UV，DMS，麗S，NTG等，結合低能離子注入法，反復多次誘變，復篩，最終獲得了高產菌株JBSH-001。發明人對該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心進行了生物保藏，保藏編號為CGMCC No. 5612，經檢測其為存活狀態。上述JBSH-001菌株，其形態特征如下菌絲纖細無色，具分隔，多分枝。分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，對生或互生，一般有2-3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形，孢壁具小疣突，綠色。在PDA培養基上菌落初為白絮狀，后為暗綠色。上述形態特征與綠色木霉Trichodermaviride的培養特性一致。發明人同時對其進行了 16S rDNA測序，其基因序列如Seq ID No:l所示，該序列為菌株JBSH-001的16S rDNA的全序列。用所測得的16S rDNA序列進行BLSTN比對，結果顯示，菌株JBSH-001的16S rDNA的核苷酸序列與木霉屬Trichoderma spp.不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性,與其中明確標記為綠色木霉Trichoderma viride的5株菌株有100%的同源性，因而進一步確定本發明所提供的菌株為一株綠色木霉菌株。本發明所獲得的菌株綠色木霉Trichoderma viride JBSH-001,可以應用于日常的生產當中，特別是可以應用于阿魏酸酯酶的生產，具體步驟主要包括綠色木霉菌液體發酵以及阿魏酸酯酶的提取分離和純化步驟，其特征在于在綠色木霉菌液體發酵中應用阿魏酸酯酶產生和積累誘導工序，所述的阿魏酸酯酶產生和積累誘導工序具體步驟如下A.誘導因子篩選從阿魏酸衍生物、生長因子、酶系的調控方面篩選誘導因子，誘導因子選自維生素類或阿魏酸衍生物或誘導離子或其他誘導因子或其混合物；B.誘導因子使用方法維生素類或阿魏酸衍生物或誘導離子添加入發酵培養基中，結合中期補加碳源和氮源，用于誘導和促進產生阿魏酸酯酶。首先要用常規培養使木霉菌體生長，進入產酶期后再陸續補加葡萄糖、蔗糖等碳源和蛋白胨、酵母浸粉、酵母提取物等氮源，通過不斷補料使菌體生長，從而增加阿魏酸酯酶的表達和分泌。其中所述誘導因子中的誘導離子選自硼離子或鎂離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種的混合物；維生素類選自維生素B或葉酸；阿魏酸衍生物為阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯；其它誘導因子為甲殼素或殼聚糖或米糠或麩皮中的一種或幾種的混合物。之所以選擇上述的物質作為誘導因子，發明人經過研究后發現針對本發明所述的菌株而言，要使其產生膠霉菌素，誘導調控的方法主要通過三種方式1、補充酶表達的底物，如阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、甲殼素、殼聚糖、麩皮，從而來誘導菌產生阿魏酸酯酶；2、補充生物生長必須的營養因子，如維生素B、葉酸等；3、補充菌體中各種酶系的輔酶離子，主要選擇自金屬離子或其他例子，一般可以采用其可溶性金屬鹽的形式，發明人發現通過上述的三種誘導因子，結合對于發酵過程的控制，可以實現阿魏酸酯酶的產量提高。更為具體的生產步驟如下( I)綠色木霉菌液體發酵A.菌種活化；B.液體種子制備；C.發酵菌種活化后，經液體發酵擴繁種子液，再利用液體深層發酵方法獲得阿魏酸酯酶發酵液； 其中發酵過程將液體種子以2-10% (v/w)的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h,補加O. 5-1% (v/w)的碳源以及O. 05-0. 2% (v/w)的氮源；(2)阿魏酸酯酶的制備A.固液分離將上述發酵的阿魏酸酯酶發酵液經固液分離后，清液用于制備阿魏酸酯酶；B.發酵清液采用微濾脫除膠質以及不溶性顆粒，經超濾膜濃縮后，添加保護劑，經噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品；而為了得到阿魏酸酯酶純品，發明人將上述步驟(2)獲得的清夜，直接經固液分離后，采用微濾脫除膠質以及不溶性顆粒，經超濾膜濃縮后，用鹽析的方法，得到阿魏酸酯酶粗酶，經復溶后，配制O. 5-2%的酶液，經層析純化，超濾脫鹽后，經冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品。其中所述步驟(2)中的固液分離為板框過濾或三足離心或碟式離心；所述的步驟
(3)中微濾膜的孔徑為O. 1-0. 5 μ m，超濾膜的孔徑為2000-10000Dalton ;所述的鹽析介質是氯化鈉或硫酸鈉或硫酸鎂或硫酸銨；所述的步驟(3)中層析采用的是離子交換層析，使用的層析介質為 DOWEX MXA-1 或 Q-Sepharose FF 或 DEAE-Sephacel 或 DEAE-Sepharose FF或717強堿性離子交換樹脂或D201大孔強堿性陰離子交換樹脂。更為具體的過程如下(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C _25°C)活化 4h-8h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌液體培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，培養溫度24°c，搖床轉速200r/min，振蕩培養24_48h制備種子液；(3)發酵、誘導過程在發酵培養基中添加占培養基總重量O. 01-0. 05%金屬離子(如鎂離子或鈷離子或鑰離子或硼離子中的一種或幾種混合物)；及占培養基總重量O. 005-0. 02%的生長因子(如維生素B或葉酸或其混合物)，將液體種子以2-10% (v/w)的接種量在無菌操作的條件下接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加O. 5-1% (v/w)的碳源(如葡萄糖或蔗糖一種或幾種混合物)以及O. 05-0. 2%的氮源(如蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉中的一種或幾種混合物)，總共培養96-144h，獲得阿魏酸酯酶發酵液，經固液分離后獲得發酵清液。 (4 )阿魏酸酯酶的提取發酵清液經4000-6000r/min離心分離后，清液采用O. 1-0. 22 μ m的微濾膜組件過濾澄清溶液，進而用2000-60000Dalton的超濾膜組件超濾濃縮，濃縮到濃度為5-10% (v/v)，添加5-10%的保護劑(w/v)，經噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗
品O(5)阿魏酸酯酶的純化發酵清液經4000-6000r/min離心分離后，清液采用O. 1-0. 22 μ m的微濾膜組件澄清溶液，進而用2000-60000Dalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到濃度為5-10% (v/v)，用重量分數50-70%硫酸銨鹽析，經2000-6000r/min離心后，沉淀用pH為6. 86的磷酸鹽緩沖鹽配制O. 5-1% (w/v，濕重)的酶液，采用QFF瓊脂糖凝膠層析純化，超濾脫鹽后，經冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品。其中，步驟(4)獲得的阿魏酸酯酶粗品成本較低，可以直接用于飼料、農產品加工中，而步驟(4)獲得的阿魏酸酯酶純品純度高，可用于食品、造紙等方面。其中菌株產阿魏酸酯酶的生產條件的確定，其方法如下(I)采用單因子試驗和正交試驗，通過改變溫度、初始pH值、接種量、裝料量和培養時間，確定液體種子最佳培養條件和液體發酵最佳培養條件；
(2)采用單因子試驗和正交試驗，通過改變培養的碳氮源和無機鹽組成確定該菌株液體種子最佳培養基組成和液體發酵的最佳培養基組成。經過上述單因子試驗和正交試驗所獲得菌株、液體種子培養基組成及發酵條件如下液體種子培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2% 4%，酵母浸粉O. 2% 1%，硫酸鎂 O. 02-0. 1%，磷酸二氫鉀 O. 01-0. 05%,加水至 IOOOmL ；液體種子培養條件接種量為每個三角瓶接種I只菌株斜面培養物，PH值自然，培養溫度24 28°C，搖床轉速75-200r/mi η,培養時間為24 48h ；經過上述單因子試驗和正交試驗所獲得菌株液體發酵培養基組成和發酵條件如下液體培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2% 4%，蛋白胨O. 2 1%，麩皮1-4% ；土豆汁1-4% ;硫酸鎂O. 02-0. 1%，磷酸二氫鉀O. 01-0. 05%,硫酸鋅O. 001-0. 005%,維生素B120. 005%，加水至 IOOOmL ；液體發酵條件接種量為5%_10% (v/w), pH值自然，培養溫度24 28°C，搖床轉速 75-200r/min，培養時間為 96_144h ；利用上述綠木霉發酵，將液體發酵后阿魏酸酯酶酶活可達200mU/ml以上，純化后的阿魏酸酯酶酶活可達50000mU/g以上。利用該菌株生產阿魏酸酯酶有以下優點I、利用該菌株發酵制備阿魏酸酯酶酶活可達200mU/ml以上，純化后的阿魏酸酯酶酶活可達50000mU/g以上；2、該菌株的代謝產物阿魏酸酯酶為胞外酶，減少細胞壁破碎過程，大大降低能耗，降低生產成本。綜上所述，本發明提供了一株阿魏酸酯酶高產菌株及利用該菌株進行液體發酵制備阿魏酸酯酶的方法，該菌株可應用于生產阿魏酸酯酶，該方法發酵所得阿魏酸酯酶酶活產率可達200mU/ml以上。保藏信息保藏時間2011年12月16日保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號CGMCCNo. 5612
保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所分類命名綠色木霉(Trichodermaviride)
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍，下述實施例中所采用的菌種均為保藏號為CGMCCNo. 5612的菌種。實施例I(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，PH值自然，培養溫度24°C，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%,磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發酵、調控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加40% (w/v)的葡萄糖無菌溶液25mLl% (w/v)的葡萄糖及20% (w/v)的蛋白胨無菌溶液5mL0. 1% (w/v)的蛋白胨，共培養96h。發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖4%，蛋白胨1%，麩皮4% ;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%，氯化鈷O. 001%,維生素B120. 005%，加水至IOOOmL ;滅菌條件為121 °C，O. 15Mpa 滅菌 20mi η ；發酵結束以后，發酵液酶活為248mU/mL，發酵液經4000r/min離心IOmin后，清液采用O. 22 μ m的陶瓷微濾膜組件過濾，濾液用IOOOODalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到重量濃度為5% (v/v),添加10% (w/v)的玉米淀粉,經噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品25. 3g。酶活 7200mU/g。實施例2(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，PH值自然，培養溫度24°C，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成(w/w)為按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸鎂O. 05%，磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發酵、調控過程 將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加40% (w/v)的蔗糖無菌溶液25mL及20% (w/v)的酵母浸粉無菌溶液5mLl% (w/v)的蔗糖糖及O. 1% (w/v)的酵母浸粉，共培養120h。發酵培養基組成，按重量計(w/w)為鹿糖4%，蛋白胨1%，阿魏酸乙酯1% ;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,氯化鈷O. 001%,維生素B60. 005%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa 滅菌 20min ；發酵結束以后，發酵液經4000r/min離心lOmin，清液采用O. 22 μ m的陶瓷微濾膜組件過濾，濾液用6000Dalton的超濾膜組件濃縮,濃縮到原體積的10% (v/v),用60% (w/V)硫酸銨鹽析,經4000r/min離心后,沉淀用pH為6. 86的磷酸鹽緩沖鹽配制成O. 5% (w/V，濕重)的酶液，采用DEAE-Sepharose FF介質進行柱層析純化，洗脫液超濾脫鹽后，經冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品470mg，酶活86450mU/g。實施例3(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，PH值自然，培養溫度24°C，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%,磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發酵、調控過程將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加40% (w/v)的蔗糖無菌溶液25mL及20% (w/v)的酵母浸粉無菌溶液5mL補加1% (w/v)的鹿糖及O. 1% (w/v)的酵母浸粉，共培養120h。發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖4%，酵母浸粉1%，阿魏酸甲酯2%;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,鑰酸銨O. 001%,維生素B10. 01%,加水至IOOOmL ；發酵結束以后，酶活為248mU/mL發酵液經4000r/min離心lOmin，清液采用O. I μ m的陶瓷微濾膜組件過濾，濾液用IOOOODalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到重量濃度為8% (v/v)，添加10% (w/v)的淀粉，經噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品55. 3g。測定其酶活為 3800mU/g。實施例4(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個三角瓶，PH值自然，培養溫度24°C，搖床轉速200r/min，培養時間為48h ；種子培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%,磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發酵、調控過程將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加40% (w/v)的蔗糖無菌溶液25mL及20% (w/v)的酵母浸粉無菌溶液5mL補加1% (w/v)的鹿糖及O. 1% (w/v)的酵母浸粉，共培養120h。發酵培養基組成，按重量計(w/w)為蔗糖4%，酵母浸粉1%，阿魏酸甲酯2%;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,鑰酸銨O. 001%,維生素B10. 01%,加水至10OOmT,；發酵結束后，發酵液經4000r/min離心IOmin后，清液采用O. 10 μ m的陶瓷微濾膜組件過濾,濾液用6000Dalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到原濾液體積的10%，用70%的硫 酸銨鹽析，經4000r/min離心后,沉淀用pH為6. 86的磷酸鹽緩沖鹽配制O. 5% (w/v,濕重)的酶液，采用QFF瓊脂糖凝膠柱層析純化，再經超濾脫鹽后，冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品395mg，測定其酶活 92600mU/g。
權利要求
1.一株阿魏酸酯酶高產菌株，其保藏號為CGMCC No. 5612。
2.根據權利要求I所述的菌株，其特征在于該菌株為綠色木霉菌株，該其16S核糖體DNA即16S rDNA的基因序列如Seq ID No: I所示。
3.一種利用權利要求I所述菌株生產阿魏酸酯酶的方法，主要包括綠色木霉菌液體發酵以及阿魏酸酯酶的提取分離和純化步驟，其特征在于在綠色木霉菌液體發酵中應用阿魏酸酯酶產生和積累誘導工序， 所述的阿魏酸酯酶產生和積累誘導工序具體步驟如下 A.誘導因子篩選 從阿魏酸衍生物、維生素類生長因子、酶系的調控方面篩選誘導因子，誘導因子選自維生素類或阿魏酸衍生物或誘導離子或其他它誘導因子或其混合物； B.誘導因子使用方法 維生素類或阿魏酸衍生物或誘導離子添加入發酵培養基中，結合中期補加碳源和氮源，用于誘導和促進產生阿魏酸酯酶。
4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于所述誘導因子中的誘導離子選自硼離子或鎂離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種的混合物；維生素類選自維生素B或葉酸；阿魏酸衍生物為阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯；其它誘導因子為甲殼素或殼聚糖或米糠或麩皮中的一種或幾種的混合物。
5.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于具體步驟如下 (1)綠色木霉菌液體發酵 A.菌種活化； B.液體種子制備； C.發酵菌種活化后，經液體發酵擴繁種子液，再利用液體深層發酵方法獲得含阿魏酸酯酶的發酵液； 其中發酵過程將液體種子以2-10v/v%的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加O. 5-lw/v%的碳源物質以及O. 05-0. 2w/v%的氮源物質； (2)阿魏酸酯酶的制備 A.固液分離將上述發酵的含阿魏酸酯酶的發酵液經固液分離后，清液用于制備阿魏酸酯酶； B.發酵清液采用微濾脫除膠質以及不溶性顆粒，經超濾膜濃縮后，添加保護劑，經噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品。
6.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于具體步驟如下 (1)綠色木霉菌液體發酵 A.菌種活化； B.液體種子制備； C.發酵菌種活化后，經液體發酵擴繁種子液，再利用液體深層發酵方法獲得含阿魏酸酯酶的發酵液； 其中發酵過程將液體種子以2-10v/v%的接種量接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加O. 5-lw/v%的碳源物質以及O. 05-0. 2w/v%的氮源物質； (2)阿魏酸酯酶的制備A.固液分離將上述發酵的含阿魏酸酯酶的發酵液經固液分離后，清液用于制備阿魏酸酯酶； B.將上述步驟A獲得的清液，采用微濾脫除膠質以及不溶性顆粒，經超濾膜濃縮后，用鹽析的方法，得到阿魏酸酯酶粗酶，再復溶后，配制成O. 5-2w/v%的酶液，經柱層析純化，超濾脫鹽后，冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品。
7.根據權利要求5或6所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的固液分離為板框過濾或三足式離心機離心或碟片式離心機離心；所述的步驟(3)中微濾膜的孔徑為O.1-0. 5 μ m，超濾膜的孔徑為截留物質的分子量2000-10000Dalton ;所述的鹽析介質是氯化鈉或硫酸鈉或硫酸鎂或硫酸銨溶液。
8.根據權利要求5或6所述制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中柱層析采用的是離子交換層析，使用的層析介質為DOWEX MXA-I或Q-Sepharose FF或DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose FF或717強堿性離子交換樹脂或D201大孔強堿性陰離子交換樹脂。
9.根據權利要求5或6所述制備方法，其特征在于所述的綠色木霉菌菌絲體的發酵制備具體步驟為將保存在PDA培養基上的試管斜面菌種移至20°C -25°C條件下活化4h-8h ;在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養基的三角瓶中，培養溫度24°C,搖床轉速200r/min,培養時間為48h,制備液體種子； 在發酵培養基中添加占培養基總重量O. 01-0. 05w/w%的含誘導離子的鹽，占培養基總重量O. 005-0. 02w/w%的維生素類，及占培養基總重量O. l-4w/w%的阿魏酸衍生物或其他它誘導因子或其混合物；將液體種子以2-10v/v%的接種量在無菌操作的條件下接到發酵培養基中，26°C培養48h，補加O. 5-lw/v%的碳源物質以及O. 05-0. 2w/v%的氮源物質，總共培養96-144h。
10.根據權利要求9所述制備方法，其特征在于所述的碳源物質為葡萄糖或蔗糖或淀粉中的一種或幾種的混合物；所述的氮源物質蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉或玉米漿中的一種或幾種的混合物。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株阿魏酸酯酶高產菌株及利用該菌株進行液體發酵制備阿魏酸酯酶的方法；本發明所涉及的阿魏酸酯酶生產菌株為絲狀真菌，經16SrDNA鑒定為一株綠色木霉(Trichodermaviride)，菌株代碼為JBSH-001，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.5612。可利用該菌株液體發酵生產阿魏酸酯酶，該方法發酵所得阿魏酸酯酶酶活可達200mU/ml以上,純化后的阿魏酸酯酶酶活可達50000mU/g以上。
文檔編號C12N1/14GK102796673SQ20121030754
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者徐澤平, 馬韻升, 史慶苓, 楊傳倫, 張心青, 王秀芝, 付慧君, 虞鳳慧 申請人:黃河三角洲京博化工研究院有限公司, 山東京博控股股份有限公司