專利名稱：一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術。
背景技術：
基因芯片也叫DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray)、寡核苷酸陣列(oligonucleotide array),該技術系指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息，來實現對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫學診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術，所以稱之為基因芯片技術。基因芯片技術由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量 序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交(Southern Blotting和NorthernBlotting等)技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。但是，通常基因芯片在檢測之前，需要對從樣品中獲取的DNA/mRNA樣品必須進行擴增提高閱讀靈敏度。在PCR擴增過程中，必須同時進行樣品標記，標記方法有熒光標記法、生物素標記法、同位素標記法等。而且，在擴增過程中由于DNA的序列差異，所摻入的熒光標記的dCTP不一致,在同樣條件下，G/C含量高的DNA信號明顯強于G/C含量低的DNA。在芯片檢測之前，PCR產物與芯片上的探針進行雜交，所需時間長，不同分子所需雜交條件不一致，誤差大，且由于雜交位于固相表面，所以有一定程度的空間阻礙作用。樣品制備上，當前多數公司在標記和測定前都要對樣品進行一定程度的擴增以便提高檢測的靈敏度，但仍有不少人在嘗試繞過該問題，這包括Mosaic Technologies公司的固相PCR擴增體系以及Lynx Therapeutics公司提出的大量并行固相克隆方法,兩種方法各有優缺點,但目前尚未取得實際應用。鏈置換等溫擴增技術是近幾年發展起來的一種酶促DNA體外等溫擴增方法，即，具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒定溫度下用非熱變性的方法解開DNA雙鏈的，在延伸新鏈的同時將下游舊鏈剝離的一種新的擴增方式。分子信標是一種設計巧妙的熒光探針。在長度為15-30 mer寡核苷酸探針的兩端分別加上5-8 mer序列互補的莖桿區。在自由狀態時由于莖桿區互補序列的結合使探針分子形成發夾狀結構，所以又被稱為發夾探針。探針的5’端及3’端分別標記熒光素分子及淬滅劑分子。自由狀態時，發夾結構的兩個末端靠近，使熒光分子與淬滅分子靠近(約為7-10 nm)，此時發生熒光共振能量轉移，熒光分子發出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發，熒光幾乎完全被猝滅，熒光本底極低。當分子信標與序列完全互補的靶標分子結合形成雙鏈雜交體時，信標莖桿互補區被拉開，熒光分子和淬滅分子距離增大，熒光分子所產生的熒光不能被淬滅分子所吸收，發射熒光。且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標的量成正比。分子信標技術以其操作簡單、靈敏度高、特異性強、可對核酸進行實時定量測定、甚至可以用于活體分析等特點不僅在生物學研究中有著廣泛的應用，而且在疾病基因檢測與診斷等生物醫學基礎和臨床研究中也將充當重要的角色。

發明內容
本發明的目的在于提供一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術 本發明所采用的技術方案是
一種采用分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測目標DNA/RNA的方法，包括如下步
驟
(O分子信標的設計分子信標包括環狀區、5’莖桿區和3’莖桿區；其中，環狀區能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區的序列比3’莖桿區長出8 25個堿基，標記為5’莖桿區延長段，5’莖桿區連接環狀區部分的序列與3’莖桿區序列互補，使得形成發夾結構 ；分子信標3’端修飾有熒光分子；
(2)芯片點樣與鏈置換等溫擴增反應將分子信標5’端固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將淬滅探針及樣品DNA/RNA與芯片進行雜交，洗滌，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因；
或者是將分子信標與淬滅探針混合，點樣固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物及樣品DNA/RNA加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因；
所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少有8個堿基與5’莖桿區延長段互補，優選為12個堿基；所述引物與3’莖桿區互補；
(3)對擴增結果進行熒光數值分析，根據熒光值，確定樣品DNA是否為目標DNA及其含量。分子信標的環狀區為長度15 30個堿基的序列。5’莖桿區和3’莖桿區的互補序列長5 11個堿基。為了避免分子信標太接近芯片表面而產生空間位阻影響反應，可在分子信標的5’端連接10 30個胸腺嘧啶或腺嘌呤。為實現將分子信標固定在固相支持物上，需對分子信標的5’末端進行化學修飾，其修飾基團應與固相支持物表面修飾的化學基團發生共價化學反應，以便將分子信標DNA穩定牢固地連接在固相支持物表面，如分子信標5’末端修飾氨基，固相支持物表面修飾醛基，貝1J可形成Schiff base,使分子信標穩定牢固地連接在固相支持物表面。分子信標3’ 端標記的熒光分子為 FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5. 5、PE、TAMRA、ROX> Texas Red、AMCA> JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye 等有機突光染料或量子點等無機染料中的任一種；淬滅探針上的突光淬滅基團為P-苯二胺(Para-phenylene diamine,PPD)、η-丙基沒食子酸鹽(propyl gallate，NPG)、1，4-二偶氮雙環(2，2，2)-辛烷(I,4-diazobicyelo (2, 2, 2) -octane, DABC0)、TAMRA、BHQ-l、BHQ_2、Eclipse、Iowa Black、納米金顆粒中的任一種。固相支持物為玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一種。優選的，在鏈置換等溫擴增過程中，加入用熒光標記的dCTP，可以提高其檢測的靈敏度。一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測試劑盒，包括固定在固相支持物表面的分子信 標、淬滅探針、引物、鏈置換等溫擴增反應液，其中
所述分子信標包括環狀區、5’莖桿區和3’莖桿區；其中環狀區能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區的序列比3’莖桿區長出8 25個核苷酸，標記為5’莖桿區延長段，5’莖桿區靠近環狀區部分的序列與3’莖桿區序列互補與3’莖桿區序列互補，使得形成發夾結構；分子信標的5’端修飾有-NH2, 3’端修飾有熒光分子；
所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少8個堿基與5’莖桿區延長段互補；
所述引物與3’莖桿區互補。鏈置換等溫擴增反應液的組成為50mM Tris-HCl pH 7. 0 8. 0，I. 5 mM MgSO4,10mM 二硫蘇糖醇(DTT)，50 400 μ M 每種 dNTP，20 μ g/ml BSA, 25 100 U/ml DNA 聚合酶。本發明綜合鏈置換等溫擴增技術及分子信標技術的優點，使DNA在等溫條件下進行擴增，且隨著DNA的擴增，分子信標的熒光信號不斷被釋放，被釋放的目標DNA又結合到新的分子信標上，從而進行下一輪的擴增及熒光信號釋放。依靠DNA聚合酶的鏈置換反應達到擴增放大信號的目的，通過分子信標的開環和閉環達到信號檢測的目的。由于DNA聚合酶的鏈置換反應，消除了淬滅基團由于熒光能量共振轉移對熒光基團發光的影響。在沒有外加和環互補的DNA時，分子信標處于閉合狀態，熒光基團與淬滅基團相鄰而不發光，而加入該DNA后環被打開，標記的基團之間距離增大，使淬滅基團不能有效淬滅熒光，從而發出檢測信號。本發明的有益效果在于
本發明使DNA/RNA擴增與信號檢測合為一體，且不需要額外標記、雜交及洗滌過程，既簡化了操作步驟，提高效率，又可以將反應在恒溫下進行，從而避免了 PCR儀的使用。也可基因邊擴增邊檢測，實現了芯片的實時檢測，使結果更加準確可靠。同時，樣品中目標DNA與分子信標的雜交發生在分子信標的環上，避免了傳統生物芯片由于雜交位于固相表面所產生的空間位阻的影響。因此，本發明分子信標鏈置換等溫擴增實時檢測基因芯片的研制，綜合了鏈置換反應及分子信標的優點，克服了傳統基因芯片的缺點，實現DNA及RNA生物表達水平的實時高通量的檢測，為功能基因組學、蛋白質組學、臨床診斷與藥物篩選等領域中的DNA及RNA相關研究提供新方法。


圖I是本發明分子信標的結構示意圖(I :環狀區，2 :3’莖桿區，3 :5’莖桿區，4 :5’莖桿區延長段);
圖2是分子信標、通用淬滅探針及通用引物之間的關系示意 圖3是技術原理及方案流程 圖4是丙型肝炎病毒檢測基因芯片實時熒光掃描結果(從左到右依次為丙型肝炎病毒RNA樣品組、乙型肝炎病毒DNA樣品組和HIV病毒RNA樣品組)；圖5是HIV病毒檢測基因芯片實時熒光掃描結果(從左到右依次為HIV病毒RNA樣品組I、HIV病毒RNA樣品組2、乙型肝炎病毒DNA樣品組、丙型肝炎病毒RNA樣品組)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例I
本實施例僅以醛基玻片為固相支持物，檢測丙型肝炎病毒RNA為例，說明本發明的研制及其應用。(I)探針的設計及合成
試驗中所涉及的探針由上海生工生物技術有限公司合成， 針對丙型肝炎病毒RNA的檢測，設計了 I條分子信標，序列如下
MB: NH-T2tlU TCA TCA TCA TCA TTCTTGGACACAkCT KkCQCCkTQQCT KQkCCTGTGTCCAAGA -FAM(SEQ ID N0:1)(T2CI為連接分子信標與固相支持物的20個T，下劃線為環狀區序列，斜體為莖桿區序列，加粗為5’莖桿區延長段)；
通用淬滅探針GTAGTAGTAGTA-TAMRA (SEQ ID N0:2)；
通用引物CTTTCTATCTTTCTATCTTGGAC (SEQ ID NO:3);
其中，分子信標結構見圖1，分子信標結構和淬滅探針及引物之間的關系，如圖2所示。通用淬滅探針與分子信標的5’莖桿區延長段特異互補，通用引物與分子信標的3’莖桿區特異性互補。(2)芯片的設計及點樣
玻片醛基化玻片(購自博奧生物科技有限公司)
(i)將上述氨基修飾的分子信標，用4X SSC溶解，配置濃度為200 nM，并在95°C變性5分鐘，之后緩慢降至室溫，保持I小時，使分子信標復性，并折疊成正確的結構；
( )取上一步得到的產物和等量體積的DMSO混勻后，采用點樣儀，按照預先設計的排列順序，在上述醛基玻片上開始點樣；
(iii)點樣后，將芯片置于濕盒內，密封濕盒，于42°C反應過夜。然后用4XSSC清洗，去除沒有結合上的分子信標。(3)樣品DNA/RNA及淬滅探針與芯片的雜交
將樣品DNA/RNA(1 nM)及淬滅探針(200 nM)混合液加入到已固定有分子信標的玻片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置于密封濕盒內，42°C雜交反應I小時；雜交反應后玻片用4X SSC (含O. 1%SDS)溶液洗滌兩次，最后用超純滅菌水清洗2遍，置于離心管中離心，去掉表面液體并室溫自然干燥。(4)芯片上的等溫鏈置換反應及芯片的實時檢測
將含通用引物(10 nM)的鏈置換等溫擴增反應液(200 μ L)加到步驟(3)中的微陣列芯片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，42°C等溫擴增lh，并在芯片掃描儀下進行實時掃描，記錄突光信號，根據Robust Multiple-array Average (RMA)方法進行數據分析。鏈置換等溫擴增反應液(200 μ L)的組成為5 U polymerase Klenow fragmentexo- (Fermentas),50 μ M each dNTPs,40 mM Tris-HCl ρΗ7. 8,10 mM DTT,10 mM MgCl20
本次實驗設三個實驗組(丙型肝炎病毒RNA樣品組、乙型肝炎病毒DNA樣品組和HIV病毒RNA樣品組)，各組均設一個空白對照(以去離子水替代分子信標)。實驗結果如圖4所示僅丙型肝炎病毒RNA樣品組具有熒光信號，熒光強度為8. 27855，根據RMA分析，其核酸濃度為I. 0524nM,乙型肝炎病毒DNA樣品組和HIV病毒RNA樣品組、以及各空白對照組均沒有熒光信號，說明本方法的檢測結果準確可靠。實施例2
本實施例僅以醛基玻片為固相支持物，檢測HIV病毒RNA為例，說明本發明的研制及其應用。(I)探針的設計及合成
試驗中所涉及的探針由上海生工生物技術有限公司合成，
針對HIV病毒RNA的檢測，設計了 I條分子信標，序列如下
MB: NH-To.-^TCATCATCATCATTCTTGGACACAQkkCCkkQQQQkkCTQkCTGTGTCCAAGA-FAMi SEQID N0:4) (T2tl為連接分子信標與固相支持物的20個T，下劃線為環狀區序列，斜體為莖桿區序列，加粗為5’莖桿區延長段)；
通用淬滅探針GTAGTAGTAGTA-TAMRA (SEQ ID N0:5)；
通用引物TCATCAATCAATCTTTCTTGGAC (SEQ ID N0:6)；
其中，分子信標結構和淬滅探針及引物之間的關系，如圖2所示。通用淬滅探針與分子信標的5’莖桿區延長段特異互補，通用引物與分子信標的3’莖桿區特異性互補。(2)芯片的設計、淬滅探針雜交及點樣
玻片醛基化玻片(購自博奧生物科技有限公司)
(i)將上述氨基修飾的分子信標和淬滅探針，用4X SSC混合溶解，配置濃度均為200nM，并在95°C變性5分鐘，之后緩慢降至室溫，保持I小時，使分子信標復性，并折疊成正確的結構，同時淬滅探針結合到分子信標上；
( )取上一步得到的產物和等量體積的DMSO混勻后，采用點樣儀，按照預先設計的排列順序，在上述醛基玻片上開始點樣；
(iii)點樣后，將芯片置于濕盒內，密封濕盒，于42°C反應過夜。然后用4XSSC清洗，去除沒有結合上的分子信標和探針。(3)樣品RNA與芯片的雜交
將樣品RNA (I nM)加入到已固定有分子信標的玻片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置于密封濕盒內，42°C雜交反應I小時；雜交反應后玻片用4 X SSC (含O. P/oSDS)溶液洗滌兩次，最后用超純滅菌水清洗2遍，置于離心管中離心，去掉表面液體并室溫自然干燥。(4)芯片上的等溫鏈置換反應及芯片的實時檢測
將含通用引物(10 nM)的鏈置換等溫擴增反應液(200 μ L)加到步驟(3)中的微陣列芯片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，42°C等溫擴增lh，并在芯片掃描儀下進行實時掃描，記錄突光信號，根據Robust Multiple-array Average (RMA)方法進行數據分析。鏈置換等溫擴增反應液(200 μ L)的組成為5 U polymerase Klenow fragmentexo- (Fermentas),50 μ M dNTPs, 40 mM Tris-HCl pH7. 8,10 mM DTT,10 mM MgCl20本次實驗設四個實驗組(HIV病毒RNA樣品組1、HIV病毒RNA樣品組2 (鏈置換等溫擴增反應液中的dCTP以等濃度的FAM-11-dCTP代替))、乙型肝炎病毒DNA樣品組、丙型肝炎病毒RNA樣品組，各組均設一個空白對照(以去離子水替代分子信標)。實驗結果如圖5所示乙型肝炎病毒DNA樣品組和丙型肝炎病毒RNA樣品組、以及各空白對照組均沒有熒光信號，僅HIV病毒RNA樣品組及HIV病毒RNA樣品組2具有熒光信號，HIV病毒RNA樣品組熒光強度分別為7. 7218，根據RMA分析，其核酸濃度為O. 9986nM，HIV病毒RNA樣品組2熒光強度為10. 63853，HIV病毒RNA樣品組2的熒光值高于HIV病毒RNA樣品組的熒光值，證明FAM-I Ι-dUTP對dCTP的替換能起到提高熒光信號的作用，說明本方法的檢測結果準確可靠。以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本 發明精神的范圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。
權利要求
1.一種采用分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測目標DNA/RNA的方法，包括如下步驟 (1)分子信標的設計分子信標包括環狀區、5’莖桿區和3’莖桿區；其中，環狀區能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區的序列比3’莖桿區長出8 25個堿基，標記為5’莖桿區延長段，5’莖桿區連接環狀區部分的序列與3’莖桿區序列互補，使得形成發夾結構；分子信標3’端修飾有熒光分子； (2)芯片點樣與鏈置換等溫擴增反應將分子信標5’端固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將淬滅探針及樣品DNA/RNA與芯片進行雜交，洗滌，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因； 或者是將分子信標與淬滅探針混合，點樣固定到固相支持物表面，形成分子信標微陣列芯片，然后將鏈置換等溫擴增反應液、引物及樣品DNA/RNA加到微陣列芯片上，等溫擴增目的基因； 所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少有8個堿基與5’莖桿區延長段互補；所述引物與3’莖桿區互補； (3)對擴增結果進行熒光數值分析，根據熒光值，確定樣品DNA是否為目標DNA及其含量。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，分子信標的環狀區為長度15 30個堿基的序列；5’莖桿區和3’莖桿區的互補序列長5 11個堿基。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述分子信標的5’端連接有10 30個胸腺嘧啶或腺嘌呤。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述分子信標的5’末端修飾氨基，固相支持物表面修飾醛基。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，分子信標3’端標記的熒光分子為FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5. 5、PE、TAMRA、ROX、Texas RecUAMCA、JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye等有機熒光染料或量子點等無機染料中的任一種；淬滅探針上的熒光淬滅基團為 P-苯二胺(Para-phenylene diamine, PPD)、η-丙基沒食子酸鹽(propyl gallate,NPG)、1，4- 二偶氮雙環(2，2,2)-辛烷(1，4-diazobicyelo (2,2,2)-octane,DABC0)、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、Iowa Black、納米金顆粒中的任一種。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述固相支持物為玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一種。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述鏈置換等溫擴增反應液的組成為50mM Tris-HCl pH 7· 0 8· 0，I. 5 mM MgSO4,10 mM 二硫蘇糖醇(DTT)，50 400 μ M 每種dNTP，20 μ g/ml BSA，25 100 U/ml DNA 聚合酶。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，可在鏈置換等溫擴增過程中，所加入的dCTP用熒光標記。
9.一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測試劑盒，包括固定在固相支持物表面的分子信標、淬滅探針、引物、鏈置換等溫擴增反應液，其中 所述分子信標包括環狀區、5’莖桿區和3’莖桿區；其中環狀區能與目標DNA/RNA特異結合，5’莖桿區的序列比3’莖桿區長出8 25個核苷酸，標記為5’莖桿區延長段，5’莖桿區靠近環狀區部分的序列與3’莖桿區序列互補與3’莖桿區序列互補，使得形成發夾結構；分子信標的3’端修飾有熒光分子； 所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團的寡核苷酸序列，至少8個堿基與5’莖桿區延長段互補； 所述引物與3’莖桿區互補。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈置換等溫擴增反應液的組成為50mM Tris-HCl pH 7· 0 8· 0，1. 5 mM MgSO4,10 mM 二硫蘇糖醇(DTT)，50 400 μ M 每種 dNTP，20 μ g/ml BSA，25 100 U/ml DNA 聚合酶。
全文摘要
本發明公開了一種分子信標鏈置換等溫擴增基因芯片檢測技術及試劑盒。本發明綜合鏈置換等溫擴增技術及分子信標技術的優點，使DNA在等溫條件下進行擴增，且隨著DNA的擴增，分子信標的熒光信號不斷被釋放，被釋放的目標DNA又結合到新的分子信標上，從而進行下一輪的擴增及熒光信號釋放。依靠DNA聚合酶的鏈置換反應達到擴增放大信號的目的，通過分子信標的開環和閉環達到信號檢測的目的。本發明使DNA/RNA擴增與信號檢測合為一體，且不需要額外標記、雜交及洗滌過程，既簡化了操作步驟，提高效率，且實現了芯片的實時檢測，使結果更加準確可靠。
文檔編號C12Q1/68GK102888457SQ20121036182
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月25日 優先權日2012年9月25日
發明者龔桂香 申請人:江陰天瑞生物科技有限公司