專利名稱：一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，屬于食品精深加工技術和功能性食品領域。
背景技術：
蛋白質經過蛋白酶水解得到的肽類物質具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血壓、降血糖、提高免疫力等。活性肽的生物活性一般高于氨基酸，其活性強弱主要與分子量的大小、氨基酸的組成和序列有關。一般來說，蛋白質的水解度越高，活性肽的分子量越低，生物活性越強。近期研究發現，常規酶解法制備的肽類可表現很好的體外活性，但是在體內卻活性很低甚至沒有活性，研究認為這可能是活性肽在活體內經腸胃消化后被降解，從而失去其原有的生物活性。
本實驗室建立了人體全仿生消化模型來評價食品中某物質的生物可利用性，得到啟示可利用人體全仿生消化模型法來水解蛋白質，從該蛋白水解液中分離制備的活性肽分子量大小適中，生理活性高，具有較好的抗體內水解性。

發明內容
本發明的目的是提供一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，該方法是一種制備高活性、高抗水解性的活性肽的體外模型法；主要是建立人體口、胃和腸的全仿生消化模型，來仿生消化蛋白質，制備高生物活性肽類，與動物模型相比，建立體外全仿生消化模型來制備活性肽，更為可靠、簡便和易行。本發明為實現以上目的，采用的技術方案如下
以來源于植物、動物或菌類的蛋白質為原料，模仿蛋白質進入人體所經歷的水解過程，即建立全仿生消化系統(包括唾液、胃液和十二指腸液三個過程)模型，然后將原料依次通過人體全仿生消化系統對蛋白質進行水解，每個過程料液比為I :5 I :50，保溫35 38°C，模擬咀嚼、腸胃蠕動的頻率進行攪拌，唾液水解過程進行2 8min，胃液和腸液的水解過程分別進行30 180min,腸液水解結束前30min,加入原料重量I 3%活性炭,水解結束后，升溫至85 100°C，保溫3 8min，鈍化酶活，冷卻，超濾，超濾液經大孔樹脂分離純化后，制備高活性、高抗性的活性肽。本發明中人體唾液仿生消化系統中唾液的制備過程為在500ml O. 02mol/L的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液中，添加O. 05gNa0H、1.50 2. 00 g KC1、0. 2 g尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸和25 mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH為6. 6 7. O。本發明中人體胃液仿生消化系統中胃液的制備過程為在500ml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中添加O. 5 g CaCl2、0. 6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH 為 I. 2 2. O。本發明中人體十二指腸仿生消化系統中十二指腸液的制備過程為在500 ml 0.01mol/L NaHCO3-KH2PO^f 沖液或碳酸鹽緩沖液，添加 5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0· I g尿素、O. 2g CaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和I. 5 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調整pH為7. 8 8. 2。本發明中超濾的分子量范圍為2000 10000 Da。根據本實驗室的相關研究結果，本發明技術方案的提出基于下述原理
I)本技術方案基于食物中某成分在人體內生物可利用性的概念(bioaccessibility ),即食物中某成分經人體口、胃和腸消化后，能夠存在于消化液中的部分，才可能被人體吸收和利用。所以，體外模擬人體口、胃和腸的消化過程對蛋白質進行消化后，存在于超濾液中的肽類即是可能被人體吸收利用的部分。這部分肽類是人體消化液消化得到的，被人體食用后也不會再被降解而失去原有的結構，也就是具有體內的抗消化性(即高抗性)。2)分子量范圍在2000 10000 Da范圍內的肽類具有高的抗氧化活性，所以在分 離純化之前采用2000 10000 Da分子量范圍的超濾。本發明相對于現有技術的優點是提供了一種簡便、易操作的制備活性高、穩定性好的生物肽的方法。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容。實施例I :全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，具體操作如下
以市售花生籽仁蛋白質20 g為原料，同時建立人體全仿生消化系統模型，該消化系統模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個過程，將原料依次通過人體全仿生消化系統進行水解，每個過程料液比為I :5，38°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動的頻率進行攪拌(100r mirT1)，仿生唾液水解8min,仿生胃液水解90min,十二指腸液水解180min,在十二指腸液水解進行到150min時,加入蛋白質重量I. 0%的活性碳,繼續水解30min,升溫至85 V,保溫8min,鈍化酶活，超濾過膜，分子量為10000 Da，超濾液通過NKA-9大孔樹脂進行分離純化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制備過程為在IOOml O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液中，添加O. OIgNaOH,O. 3gKC1、0.04 g尿素、58 mg α-淀粉酶、3 mg尿酸和5 mg粘蛋白，混合均勻后,用HCl調整pH為 6.6 ;
胃液的制備過程為在IOOml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液中添加O. I g CaCl2'
O.12 g葡萄糖、O. 066 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、O. 2 g牛血清白蛋白、O. 5g胃蛋白酶和O. 6 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH為I. 2 ;
十二指腸液的制備過程為在100 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4緩沖液，添加I gNaCUO. 01 g MgCl2^O. 02 g尿素、O. 04g CaCl2、0. 2 g牛血清白蛋白、I. 8 g胰酶和O. 3 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調整pH為7.8。通過本實施例方法制得的活性肽在羥自由基清除能力評價模型中的IC5tl值為380μ g/ml0
實施例2 :全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，具體操作如下以市售魚皮蛋白質20 g為原料，同時建立人體全仿生消化系統模型，該消化系統模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個過程，將原料依次通過人體全仿生消化系統進行水解，每個過程料液比為I :50，在35°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動的頻率進行攪拌(100r mirT1)，仿生唾液水解2min,仿生胃液水解30min,十二指腸液水解30min,十二指腸液水解開始時,加入蛋白質重量3%的活性炭，水解30min，升溫至100°C保溫3min，鈍化酶活，冷卻，超濾過膜，分子量為2000 Da，超濾液通過DA201-C大孔樹脂進行分離純化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制備過程為在IOOOml O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液中，添加O. lgNaOH、4gKCl、0.4g尿素、580 mg α-淀粉酶、30 mg尿酸和50 mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整PH 為 7 ;
胃液的制備過程為在IOOOml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液中添加I g CaCl2U. 2g葡萄糖、O. 66g氨基葡萄糖鹽酸鹽、2 g牛血清白蛋白、5g胃蛋白酶和6g粘蛋白，混合均勻 后，用HCl調整pH為1.5 ;
十二指腸液的制備過程為在1000 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4緩沖液，添加10 gNaCUO. Ig MgCl2、O. 2g尿素、O. 4 g CaCl2、2g牛血清白蛋白、18 g胰酶和3g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調整pH為8。通過本實施例方法制得的活性肽在抑制ACE酶活性評價模型中的IC5tl值為422μ g/ml0
實施例3 :全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，具體操作如下
以提取自竹蓀的蛋白質20 g為原料(采用水提鹽析法制備蛋白質)，同時建立人體全仿生消化系統模型，該消化系統模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個過程，將原料依次通過人體全仿生消化系統進行水解，每個過程料液比為I :25，在37°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動的頻率進行攪拌(100r mirT1)，仿生唾液水解5min，仿生胃液水解90min，十二指腸液水解120min,在十二指腸液水解進行到90min時,加入蛋白質重量I. 5%的活性碳,繼續水解30min,升溫至90°C保溫5min，鈍化酶活，超濾過膜，分子量為3000 Da,超濾液通過AB-8大孔樹脂進行分離純化，得到高活性、高抗性的活性肽；
其中唾液的制備過程為在500ml O. 02mol/L的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液中，添加
0.05gNa0HU.8 g KC1、0. 2 g尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸和25 mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH為6.8 ;
胃液的制備過程為在500ml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液或甘氨酸_鹽酸緩沖液中添加O. 5 g CaCl2、0.6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH為2.0 ;
十二指腸液的制備過程為在500 ml 0.01 mol/L NaHCO3-KH2PO4緩沖液或碳酸鹽緩沖液，添加5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0. I g尿素、O. 2 g CaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和
1.5 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調整pH為8. 2。通過本實施例方法制得的活性肽在羥自由基清除能力評價模型中的IC5tl值為110μ g/ml0
權利要求
1.一種全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于首先建立人體全仿生消化系統模型，該消化系統模型包括唾液、胃液和十二指腸液三個過程，然后以來源于植物、動物或菌類的蛋白質為原料，并將該原料依次通過人體全仿生消化系統對蛋白質進行水解，每個過程料液比為I :5 I :50，在35 38°C保溫，模擬咀嚼或腸胃蠕動的頻率進行攪拌，唾液水解過程進行2 8min，胃液和腸液的水解過程分別進行30 180min，腸液水解結束前30min，加入原料重量I 3%的活性炭，水解結束后，升溫至85 100°C，保溫3 8min,鈍化酶活，冷卻，超濾，超濾液經大孔樹脂分離純化后，得到高活性、高抗性的活性肽。
2.根據權利要求I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于 人體唾液仿生消化系統中唾液的制備過程為在500ml O. 02mol/L的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液中，添加 O. 05gNa0H、l. 50 2. 00 g KC1、0. 2 g 尿素、290 mg α-淀粉酶、15 mg 尿酸和 25mg粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH為6. 6 7. O。
3.根據權利要求I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于人體胃液仿生消化系統中胃液的制備過程為在500ml O. 02mol/L的氯化鉀-鹽酸緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中添加O. 5 g CaCl2^O. 6 g葡萄糖、O. 33 g氨基葡萄糖鹽酸鹽、I g牛血清白蛋白、2. 5 g胃蛋白酶和3 g粘蛋白，混合均勻后，用HCl調整pH為I. 2 2. O。
4.根據權利要求I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于人體十二指腸仿生消化系統中十二指腸液的制備過程為在500 ml O. 01 mol/LNaHCO3-KH2POjl沖液或碳酸鹽緩沖液，添加 5 g NaCUO. 05 g MgCl2、0. I g 尿素、O. 2 gCaCl2U g牛血清白蛋白、9 g胰酶和I. 5 g脂肪酶，混合均勻后，用HCl調整pH為7. 8 8. 2。
5.根據權利I所述的全仿生消化模型法制備生物活性肽的方法，其特征在于超濾的分子量范圍為2000 10000 Da。
全文摘要
本發明公開了一種仿生消化模型法制備活性肽的制備方法，以來源于植物、動物或菌類的蛋白質為原料，以全仿生消化系統，包括唾液、胃液和十二指腸液，進行水解，水解液通過超濾過膜，并進一步通過大孔樹脂進行分離純化后，制備高活性、高抗性的活性肽，該方法簡單易操作。
文檔編號A23J3/30GK102823715SQ20121034713
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者莊永亮, 張玉鋒, 劉蒙蒙, 孫麗平 申請人:昆明理工大學