專利名稱：一種抗炭疽pa抗原的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗炭疽單抗的基因和基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備炭疽治療藥物中的應用。
背景技術：
炭疽是由炭疽芽胞桿菌(Bacillus Anthrax)引起的人畜共患重大烈性傳染病。在世界范圍內具有廣泛的分布。根據感染途徑不同，人類炭疽分為皮膚炭疽、胃腸炭疽和吸入性炭疽三種原發類型。在我國，肺炭疽因為病死率高而作為I類傳染病進行管理。炭疽芽孢桿菌包含兩個主要的毒力因子以Y鍵相聯結的聚-D-谷氨酰莢膜(PGA)和由三種蛋白組分構成的炭疽毒素。其中莢膜能阻止細菌被宿主免疫細胞吞噬，而毒素是造成宿主損傷和死亡的主要原因。炭疽毒素由細菌質粒POXl編碼，包括三種蛋白質成分保護性抗原(Protective antigen,PA)、致死因子(Lethal factor,LF)和水腫因子(Edema factor,EF)。其中PA能誘導機體的保護性免疫，是目前唯一獲美國食品藥品監督管理局批準的人用炭疽吸附疫苗(anthrax vaccine absorbed,AVA)的主要免疫活性成分。LF具有金屬依賴的蛋白酶活性，能夠分解MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase,有絲分裂原激活蛋白激酶激酶)并使巨噬細胞溶解；EF具有鈣調蛋白依賴的腺苷酸環化酶活性，可使靶細胞內環磷酸腺苷濃度升。致宿主細胞內信號通路損傷，防御能力下降，打破體液平衡導致水腫。實驗證實，炭疽毒素是一種AB (active-binding)的模式。PA是復合物中的“B”，與
細胞膜上的炭疽毒素受體(anthrax toxin receptor, ATR)-腫瘤肉皮細胞標志8 (TEM8)
或2型毛細血管形成蛋白(CMG2)結合，由位于細胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段(PA63)發生寡聚化，在膜上形成七聚體((PA63)7)。LF和EF是“A”，能夠結合七聚體形成的復合物通過受體介導的內吞進入細胞。在內吞小體酸性pH的環境下，PA七聚體發生構象改變，形成一個管道，使EF和LF進入胞液，分別發揮毒性作用。這三個蛋白本身都是無毒的,但PA和LF的混合物稱為致死毒素(Lethal toxin,LT),可以導致實驗動物的致死性休克。PA和EF的混合物稱為水腫毒素(Edema toxin, ET)，在注射處可引起水腫。炭疽的醫學防護措施主要有預防和治療二大方面。目前有效的預防措施主要是接種炭疽疫苗，接觸前I 2個月進行預防性接種，能為人員提供免疫防護。有效的治療措施主要有二大類一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑，其中包括抗菌素和噬菌體的溶菌成分；另一類是依據炭疽病理模型設計的毒素抑制劑，主要包括炭疽毒素中和抗體、可溶性受體、毒素突變體和小分子拮抗劑。目前炭疽的治療主要依靠抗菌素，多種抗菌素對炭疽有效，但如出現以下情況，臨床上往往不能奏效。I、未能及時服用抗菌素抗菌素一般需要在機體接觸炭疽芽孢后的48小時內使用，即繁殖體階段使用，可以有效治療。但炭疽感染的潛伏期可以持續數小時甚至幾天，這一階段的癥狀表現類似流感，易誤診，錯過最佳治療時機；
2、人體產生耐藥性抗菌素濫用是目前嚴重的世界公共衛生問題，一些個體對許多抗菌素已產生抗藥性，使得抗菌素治療無效；3、炭疽桿菌人為改構將抗菌素抗性基因導入炭疽桿菌，使外用抗菌素失效，這在現今基因操作技術上已完全可能?？咕貙?吸入性炭疽的治療雖然有效，但必須在感染初期立即使用，抗菌素只能殺死人體組織內的部分炭疽熱孢子和細菌，卻不能抵抗孢子和細菌在體內產生的大量毒素，而在感染晚期由于毒素的大量產生，仍會導致患者死亡。目前國外的研究主要集中在發現能抵抗炭疽毒素的藥物方面，包括中和單抗、可溶性受體、PA突變體和小分子抑制劑等。中和單抗因為具有保護性高，半衰期長，性質穩定等優點，成為目前最有前景的炭疽毒素抑制劑。不管是抗菌素還是中和單抗，單獨用藥均存在不足，設想在特殊情況下，聯合應用抗菌素和中和性單抗可以相互彌補，最大可能的發揮治療作用。目前單抗和抗菌素聯合用藥處于臨床研究階段。Pharmathene公司2009年開展的環丙沙星和Valortim(單抗)以及Doxycycline和Valortim(單抗)聯合用藥的I期臨床試驗。國內外的研究發現，抗LF/EF抗體能阻斷LT/ET發揮活性，保護動物抵抗炭疽毒素或者炭疽芽孢的攻擊。但是無論是被動免疫還是治療，效果均不及抗PA抗體。而抗PA中和性抗體的作用要比針對炭疽毒素其他組分的中和性抗體更加重要。①在感染初期，因莢膜表面有PA的存在，抗PA抗體能與芽孢結合，增強巨噬細胞的吞噬作用，抑制出芽或通過氧化殺死正在出芽的芽孢，因此，抗PA抗體具有抗芽孢的活性。②芽孢被巨噬細胞吞噬后，導致巨噬細胞裂解，釋放繁殖體，并伴有一定量的PA，LF及EF的分泌表達，蛋白酶水解PA，裝配成七聚體，結合LF和EF后內吞入細胞發揮毒素作用。抗PA抗體可以通過抑制PA裝配或與細胞結合來發揮作用。國內外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗體，能夠起到預防炭疽感染保護機體的作用。而且，在攻毒后一定時間內給藥(24 48h)仍能夠起到保護作用，即使是在出現體征(如休克)后給藥也可以起到一定的治療作用。已經有多家公司或研究機構進行抗炭疽抗體的研究，其中有4家宣布完成I期臨床研究(3家重組，I家為血液提取制品)，2家公司正在進行I期臨床(I家重組，I家血液提取的)，(www. clinicaltrial. gov),多家公司正在進行臨床前研究。中國專利200480017547. 7公開了一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體(5E8)，但是該單抗在動物實驗中，未能表現出良好的保護效果，因此距離藥物開發還具有較大的距離。中國專利200610165844. 7也公開了一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體(5E1)，但是發明人研究發現，在細胞水平上，5E1與PA的結合力偏弱，不能用于以后的藥物代謝動力學研究。因此本發明的目的就是提供具有更高的親合力和良好保護效果，人源化程度更高的抗炭疽PA毒素的單克隆抗體。

發明內容
本發明通過單克隆抗體技術篩選到了對炭疽PA抗原具有高度親合力的單克隆抗體，并獲取了賦予所述抗體優異特性的重鏈和輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區的氨基酸和核苷酸序列，并對所述抗體的重鏈和輕鏈恒定區以及可變區FR1-4區進行了人源化改造，最終獲得了具有特異的抗原結合性、優異的毒素中和活性以及良好的動物保護功能。
本發明首先公開了一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區的氨基酸序列如SEQ ID N02第45_54、69_87、120-129位氨基酸序列所示，在本發明中，同時以SEQ ID N012、14和16分別表示重鏈可變區的⑶R1XDR2和⑶R3區的氨基酸序列；輕鏈可變區的⑶R1XDR2和⑶R3區的氨基酸序列如SEQ ID N018第46-55、71-77、110-118位氨基酸序列所示，在本發明中，同時以SEQ ID N028、30、32分別表示輕鏈可變區的⑶R1、⑶R2和⑶R3區的氨基酸序列。在本發明的一個優選技術方案中，所述單克隆抗體重鏈可變區的FR1-FR4區氨基酸序列分別如SEQ ID N04、6、8、10所示，重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID N034所示；輕鏈可變區的FR1-FR4區氨基酸序列分別如SEQ ID N020、22、24、26所示，輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。該抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的FR1-FR4區以及重鏈恒定區和輕鏈恒定區均是經過人源化改造的序列，而CDR區未進行人源化改造，故稱之為人源化抗體。所述單克隆抗體重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO 2第1_140位氨基酸序列所示，重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO 34所示；輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID NO18第1-128位氨基酸序列所示，輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID NO 36所示。該抗體的重鏈恒定區和輕鏈恒定區是經過人源化改造的序列，而重鏈可變區及輕鏈可變區未進行人源化改造，故稱之為嵌合抗體。在本發明的又一個優選技術方案中，所述單克隆抗體重鏈全長氨基酸序列如SEQID NO 2所示，輕鏈全長氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。該抗體的重鏈可變區和恒定區，輕鏈可變區和恒定區未進行人源化改造，故稱之為鼠源抗體。本發明還提供了編碼上述單克隆抗體重鏈和輕鏈的核酸，在一個優選的技術方案中，所述人源化抗體的重鏈的可變區的⑶R1XDR2和⑶R3區的堿基編碼序列分別如SEQ IDNO I第133-162、184-255、358-387位核苷酸所示，在本發明中，同時以SEQ ID N011、13和15分別表示重鏈可變區的⑶R1、⑶R2和⑶R3區的堿基編碼序列；FR1_FR4區堿基序列分別如SEQ ID N03、5、7、9所示，重鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述人源化抗體輕鏈的可變區的CDR1、CDR2和CDR3區的堿基編碼序列如SEQ ID N03第136-165、211-231、328-354所示，在本發明中，同時以SEQ ID N027、29和31分別表示輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區的堿基編碼序列；FR1_FR4區堿基序列分別如SEQ ID N019、21、23、25所示，輕鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N035所示。在另一個優選技術方案中，所述嵌合抗體的重鏈可變區的堿基編碼序列如SEQ IDNOl第1-420位核苷酸所示，重鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述輕鏈可變區的堿基編碼序列如SEQ ID N03第1-384位核苷酸所示，輕鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N035 所示。在又一個優選技術方案中，所述鼠源抗體重鏈的堿基編碼序列如SEQ ID NOl所示，所述輕鏈的堿基編碼序列如SEQ ID NO 17所示。本發明還提供了含有上述編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的核苷酸編碼的表達載體。在一個優選的技術方案中，所述載體為pMH3S分泌型真核表達載體。本發明還提供了一種含有上述表達載體的宿主細胞。在一個優選的技術方案中，所述細胞為CHO-S細胞。
本發明還提供了上述任一單克隆抗體在制備炭疽治療藥物中的應用。所述單克隆抗體可以作為藥物分子特異性識別和結合炭疽PA抗原，從而抑制PA裝配或與細胞結合來發揮作用，預防炭疽感染或者治療炭疽感染性疾病。本發明還提供了一種藥物組合物，所述組合物含有上述任一單克隆抗體，以及可藥用的載體。本發明還提供了一種含有上述任一單克隆抗體的免疫交聯物，其特征在于，所述單克隆抗體與效應分子連接。所述單克隆抗體在免疫交聯物中起靶向作用，可以將具有特殊生化效應的效應分子遞送至炭疽病原體上，發揮治療效應，細胞毒素、或者放射性同位素均可以作為效應分子與上述單克隆抗體形成免疫交聯物。本發明提供的單克隆抗體由于在重鏈和輕鏈可變區具有獨特的CDR1-3區序列，使所述抗體對炭疽桿菌具有特異的識別和結合能力。在ELISA檢測PA與單抗的結合活性 的實驗中，本發明的人源化單抗靈敏度為8ng/ml，可以用于藥物代謝研究。而鼠源單抗的靈敏度為4-8ng/ml。顯示本發明提供的抗炭疽PA抗原的單克隆抗體具有高度特異的PA結合活性。本發明提供的單克隆抗體也顯示出了優異的毒素中和活性。人源化抗體的EC5tl為O. 063ug/ml，嵌合抗體的EC5tl為O. 070ug/ml，而中國專利200610165844. 7公開的抗炭疽PA抗原的單克隆抗體5E1的EC5tl為O. 167ug/ml (EC50值越低保護效果越好)。實驗結果證明本發明的單抗較以前的5E1單抗在細胞水平顯示更好的保護效果。本發明提供的單克隆抗體還顯示了在制備炭疽治療藥物中的用途。在大鼠毒素模型上(PA+LF)抗體的保護效果評價實驗中，本發明所提供的嵌合單抗存活達到83% (5/6)，人源化單抗的存活達到80% (4/5)，而中國專利200480017547. 7所公開的人源單抗組大鼠全部死亡。該實驗顯示了本發明提供的單克隆抗體具有良好的動物保護功能，可以應用于制備炭疽治療藥物。


圖I人源化抗體重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區基因克隆的電泳鑒定圖；圖2人IgGl重鏈恒定區基因(Ch)和人Kappa輕鏈恒定區基因(Ck)克隆的電泳鑒定圖；圖3人源化抗體重鏈基因(H)和輕鏈基因(L)克隆的電泳鑒定圖；圖4pMD_H和pMD_L的酶切鑒定結果圖；圖5pMH3S的構建流程圖；圖6pMH3S_H酶切鑒定結果圖；圖7pMH3S_L酶切鑒定結果圖；圖8pMH3S_H的構建流程圖；圖9pMH3S_L的構建流程圖；圖10純化的人源化抗體的SDS-PAGE檢測結果圖；圖11單克隆抗體對PA抗原敏感性的ELISA檢測圖；圖12體外細胞毒素模型上三種類型抗體的EC5tl曲線圖；圖13大鼠毒素模型上三種類型抗體的動物存活曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明權利要求所限定的范圍構成進一步的限定。實施例I.鼠源單抗基因的克隆I. I鼠源單抗的制備以重組炭疽保護性抗原為免疫原，采用常規單克隆抗體制備方法獲得的I株高親和力、高特異性的鼠源性抗PA單抗5E11雜交瘤細胞株，分泌的抗體分子亞型為IgGl，輕鏈為Kappa亞型。I · 2單抗5E11輕重鏈基因的克隆單抗由可變區和恒定區構成，因為鼠單抗的可變區基因變異大，而恒定區的基因序列非常保守，因此采用5' -RACE方法進行克隆，其基本原理是在未知序列的5'端添加引物序列，與3'端的保守序列進行PCR擴增。獲得的鼠源單抗基因可用于構建表達載體，然后轉染哺乳動物細胞，獲得穩定表達的細胞株，最終獲得表達產物，以便與哺乳動物細胞表達的嵌合抗體和人源化抗體進行功能比較研究。操作步驟如下包括A :總RNA的提取；B RNA的去磷酸化；C :去帽子反應；D 5' -RACE適配子連接；E :反轉錄反應；F :外引物PCR反應；G :內引物反應；H :瓊脂糖凝膠電泳:切膠回收特異性PCR產物連接到T載體上進行DNA序列測定J =BLAST檢索分析序列的正確。具體參考說明書(TaKaRa，D315)。簡單描述如下A總RNA的提取取處于對數生長期的5E11雜交瘤細胞(5 X IO6)，采用Trizol —步法提取總RNA，取少量進行紫外分光光度計定量及I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。B RNA 的去磷酸化使用 CIAP (TaKaRa，D315)，反應體系 50ul，包括總 RNA2ul (lug/ul)，NRAse 抑制劑 Iul (40U/UL)，10 X 緩沖液 5ul，CIAPO. 6ul, (16U/ul)，50°C反應 I 小時。C去帽子反應CIAP處理過的RNA7ul，NRAse抑制劑Iul (40U/ul)，IOX緩沖液lul, TAPlul, (O. 5U/ul)，37°C反應 I 小時。05; -RACE適配子連接連接體系40ul，依次加入CIAP/TAP處理過的RNA5ul，51 RACE適配子(15uM) lul, NRAse的水4ul ;65°C反應5分鐘后，冰上放置2分鐘，然后依次加入 NRAse 抑制劑 lul(40U/UL)，5X 連接緩沖液 8ul，40% 的 PEG600020ul，T4RNA 連接酶lul，16°C反應I小時。E反轉錄反應反應體系包括連接后的RNA為6ul，隨機引物O. 5ul，55X緩沖液2ul, dNTPlul, NRAse 抑制劑 O. 25ul (40U/UL)，MMLVO. 25ul (200U/ul)?；靹?，3(TC IOmin,50°C 60min,5°C 5min。反應產物置于_20°C備用。F外引物PCR反應反應體系為Ex Taq聚合酶(5U/μ L) O. 25 μ L ; 10 XEx TaqBuffer5 μ L ；dNTP Mixture (各 2. 5mM)4 μ L ;模板 cDNA2. 5 μ L ；5/ RACE 外引物 2ul，特異性外引物2ul，加滅菌蒸餾水至50 μ L，混勻，瞬時離心后，置PCR儀上反應。反應條件94°C預變性3分鐘，接著940C 30s, 520C 30s, 72°C lmin，35個循環，最后72°C延伸7min。G內引物反應除模板為外引物反應液，引物使用內引物外，其余反應液體同外引物PCR反應。
H瓊脂糖凝膠電泳擴增產物H和L經瓊脂糖凝膠(1% )電泳后，切膠分離靶片段。通過凝膠純化試劑盒(BIO BASIC INC)回收純化后，凝膠電泳鑒定。I切膠回收特異性PCR產物連接到T載體上進行DNA序列測定將回收后的PCR產物連入pMD18-T載體。連接反應體系為pMD18-T載體lul，PCR產物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水Iul，連接緩沖液5ul，混勻后16°C過夜，轉化大腸桿菌DH5 α，篩選重組克隆，然后采用通用測序引物測序。獲得的質粒命名為pMD-mouse-H和pMD-mouse-L。測序后，對獲得的基因序列用Vector NTI軟件進行分析，鼠源單抗重鏈全長為1392個堿基，其中1-420位堿基編碼可變區，421-1392位堿基編碼恒定區?？勺儏^包括4個框架區(Fragment region, FR)和 3 個 CDR(Complementary determinant region, CDR),其中1-57位堿基編碼信號肽，58-129位堿基編碼FRl，133-162堿基編碼CDRl ; 163-183堿 基編碼FR2，205-261堿基編碼CDR2 ;256_357堿基編碼FR3，358-387堿基編堿基碼CDR3 ；388-420堿基編碼FR4。鼠源單抗輕鏈全長為708個堿基，包括1-384位堿基編碼可變區和385-708位堿基編碼的恒定區。對可變區進行注釋，1-66位堿基編碼信號肽，67-135位堿基編碼FR1，136-165堿基編碼CDRl ; 166-210位堿基編碼FR2，211-231位堿基編碼CDR2 ;232_327堿基編碼FR3 ; 328-354堿基編碼CDR3 ; 355-384堿基編碼FR4。實施例2.嵌合抗體基因的克隆鼠源抗體相對于人體，屬于異源蛋白應用于人體具有明顯的抗宿主抗體反應，因此常采用人源化改造的策略降低免疫原性，簡單方便的方法是進行恒定區的人源化，用人的恒定區替換鼠的恒定區，即構建嵌合抗體。2. I人恒定區的密碼子優化及全基因合成采用優化的密碼子可以提高蛋白的表達，首先采用軟件對人IgGl重鏈恒定區(GenBank登錄號Z17370)和人Kappa輕鏈恒定區基因(GenBank登錄號GI :341915149)按照鼠密碼子偏好進行優化，優化后的兩條基因序列(基因序列分別為SEQ ID N033和SEQID N035，委托博邁德進行全基因合成，并克隆到T載體上(分別命名為T-0PTI_hu-IgGl-CH和T-0PTI_hu-CKAPPA)進行序列測定。2. 2嵌合抗體基因全分子的克隆根據擴增獲得基因序列和密碼子優化后恒定區基因序列，設計引物，5Ell-VH_up 5' -GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3' ; 5E11-Vh-lower 5-/ TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3' ；0p-IgGl-up 5-/ AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3' ；0p-IgGl-down 5-/ GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3'。其中，5E1 I-Vh-UP 和 5E1 l-VH_lower 用于擴增可變區，Op-IgGl-up和Ορ-IgGl-down用于擴增人IgGl重鏈恒定區。5Ell_VH_up和Op-IgGl-down用于擴增嵌合抗體全長重鏈。輕鏈引物5EI l-VL-up 5/ -GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3' ；5E11-Vl-lower 5-' GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3' ；0p-kappa-up 5-1 ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3' ；0p-kappa-down 5-/ GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3'。其中，5E11_VL-up 和 5E11_VL-lower 用于擴增輕鏈可變區，Op-kappa-up和Op-kappa-down用于擴增人Kappa亞型輕鏈恒定區。5E11-Vl-Up和Op-kappa-down用于擴增輕鏈全長。GAATTC為Eco RI的酶切位點，GCGGCCGC為Not I的酶切位點。PCR 反應體系50μ I 反應體系中含有10Xbuffer5ul ；dNTP(O. 2mM)4ul ；Pyrobest Taq 酶 0. 25ul ;上下游引物各 O. 5ul (重鏈恒定區 Op-IgGl-up 和 Op-IgGl-down,輕鏈恒定區用Op-kappa-up和Op-kappa-down);輕重鏈可變區基因的擴增使用模板為pMD-mouse-H和pMD-mouse-L,恒定區的擴增使用模板為T-OPTI-hu-1gGI-Ch和T-0PTI-hu-CKappa，各取O. Iul質粒作為模板；用純水補足到50 μ I。PCR反應參數預變性940C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin20s ;25 循環。最后 72°C 5min。PCR產物回收純化PCR反應產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并用BBI公司的回收試劑盒回收。
嵌合抗體L、H鏈基因的擴增將5E11Vh和人IgGl亞類Ch基因的PCR擴增產物50ul進行純化，回收后備用。取純化后產物各Iul為模板，以擴增嵌合抗體重鏈基因；將5E11Vl和人KAPPA型基因的PCR擴增產物50ul進行純化，回收后備用進行嵌合抗體L鏈基因的擴增。PCR反應參數94°C預變性3min，接著擴增25個循環，每個循環包括94°C變性25s，50。。復性 25s，72。。延伸 60s，最后 72°C延伸 5min。嵌合抗體L、H鏈基因PCR產物連接到T載體上進行DNA序列測定將回收后的PCR產物連入PMD18-T載體。連接反應體系為pMD18-T載體lul，PCR產物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水Iul，連接緩沖液5ul，混勻后16°C過夜，轉化大腸桿菌DH5 α，篩選重組克隆，然后采用通用測序引物測序。獲得的質粒命名為pMD-chimeric-H和pMD-chimeric-L。實施例3.人源化單抗基因的克隆3. I人源化單抗基因設計嵌合抗體即用人的恒定區基因替換掉鼠的恒定區基因，相比鼠源抗體人源化程度達到75%。進一步人源化的方法是對可變區進行人源化?；镜牟呗允潜３只パa決定區(CDR)氨基酸系列不變，將框架區氨基酸序列依次檢索人源的抗體庫，獲得最大同源性的序列，將相應的位點進行突變。重鏈可變區的FRl，FR2 和 FR4 分別與 gb AAS85990. 1，gb ADW08153. I, emb CAK50646. I具有100%的同源性，不改變氨基酸序列。FR3與emb CAR62720. I具有88%的同源性，在4個氨基酸位置存在差異，進行定點突變。共改變4個氨基酸。輕鏈可變區的FRl與emb CAA80562. I具有74%的同源性，突變6個氨基酸。FR2與gb :ABB54406. I具有80%的同源性，有3個氨基酸的差異，改變其中的2個氨基酸，與⑶R相鄰的I個氨基酸未進行改變。FR3與gb AAQ21830. I具有84%的同源性，對差異的3個氨基酸進行突變。共進行11個氨基酸突變。3. 2抗PA單抗人源化可變區基因的化學合成設計好的可變區人源化序列委托博邁德生物技術公司人工合成全基因，并克隆到T載體上，分別命名為pMD-humanized_VH和pMD-humaniZed-Vlj,測序正確后進行后續的研究。3. 3人源化全分子基因的克隆根據人源化后的輕重鏈可變區基因序列和密碼子優化后人恒定區基因序列，設計引物，因為突變的氨基酸位于內部所以使用的引物同嵌合抗體的構建。重鏈引物5EIl-VH-up 5/ -GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3'；5Ell-VH-lower 5-/ TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG-3'；Op-IgGl-up 5-/ AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3'；Op-IgGl-down 5-/ GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3'。其中，5EII-Vh-UP和5EIl-VH_lower 用于擴增可變區，Op-IgGl-up 和 Op-IgGl-down用于擴增人IgGl重鏈恒定區,5EIl-VH-up和Op-IgGl-down用于擴增嵌合抗體全長重鏈。
輕鏈引物5EIl-VL-up 5/ -GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3;；5Ell-VL-lower 5- ' GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTCCCC-3/ ；Op-kappa-up :5-' ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3'；Op-kappa-down 5-/ GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3'。其φ, 5EIl-VL-up 和 5Ε1 l-VL-lower 用于擴增輕鏈可變區，Op-kappa-up 和Op-kappa-down用于擴增人Kappa亞型輕鏈恒定區，5Ell-VL-up和Op-kappa-down用于擴增輕鏈全長。GAATTC為ECo RI的酶切位點，GCGGCCGC為Not I的酶切位點。50 μ I PCR 反應體系含有10Xbuffer5ul ;dNTP(0. 2mM)4ul ;PyrobestTaq 酶0. 25ul ;上下游引物各0. 5ul (重鏈恒定區Op-IgGl-up和Op-IgGl-down,輕鏈恒定區用Op-kappa-up和Op-kappa-down);輕重鏈可變區基因的擴增使用模板為pMD-mouse-H和 pMD-mouse-L，恒定區的擴增使用模板為 T-OPTI_hu_IgGI-Ch 和 T-0PTI_hu-CKAPPA，各取
O.Iul質粒作為模板；用純水補足到50 μ I。PCR反應參數預變性94°C 5min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C lmin20s ；25 循環。最后 72°C 5min。PCR產物回收純化PCR反應產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并用BBI公司的回收試劑盒回收。電泳結果見(見附圖1，圖2)。圖I中M泳道為分子量標記，I泳道和2泳道分別為人源化的Vh和人源化的Vk片段。圖2中，M泳道為分子量標記，I泳道和2泳道分別SCi^PCk片段。人源化抗體L、H鏈基因的擴增將5E11Vh和人IgGl亞類Ch基因的PCR擴增產物50ul進行純化，回收后備用。取純化后產物各Iul為模板，以擴增人源化抗體重鏈基因；將5E11Vl和人KAPPA型基因的PCR擴增產物50ul進行純化，回收后備用進行人源化抗體L鏈基因的擴增。PCR反應參數94°C預變性3min，接著擴增25個循環，每個循環包括94°C變性25s，50°C復性25s，72°C延伸60s，最后72°C延伸5min。PCR電泳結果(見附圖3)。圖3中，M泳道為分子量標記，I泳道和2泳道分別為人源化的L和人源化的H片段。人源化抗體L、H鏈基因PCR產物連接到T載體上進行DNA序列測定將回收后的PCR產物連入pMD18-T載體。連接反應體系為pMD18-T載體lul，PCR產物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水lul，連接緩沖液5ul，混勻后16°C過夜，轉化大腸桿菌DH5 α ,篩選重組克隆,然后采用通用測序引物測序。獲得的質粒命名為pMD-humanized-H和pMD-humanized-L。酶切鑒定結果見圖4，M泳道為分子量標記，I泳道和2泳道分別為pMD-humanized-H單酶切(Not I)和雙酶切(EcoRI/Not I) ;3泳道和4泳道分別為pMD-humanized-L 單酶切(Not I)和雙酶切(Eco RI/Not I)。實施例4.鼠單抗，人-鼠嵌合抗體和人源化抗體基因表達質粒的構建4. I構建策略不管是輕鏈還是重鏈，在5'端設計引物時引入Eco R I的酶切位點，在3'端引ANot I酶切位點，克隆到pMD-T載體上，經過DNA序列測定正確后，用Eco R I/Not I酶切 pMD-mouse-H(pMD-Chimeric-H 或 pMD-humanized-H)得到約 I. 4kb 的片段，亞克隆到PMH3S的相應位點，得到鼠源抗體的重鏈表達質粒pMH3S-mouSe-H(嵌合抗體重鏈表達質粒pMH3S-Chimeric-H或人源化抗體的重鏈表達質粒pMH3S-humanized_H)；同樣的方法,用EcoRI/Notl 酶切 pMD-mouse-L (pMD-Chimeric-L 或 pMD-humanized-L)得到約 O. 7 片段，亞克隆到pMH3S的相應位點，得到鼠源抗體輕鏈的表達質粒pMH3S-mouse-L (嵌合抗體輕鏈的表達質粒pMH3S-Chimeric-L或人源化抗體輕鏈的表達質粒pMH3S-humanized_L)。4. 2pMH3S分泌型真核表達載體的構建以常用的真核表達載體pcDNA3. 1(+) (Invitrogen公司，產品目錄號V790-20)為基本骨架，將Kozak序列(GCCGCCACCATGA/G)和修改后的人組織纖溶酶原信號肽序列融合基因(見SEQ ID N03)克隆到表達載體的多克隆位點區，構建成pMH3S分泌型真核表達載體。修改后的基因中，通過將融合基因核苷酸序列5'端第70-78位的TCGAACAGC(編碼氨基酸S-N-S)，突變成TCGAATTCT (編碼氨基酸S-N-S)，在保證氨基酸序列不改變的前提下引AEco RI的酶切位點(GAATTC)方便目的基因直接通過Eco RI位點連接到pMH3S載體上，信號肽與目的基因之間沒有多余的氨基酸，目的蛋白可以分泌到上清中，方便下游的純化。構建過程I)首先人工合成Kozak序列(CCACCATG (A/G))和修改后的人組織纖溶酶原信號肽序列的融合基因；2)將 PCDNA3. I (+)用 EcoRI 酶切后，用 Klenow 酶(TaKaRa，產品目錄號D2140)補平，然后用小腸堿性磷酸酶CIP (NEB公司，產品目錄號M0290V)去磷酸化避免自連；3)將合成的基因和酶切后的載體用T4DNA連接酶(NEB公司，產品目錄號M0202V)進行連接；4)轉化大腸桿菌DH5a感受態，挑選具有氨芐青霉素抗性的克隆；5)用OMEGA質粒提取試劑盒提取質粒，并進行DNA序列測定，測序鑒定后獲得預期的pMH3S載體(pMH3S的構建流程見圖5。)4. 3重鏈表達質粒的構建用EcoRI 和 NotI(NEB 公司)雙酶切 pMD-mouse-H(pMD-chimereic_H 或pMD-humanized-H),用膠回收試劑盒(中國,BBI公司)回收H片段(長度約I. 4kb)連接到用EcoRI和Not I雙酶切的pMH3S上，轉化大腸桿菌DH5 α感受態，在100 μ g/ml的氨芐青霉素LB平板上培養，挑選抗性克隆進行PCR檢測(PCR條件同實施例I中的步驟(3))，PCR產物電泳檢測陽性后，隨機挑選陽性克隆接種到LB培養基中培養過夜，次日用質粒提取試劑盒(中國，OMEGA公司)提取質粒，對提取的質粒進行雙酶切(EcoRI/Not I)鑒定，鑒定結果見圖6。圖6中，M泳道為分子量標記，I泳道為質粒PMH3S-H用Not I進行單酶切線性化后的結果，2泳道為EcoRI/Notl雙酶切后的結果。表達載體構建流程見圖8。
4. 4pMH3S-L 質粒的構建用EcoRI 和 Not I(NEB 公司)酶切 pMD-mouse-L(pMD-chimereic-L 或pMD-humanized-L),用膠回收試劑盒(中國,BBI公司)回收L片段(長度約O. 7kb)連接到用EcoRI和Not I雙酶切的pMH3S上，轉化大腸桿菌DH5 α感受態，在100 μ g/ml的氨芐青霉素LB平板上培養，挑選抗性克隆進行PCR檢測(PCR條件同實施例I中的步驟(3))，PCR產物電泳檢測陽性后，隨機挑選陽性克隆接種到LB培養基中培養過夜，次日用質粒提取試劑盒(中國，OMEGA公司)提取質粒，對提取的質粒進行雙酶切(Eco RI/Not I)鑒定，鑒定結果見圖7。圖7中，M泳道為分子量標記，I泳道為質粒pMH3S-L用NotI進行單酶切后線性化后的結果，2泳道為EcoRI/Not I雙酶切后的結果。表達載體構建流程見圖9。實施例5.電轉及細胞克隆的篩選從液氮中取CHO-S細胞復蘇，在T25方瓶中培養，培養基為DMEM/F12+10% FBS,置于37 °C、5% CO2細胞培養箱(Forma)中培養，長滿后傳入T75方瓶中。在T75方瓶 中長滿后，加入3ml胰酶消化30s，吸棄胰酶，用PBS洗細胞兩次離心后，取I. 5 X IO7細胞用0.5ml PBS (pH7. 2)重懸，取10 μ I鮭精，線性化的表達質粒IOyg(輕鏈質粒pMH3S-humanized-L3. 3 μ g 和的重鏈質粒 pMH3S-humanized_H6. 7 μ g 二者比例為 1:2)，加入到準備好的細胞當中，混勻后加入到預冷的2mm電轉杯中冰浴，用電轉儀160V電擊。電轉后的細胞分成兩份置于直徑IOcm的塑料培養皿中，分別加入IOml的含有10% FBS、無雙抗的DMEM/F12培養基。置于37°C、5 % CO2細胞培養箱中培養。次日換新鮮的IOml的含有10% FBS、無雙抗的DMEM/F12培養基。待細胞長至50 60%滿時，加入
I.8mg/ml的G418,隔天換液,洗掉死細胞,G418濃度始終維持在I. 8mg/ml,直至細胞不再死亡，克隆形成。將形成的克隆轉移至96孔板中，用含有10% FBS、無雙抗的DMEM/F12培養基，G418濃度為O. 6mg/ml，置于37°C、5% CO2細胞培養箱中培養。檢測表達量，篩選高表達的細胞克隆。實施例6.發酵和純化從液氮中取出5Ell-hu_lF3工程細胞復蘇，在T25方瓶中培養，培養基為DMEM/F12+10% FBS，長滿后傳入T75方瓶中，置于5% CO2細胞培養箱(Forma)中懸浮培養。在T75方瓶中長滿后，用胰酶消化，換自制懸浮培養基重懸，開始懸浮培養，每天監測細胞密度及狀態，根據細胞密度及狀態補加培養基，不斷增加培養體積。當培養體積達到30ml時，將其轉入150ml搖瓶中，搖瓶置于37°C的培養箱內，轉動速度為lOOrpm。繼續增加培養體積，使細胞密度維持在2-3 X 106/ml。當培養體積達到150ml時，將其轉入3L搖瓶中，搖瓶置于37°C的培養箱內，轉動速度為lOOrpm。繼續增加培養體積，使細胞密度維持在 2-4 XlOVml ο當培養體積達到4L，將其轉入10L的Wave反應器中。溫度控制在36. 5°C，10L的Wave反應器的搖速為10轉/分。當Wave反應器中的培養體積達到7L，不再補加細胞基礎培養液，根據葡萄糖消耗情況，細胞采用流加(Fed-batch)方式培養，每日添加濃縮培養基，根據PH值情況隨時補充Na2CO3,使pH值維持在7. 2左右，并將溫度降低至34°C，使細胞能夠持續高密度生長。發酵完畢，使用Mab select sure介質進行純化,裝填的層析柱體積為40ml，結合容量為30 50mg/ml。平衡緩沖液20mM PBS, pH7. 2 ;洗滌緩沖液0. IM檸檬酸緩沖液PH4. 6 ;洗脫緩沖液0. IM檸檬酸緩沖液pH3. 8和0. IM檸檬酸緩沖液pH3. 6 ;再生緩沖液O. IM檸檬酸緩沖液PH3. O。純化的5E11-人源化進行非還原SDS-PAGE檢測見圖10，泳道M顯示低分子量蛋白標準，泳道I顯示純化后的人源化單抗，分子量與預期相符。實施例7. ELISA檢測PA與單抗的結合活性重組PA稀釋成2 μ g/ml，IOOul/孔包被酶聯板，4°C過夜，次日用封閉液(20mM PB，O. 15M NaCl，5%的奶粉)37°C封閉Ih后洗板，加入樣品后37°C孵育Ih洗板，加入I :1000稀釋的HRP標記的羊抗人Fe (Sigma, A0170)(或HRP標記的羊抗鼠,用于檢測鼠單抗，Sigma,A3673)，37°C孵育Ih后洗板，OPD顯色，酶標儀測OD45tl。ELISA結果比較檢測的靈敏度比較見圖11 :5E1-人源化大于lug/ml (即使濃度為lug/ml時,不能顯示是陽性結果,OD45tl值不 能達到陰性對照的2. I倍，圖11未顯示)，不能用于藥物代謝動力學研究；5E11-人源化單抗靈敏度為4_8ng/ml，可以用于藥物代謝研究。5E11-鼠源單抗的靈敏度為4_8ng/ml。實施例8.體外細胞保護試驗檢測抗體對致死毒素的中和活性J774A. I細胞以105/ml接種于96孔細胞培養板，37°C過夜培養。將用培養液梯度稀釋的待檢抗體與100ng/mL PA和100ng/ml LF—起于37°C孵育lh，細胞長至90%滿時吸棄原細胞培養孔中培養液，將孵育Ih后的待測液體加入細胞培養孔中，100 μ I/孔，37°C孵育3h，加入20 μ I MTT (5mg/mL)，37°C孵育30min,吸棄上清，每孔加入100 μ I鹽酸異丙醇，振蕩至沉淀溶解。將無毒素對照孔記為細胞100%存活，無抗體對照孔(rPA和rLF濃度均為100ng/ml)記為細胞全部死亡。通過酶聯儀測OD57c!,結果通過GraphPad Prism軟件來測定 EC5tl(50% effective concentration 半數有效濃度)。結果見圖12，對比中國專利200610165844. 7公開的人源化單抗5E1，本發明公開的鼠源單抗5E11，嵌合的5E11和人源化5E11進行毒素中和活性的EC5tl進行評價。不同單抗的EC5tl如下，值越低保護效果越好。5E1-人源化0. 167ug/ml ;5E11-嵌合0. 070ug/ml ；5E11-人源化0. 063ug/ml。結論5E11單抗較以前的5E1單抗在細胞水平顯示更好的保護效果。實施例9.大鼠毒素模型上(PA+LF)抗體的保護效果評價使用體重200 250克的雄性Fisher344大鼠，其中5E11-嵌合單抗組6只大鼠，5E11-人源化和5E8-人源單抗組每組5只大鼠，攻毒劑量為40 μ gPA+10 μ gLF/大鼠，先尾靜脈注射毒素(注射用生理鹽水定容到300 μ I);攻毒后5分鐘尾靜脈注射5Ε11-嵌合單抗，5Ε11-人源化單抗和5Ε8-人源單抗，單抗的劑量為320ug (注射用生理鹽水定容到300 μ I)，觀察大鼠存活情況。結果見圖13，5Ε11_嵌合單抗組的存活率為83% (5/6)，5Ε11-人源化單抗的存活達到80% (4/5)，而5Ε8-人源單抗組大鼠全部死亡。該實驗顯示了本發明提供的單克隆抗體具有良好的動物保護功能，可以應用于制備炭疽治療藥物。
權利要求
1.一種抗炭疽PA抗原的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區的氨基酸序列如SEQ ID NO 2第45_54、69_87、120-129位氨基酸序列所示；輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區的氨基酸序列如SEQ ID N018第46_55、71_77、110-118位氨基酸序列所示。
2.根據權利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體重鏈可變區的FR1-FR4區氨基酸序列分別如SEQ ID N04、6、8、10所示，重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ IDN034所示；輕鏈可變區的FR1-FR4區氨基酸序列分別如SEQ ID N020、22、24、26所示，輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。
3.根據權利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體重鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N02第1-140位氨基酸序列所示，重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID N034所示；輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N018第1-128位氨基酸序列所示，輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ ID N036所示。
4.根據權利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體重鏈全長氨基酸序列如SEQ ID N02所示,輕鏈全長氨基酸序列如SEQ ID N018所示。
5.一種編碼權利要求2所述單克隆抗體重鏈或輕鏈的核酸，其特征在于，所述重鏈的可變區的CDRU CDR2和CDR3區的堿基編碼序列分別如SEQ ID NOl第133-162、184-255、358-387位核苷酸所示，FR1-FR4區堿基序列分別如SEQ ID N03、5、7、9所示，重鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述輕鏈的可變區的⑶R1、⑶R2和⑶R3區的堿基編碼序列如SEQ ID N03第136-165、211-231、328-354所示，FR1-FR4區堿基序列分別如SEQID N019、21、23、25所示，輕鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N035所示。
6.一種編碼權利要求3所述單克隆抗體重鏈或輕鏈的核酸，其特征在于，所述重鏈可變區的堿基編碼序列如SEQ ID NOl第1-420位核苷酸所示，重鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N033所示；所述輕鏈可變區的堿基編碼序列如SEQ ID N03第1-384位核苷酸所示，輕鏈恒定區的堿基編碼序列如SEQ ID N035所示。
7.一種編碼權利要求4所述單克隆抗體重鏈或輕鏈的核酸，其特征在于，所述重鏈的核苷酸編碼序列如SEQ ID NOl所示，所述輕鏈的核苷酸編碼序列如SEQ ID N017所示。
8.一種含有權利要求5-7所述編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的核苷酸編碼的表達載體。
9.根據權利要求8所述的表達載體，其特征在于，所述載體為PMH3S分泌型真核表達載體。
10.一種含有權利要求9所述表達載體的宿主細胞。
11.根據權利要求10所述的宿主細胞，其特征在于，所述細胞為CHO-S細包。
12.權利要求1-4中任一所述的單克隆抗體在制備炭疽治療藥物中的應用。
13.一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有權利要求1-4中任一所述的單克隆抗體，以及可藥用的載體。
14.一種含有權利要求1-4中任一所述的單克隆抗體的免疫交聯物，其特征在于，所述單克隆抗體與效應分子連接。
全文摘要
本發明公開了一種具有人源化、嵌合和鼠源化形式的抗炭疽PA抗原的單克隆抗體，以及所述抗體在制備炭疽治療藥物中的應用。本發明公開的抗體具有特異的抗原結合性、優異的毒素中和活性以及良好的動物保護功能。
文檔編號C12N15/63GK102936286SQ20121036184
公開日2013年2月20日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者陳薇, 李建民, 李冰, 張金龍, 侯利華, 宋小紅, 于婷, 徐俊杰, 付玲, 張軍, 劉樹玲, 任軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所