人ifitm3基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人IFITM3基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開了人IFITM3基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人IFITM3基因小分子干擾RNA、人IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體、人IFITM3基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人IFITM3基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中IFITM3基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人IFITM3基因的用途及其相關(guān)藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及人IFITM3基因的用途及其相關(guān)藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]核糖核酸干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術(shù)具有較高的轉(zhuǎn)錄后沉默效率和特異性，有望成為腫瘤疾病基因治療的工具(Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer genetherapy.Cancer Gene Ther.2005; 12 (3): 217-27.)?質(zhì)粒或病毒載體可操縱一段 45_50nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA (short hairpin RNA，shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，shRNA在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)，繼而引發(fā)基因沉默或者表達(dá)抑制。慢病毒載體具有攜帶基因片段容量大、轉(zhuǎn)染效率高、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、可穩(wěn)定抑制靶基因的表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因治療、疫苗生產(chǎn)以及科學(xué)研究等領(lǐng)域(SinnPL, Sauter SLj McCray PB.Gene therapy progress and prospects: development ofimproved lentiviral and retroviral vectors-design, biosafety, and production.Gene Ther2005;12:1089-98.)D
[0003]干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM，interferoninduced transmembrane protein)基因?qū)儆诟蓴_素剌激基因中一類較小的分子。其基因家族包括5個(gè)序列相關(guān)高度保守的基因 JFITMl、IFITM2、IFITM3、IFITM5 和 IFITM6 (Martensen PM，Justesen J.Small ISGscoming forward.J Interferon Cytokine Res2004;24(I):1-19.Fredy Siegristj MartinEbelingj Ulrich Certa.The Small Interferon-1nduced Transmembrane Genes andProteins.Journal of Interferon & Cytokine January 2011; 31 (I): 183-197.)。他們參與體內(nèi)多項(xiàng)生理活動(dòng)，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Smith RA, Young JiWeis JJ，et al.Expressionof the mouse fragilis gene products in immune cells and association withreceptor signaling comp`lexes.Genes Immun2006; 7 (2): 113-121.)、細(xì)胞的粘附(EvansSS, Collea RP, Leasure JA, et al.1FN—alpha induces homotypic adhesion andLeu-13expression in human B lymphoid cells.J Immunol 1993; 150 (3): 736—747.)、月中瘤的形成(Andreu PiColnot S，Godard C，et al.1dentification of IFITM Family as a NewMolecular Marker in Human Colorectal Tumors.Cancer Res2006;66:1949-1955.)、生殖細(xì)胞的歸巢和成熟(Satomi ST，Yansula LY，Bonny T，Heiko L et al.FITM/Mil/FragilisFamily Proteins IFITMl and IFITM3Play Distinct Roles in Mouse Primordial GermCell Homing and Repulsion.Development Cell 2005;9(6):745-756.Tanaka, SSjNagamatsu，G.，Tokitakej Y，Kasaj M.，Tamj PP and Matsuij Y.Regulation of expression ofmouse interferon-1nduced transmembrane protein like gene-3, Ifitm3 (mil-1,fragilis)，in germ cells.Developmental Dynamics 2004 ;230:651-659.)、骨鹽的沉積(Hanagata N，Li X，Morita H，et al.Characterization of the osteoblast-specifictransmembrane protein IFITM5 and analysis of IFITM5_deficient mice.J Bone MinerMetab2011 ;29(3):279-290.)等。目前，除了 IFITM5蛋白在骨鹽沉積中的作用已經(jīng)確定外，其他成員的功能還不完全清楚。
[0004]IFITM3(interferon induced transmembrane protein 3，也稱為 1-8U)是IFITM家族的一個(gè)成員。IFITM3最初是從人類淋巴細(xì)胞cDNA文庫中克隆得到的(Lewin AR，Reid LEj McMahon Mj Stark GRj Kerr IM.Molecular analysis of a humaninterferon-1nducible gene family Eur J Biochem 1991; 199:417-423.)，位于染色體 11ρ15.5 (Lange UC，Saitou M，Western PS，Barton SC，Surani MA.The fragilisinterferon-1nducible gene family of transmembrane proteins is associatedwith germ cell specification in mice.BMC Dev Biol 2003;3:1.)。近來，相關(guān)學(xué)者對(duì)消化系統(tǒng)癌組織中IFITM mRNA表達(dá)水平的研究較多，有研究發(fā)現(xiàn)直腸癌和胃癌等細(xì)胞中IFITM家族基因表達(dá)水平上調(diào)(Yang Y，Lee JHj Kim KY，Song HKj KimJKj Yoon SR，Cho Dj Song KSj Lee YHj Choi 1.The interferon-1nducible 9-27 genemodulates the susceptibility to natural killer cells and the invasiveness ofgastric cancer cells.Cancer Lett 2005;221:191-200.Andreu P，Colnot S，GodardC，Laurent—Puig P，Lamarque D，Kahn A，Perret C，Romagnolo B.1dentification of theIFITM family as a new molecular marker in human colorectal tumors.Cancer Res2006;66:1949-1955.)。
[0005]Hisamatsu等報(bào)道IFITM3基因在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的癌癥組織中，表達(dá)量非常高，稱它是潰痕性結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的首選標(biāo)記基因(Hisamatsu T，Watanabe Mj OgataH, Ezaki TiHozawa S，Ishii H，Kanai Tj Hibi T.1nterferon-1nducible Gene Family 1-8UExpression in Colitis associated Colon Cancer and Severely Inflamed Mucosa inUlcerative Colitis.Cancer Res.1999;59:5927-5931.)。Seo 等也發(fā)現(xiàn) IFITM3 基因的上調(diào)可能與潰痕性結(jié)腸炎的發(fā)病相關(guān)(Seo GSj Lee JKj Yu JI，et al.1dentification of thepolymorphisms in IFITM3 gene and their association in a Korean population withulcerative colitis.Mol` Med 2010;42:99-104.))。另外，在自身免疫缺陷性疾病方面，Gottenberg等發(fā)現(xiàn)原發(fā)性干燥綜合癥患者唾液中干擾素誘導(dǎo)蛋白家族(IFITM1、IFITM2、IFITM3)基因表達(dá)上調(diào)(Gottenberg JEj Cagnard N, Luccchesi C，et al.Activation ofIFN pathways and plasmacytoid dendritic cell recruitment in target organsofprimary Sjogren，ssyndrome.PNAS2006;103:2770-2775.) 0
[0006]然而IFITM3基因在除結(jié)腸癌以外的其他腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情況未見報(bào)道，因此，有必要深入研究IFITM3基因在除結(jié)腸癌以外其他腫瘤細(xì)胞惡性增殖中的作用以及影響腫瘤細(xì)胞的增殖的分子機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于公開與人IFITM3 (interferon induced transmembraneprotein3)基因相關(guān)的治療方法及藥物，以RNA干擾(RNAi )為手段研究IFITM3基因在腫瘤細(xì)胞的存活和凋亡過程中的作用。
[0008]本發(fā)明第一方面，以RNA干擾為手段，研究了 IFITM3基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括:向腫瘤細(xì)胞施用一種能夠特異性抑制IFITM3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制IFITM3蛋白的表達(dá)或活性的分子，以此來抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化和/或存活。
[0009]所述腫瘤細(xì)胞選自其生長與IFITM3蛋白的表達(dá)或活性相關(guān)的腫瘤細(xì)胞。較優(yōu)的，所述腫瘤細(xì)胞來自乳腺癌細(xì)胞。
[0010]所述抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低IFITM3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低IFITM3蛋白的表達(dá)或活性的劑量。進(jìn)一步的，所述IFITM3基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0011]所述分子可選自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0012]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA CesiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0013]所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有IFITM3基因的啟動(dòng)子序列或IFITM3基因的彳目息序列。
[0014]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA( siRNA)。所述小干擾RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與IFITM3基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述小分子干擾RNA能特異性結(jié)合靶序列所編碼的mRNA片段，并特異性沉默人IFITM3基因的表達(dá)。
[0015]進(jìn)一步的，所述小干擾RNA的第一鏈序列與IFITM3基因中的靶序列基本相同。較優(yōu)的，所述IFITM3基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-12中之任一序列。
[0016]所述IFITM3基因中的靶序列即為所述小分子干擾RNA特異性沉默IFITM3基因表達(dá)時(shí)，與所述的小分子干擾RNA互補(bǔ)結(jié)合的m`RNA片段所對(duì)應(yīng)的IFITM3基因中的片段。
[0017]較佳的，所述IFITM3基因來源于人。
[0018]本發(fā)明第一方面還公開了一種分離的人IFITM3基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0019]進(jìn)一步的，所述腫瘤來自乳腺癌。
[0020]所述將分離的IFITM3基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容:其一，將IFITM3基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將IFITM3基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。
[0021]所述將IFITM3基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將IFITM3基因作為RNA干擾作用的靶標(biāo)，來研制針對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑，從而能降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)IFITM3基因的表達(dá)水平。
[0022]所述將IFITM3基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將IFITM3基因作為作用對(duì)象，對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人IFITM3基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的IFITM3基因小分子干擾RNA (siRNA)即是以人IFITM3基因?yàn)樽饔脤?duì)象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將IFITM3基因及其蛋白作為作用對(duì)象。
[0023]所述將IFITM3基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將IFITM3基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項(xiàng)腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0024]所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制IFITM3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制IFITM3蛋白的表達(dá)或活性的分子，從而降低腫瘤細(xì)胞中IFITM3基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0025]所述通過分離的IFITM3基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0026]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA CesiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0027]所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人IFITM3基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低人IFITM3蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使人IFITM3基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。
[0028]采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人IFITM3基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的。具體的，治療時(shí)，將能有效降低人IFITM3基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。
[0029]本發(fā)明第二方面公開了一種降低腫瘤細(xì)胞中IFITM3基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0030]a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與IFITM3基因雜交的核苷酸序列；或者
`[0031]b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與IFITM3基因雜交的核苷酸序列。
[0032]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與IFITM3基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與IFITM3基因中19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一鏈的序列與IFITM3基因中19、20或者21個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。
[0033]更進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與IFITM3基因中的靶序列基本相同。
[0034]進(jìn)一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與IFITM3基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經(jīng)加工后可成為小干擾RNA (siRNA)進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源IFITM3基因表達(dá)的作用。
[0035]更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與IFITM3基因中的靶序列基本相同。
[0036]所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與IFITM3基因中的靶序列基本相同，所述IFITM3基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默IFITM3基因表達(dá)時(shí)，被所述siRNA識(shí)別并沉默的mRNA片段所對(duì)應(yīng)的IFITM3基因中的片段。
[0037]較佳的，所述IFITM3基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-12之任一序列。
[0038]進(jìn)一步的，所述IFITM3基因來源于人。[0039]所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個(gè)核苷酸；較佳的，長度均為19-23個(gè)核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。
[0040]進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。更進(jìn)一步的，所述小干擾RNA第一鏈的序列如 SEQ ID NO:24 所示，具體為 5’ -GUGCUGAUCUUCCAGGCCUAU-3’。
[0041]SEQ ID NO:24所示的siRNA為以SEQ ID NO:6所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計(jì)的、針對(duì)人IFITM3基因的小干擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互補(bǔ)，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源IFITM3基因表達(dá)的作用。
[0042]進(jìn)一步的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0043]更進(jìn)一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:25所示，具體為:5’-GUGCUGAUCUUCCAGGCCUAUUUCAAGAGAAUAGGCCUGGAAGAUCAGCAC-3，。
[0044]shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性人IFITM3基因表達(dá)的作用。
[0045]編碼本發(fā)明所述shRNA的基因片段的干擾慢病毒載體含有SEQ ID N0:l_12中之任一序列及其互補(bǔ)序列。
[0046]本發(fā)明第三方面，公開了一種IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼本發(fā)明所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達(dá)所述shRNA
[0047]所述的人IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人IFITM3基因shRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步的，所述IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體為IFITM3基因干擾慢病毒載體。
[0048]本發(fā)明的IFITM3基因干擾慢病毒載體是將編碼前述IFITM3基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述已知`載體多為慢病毒載體，所述IFITM3基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述shRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默IFITM3基因的表達(dá)。
[0049]進(jìn)一步的，所述IFITM3基因干擾慢病毒載體還含有啟動(dòng)子序列和/或編碼腫瘤細(xì)胞中可被檢測的標(biāo)記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測的標(biāo)記物如綠色熒光蛋白(GFP)0
[0050]進(jìn)一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-pur ο > pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0051]本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人IFITM3基因干擾慢病毒載體,命名為 pGCSIL-GFP-1FITM3-siRNA。
[0052]本發(fā)明分離的核酸分子可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為乳腺癌。
[0053]本發(fā)明的IFITM3基因siRNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療腫瘤的藥物或制劑。IFITM3基因干擾慢病毒載體則可用于制備所述IFITM3基因siRNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時(shí)，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動(dòng)物。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0054]本發(fā)明第四方面，公開了一種IFITM3基因干擾慢病毒，由前述IFITM3基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生針對(duì)IFITM3基因的小分子干擾RNA，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。該IFITM3基因干擾慢病毒可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
[0055]本發(fā)明第五方面，公開了一種用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有前述的分離的核酸分子，IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或IFITM3基因干擾慢病毒。
[0056]進(jìn)一步的，所述藥物組合物含有I~99被％所述雙鏈RNA、shRNA、IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體或IFITM3基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0057]在制備這些組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
[0058]本發(fā)明還公開了所述藥物組合物在制備治療乳腺癌的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
[0059]該藥物組合物的應(yīng)用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預(yù)防或治療對(duì)象體內(nèi)腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對(duì)象中。進(jìn)一步的，所述腫瘤為乳腺癌。
[0060]所述藥物組合物用于預(yù)防或治療對(duì)象體內(nèi)腫瘤時(shí)，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對(duì)象中。采用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移被抑制。進(jìn)一步的，所述腫瘤的生長、增殖`、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
[0061]本發(fā)明第六方面，公開了一種用于降低腫瘤細(xì)胞中的IFITM3基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括:存在于容器中的所述分離的核酸分子，IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或所述的IFITM3基因干擾慢病毒。
[0062]綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)人IFITM3基因的12個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，構(gòu)建相應(yīng)的IFITM3RNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO:6 的 RNAi 載體 pGCSIL-GFP_IFITM3_siRNA 能夠顯著下調(diào)IFITM3基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-1FITM3-siRNA能夠靶向地將針對(duì)IFITM3基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，降低IFITM3基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的IFITM3基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。
[0063]本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人IFITM3基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中IFITM3基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1:pGCSIL_GFP 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0065]圖2:IFITM3-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后，IFITM3 mRNA的表達(dá)水平顯著降低
[0066]圖3:IFITM3-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制【具體實(shí)施方式】
[0067]本發(fā)明基于IFITM3基因可能與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病相關(guān)，且IFITM3在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為IFITM3可能作為腫瘤基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
[0068]本發(fā)明涉及了一組針對(duì)人IFITM3基因的小分子干擾RNA (siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人IFITM3mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)中連續(xù)的10-30 (優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)序列。通過基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源IFITM3基因的表達(dá)。
[0069]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人IFITM3基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這一研究成果表明IFITM3基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。發(fā)明人進(jìn)一步合成和測試了多種針對(duì)IFITM3基因的siRNA，篩選出了可有效抑制IFITM3的表達(dá)進(jìn)而抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和生長的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0070]本發(fā)明提供了一系列干擾人IFITM3基因的小干擾RNA (siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默IFITM3基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人IFITM3基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)IFITM3基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明IFITM3基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點(diǎn)。而且，通過RNAi方式沉默IFITM3基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。
[0071]本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為:
[0072]本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人IFITM3基因RNAi慢病毒:從Genbank中調(diào)取人IFITM3基因序列；預(yù)測siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)IFITM3基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構(gòu)建表達(dá)IFITM3基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默IFITM3基因的慢病毒。
[0073]基于上述方法，本發(fā)明提供了 12個(gè)干擾IFITM3基因的有效靶點(diǎn)(具體如SEQ IDN01-12所示)，構(gòu)建了特異干擾人IFITM3基因的慢病毒。
[0074]同時(shí)本發(fā)明還公開一種人IFITM3基因RNAi慢病毒(IFITM3_RNAi)及其制備與應(yīng)
用。
[0075]本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低IFITM3基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，IFITM3基因是一個(gè)原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，IFITM3基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的IFITM3基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0076]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京:科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
[0077]實(shí)施例1針對(duì)人IFITM3基因RNAi慢病毒的制備
[0078]1.篩選針對(duì)人IFITM3基因的有效的siRNA靶點(diǎn)
[0079]從Genbank調(diào)取IFITM3 (NM021034.2)基因信息；利用上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計(jì)軟件Genechem設(shè)計(jì)針對(duì)IFITM3基因的有效的siRNA靶點(diǎn)。在IFITM3基因的編碼序列(CDS)區(qū)域內(nèi)，每隔一個(gè)堿基起始獲得21個(gè)堿基的序列，表1列出了其中12條針對(duì)IFITM3基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列。
[0080]表1靶向于人IFITM3基因的siRNA靶點(diǎn)序列
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的人IFITM3基因在制備或篩選乳腺癌的瘤治療藥物中的用途。
2.一種降低腫瘤細(xì)胞中IFITM3基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含: a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與IFITM3基因雜交的核苷酸序列；或者 b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與IFITM3基因雜交的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA 二聚體，并且所述第一鏈的序列與IFITM3基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與IFITM3基因中的靶序列基本相同。
4.如權(quán)利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述IFITM3基因的靶序列含有SEQ ID NO: 1-12中任一序列。
5.如權(quán)利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA，該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO:24所示。
6.如權(quán)利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:25所示。
7.—種IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體,含有編碼權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達(dá)所述shRNA。
8.如權(quán)利要求7所述IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體為干擾慢病毒載體。`
9.如權(quán)利要求8所述IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自:
pLK0.l-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,
pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、
pLK0.1-puro-CMV-TagYFP, pLK0.1-puro-CMV-TagRFP,pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、
pLK0.l-puro-UbC-TurboGFP>pLK0.l-puro-UbC-TagFP635>pLKO-puro-1PTG-lxLacO、
pLK0-puro-1PTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、
pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、
pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL_GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任
o
10.一種IFITM3基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求8-9任一權(quán)利要求所述干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
11.一種用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求7-9任一權(quán)利要求所述IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求10所述的IFITM3基因干擾慢病毒。
12.權(quán)利要求11所述藥物組合物在制備治療乳腺癌的腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
13.一種用于降低腫瘤細(xì)胞中IFITM3基因表達(dá)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:存在于容器中的，權(quán)利要求2-6任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，權(quán)利要求7-9任一權(quán)利要求所述IFITM3基因干擾核酸構(gòu)建體，和/或權(quán)利要求10所述的IFITM3基因干擾慢 病毒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667423SQ201210314142
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月29日
【發(fā)明者】韓海雄, 孫琴, 顧雪鋒, 楊敏, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請(qǐng)人:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司