鑒定h9亞型禽流感病毒的pcr引物對及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用。本發明所提供的PCR引物對由兩條單鏈DNA組成，所述兩條單鏈DNA是序列表中SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2所示的單鏈DNA。可對樣品中H9亞型AIV的HA基因進行特異性擴增，目的片斷長度為425bp。該方法對H3、H4、H5等其它亞型AIV以及新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒等無交叉反應；對病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100μL；與病毒的血凝抑制試驗等常規方法相比，鑒定結果符合率為100％。為H9亞型AIV的鑒定提供了一種快速、特異、敏感的檢測手段，可用于H9亞型AIV引起疾病的快速診斷，在臨床診斷和流行病學調查方面具有較好的應用前景。
【專利說明】鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用。
【背景技術】
[0002]H9亞型禽流感病毒是一種低致病性的流感病毒，1994年H9N2亞型AIV在我國廣東被首次分離，十幾年來，H9亞型禽流感在我國呈上升趨勢，特別是在并發或繼發細菌感染時，可造成嚴重的經濟損失。目前H9亞型AIV在我國廣泛存在，是影響我國養禽業的主要AIV亞型。嚴重影響我國養禽業的發展。H9亞型AIV除了感染禽類以外，還可使人受到感染。因此,建立一種針對H9亞型禽流感病毒的的檢測方法，既可以對H9亞型禽流感病毒快速、準確地鑒定，又可以用于H9亞型禽流感病毒的流行病學調查。
[0003]傳統的血凝抑制試驗(HI)對H9亞型AIV的鑒定需要多種亞型的血清和抗原，費時費力，不能及時做出診斷或對病毒進行鑒定。目前還沒有針對H9亞型流感病毒進行檢測的實用的分子生物學方法。本發明所提供的PCR引物對可用于H9亞型AIV引起疾病的快速診斷，在臨床診斷和流行病學調查方面具有較好的應用前景。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用。
[0005]本發明所提供的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條單鏈DNA是序列表中SEQ ID NO:USEQ ID NO:2 所示的單鏈 DNA。
[0006]本發明所提供的PCR引物對，可用于制備鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒試劑或試劑盒，或用于制備診斷或輔助診斷H9亞型禽流感病毒試劑或試劑盒。
[0007]含有所述的PCR引物對的試劑或試劑盒均屬于本發明的保護范圍。
[0008]所述的PCR引物對的制備方法也屬于本發明的保護范圍。該制備方法具體可包括將所述的PCR引物對中的兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0009]所述鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍。該制備方法具體包括如下步驟:將所述的PCR引物對中所述的兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種物質包裝在同一試劑盒內:DNA聚合酶和4種dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)。
[0010]本發明所提 供的引物對的應用中PCR反應體系及最佳循環條件也屬于本發明的保護范圍。
[0011]本發明所提供的PCR引物對可用于檢測H9亞型禽流感病毒。
[0012]本發明所提供的PCR引物對可用于檢測不同來源的H9亞型禽流感病毒，尤其適合檢測雞源的H9亞型禽流感病毒。
[0013]本發明所提供的PCR引物對用于檢測H9亞型禽流感病毒特異性強，靈敏度可達1Χ104.25EID050/100μL。與病毒的血凝抑制試驗等常規方法相比，鑒定結果符合率為100%。為Η9亞型AIV的鑒定提供了一種快速、特異、敏感的檢測手段，可用于Η9亞型AIV引起疾病的快速診斷，在臨床診斷和流行病學調查方面具有較好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為 本發明引物對H9亞型AIV RT-PCR擴增結果。其中，M為Trans DNA MarkerI ；I為H9N2亞型禽流感病毒，2為空白對照。
[0015]圖2為本發明引物對H9亞型AIV RT-PCR的特異性。其中，M:Trans DNA MarkerI ；I:H9N2亞型禽流感病毒；2:雞新城疫病毒；3:H3N8亞型禽流感病毒；4:H4N6亞型禽流感病毒；5:H5N1亞型禽流感病毒；6:雞傳染性喉氣管炎病毒；7:雞傳染性支氣管炎病毒；8:雞傳染性法氏囊炎病毒。
[0016]圖3為本發明引物對H9亞型AIV RT-PCR的靈敏度試驗。M =Trans DNAMarkerI ； 1-5:分別為10°、10-1、10_2、10' 10_4稀釋度的H9亞型禽流感病毒的樣品，病毒含量依次為 1 X 107 25EID50/100y L、1 X 106 25EID50/100y L、1 X 105 25EID50/100y L、1X104 25EID50/100y LUX103 25EID50/100y L0
[0017]圖4為本發明所提供引物的應用。M =Trans DNA Marker I ;1_10為中國農業大學動物流感研究室分離鑒定的H9N2亞型AIV。11-18為H9N2亞型AIV病雞組織接種雞胚所得的尿囊液。
【具體實施方式】
[0018]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。
[0019]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明均可從商業途徑得到。
[0020]下述實施例中所用的毒株均由中國農業大學動物流感研究室保存提供。
[0021]實施例1、引物的設計、合成與篩選
[0022]根據H9N2亞型禽流感病毒的HA基因的序列，通過DNAman軟件進行比對，找出HA基因的保守區，針對HA基因的保守區序列設計特異性引物，并在Genbank上進行BLAST檢測比對分析，用01igo4.0軟件分析上下游引物是否匹配，將分析合格的引物送上海生工生物技術有限責任公司北京合成部合成。合成了針對HA基因的5對引物，用本實驗室分離保存的H9N2亞型AIV進行篩選，根據擴增效率確定引物對。確定上游引物 H9-F:5 ' -TGTGGCAACTGAAGAAAT-3 ' (SEQ ID NO:1);下游引物 H9-R:5' -ACCAACCTCCCTCTATGA-3 ' (SEQ ID NO:2);退火溫度為 53 °C。目的片斷的長度為425bp0
[0023]實施例2、RT-PCR方法的建立
[0024]1、總RNA的提取
[0025]I)取感染H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的雞胚尿囊液300 μ L于無RNA酶的1.5mL離心管中，加入900 μ L Trizol試劑(Invitrogen),兩者比例為1: 3，輕輕顛倒混勻10次，使核蛋白復合體完全溶解；
[0026]2)加入200 μ L三氯甲烷(氯仿)，顛倒混勻10次，冰浴放置5分鐘，期間輕輕顛倒混勻-AV 12000rpm 離心 15min。
[0027]3)將水相(約700 μ L)移至一個新的無RNA酶1.5mL離心管中，加入等量異丙醇，顛倒混勻數次，_20°C放置10分鐘后，4°C 12000rpm離心15分鐘，棄去上清；[0028]4)用lmL75%無RNA酶冰乙醇洗滌，瞬時離心，棄上清，注意別把沉淀的RNA倒掉，用黃槍頭吸干，瞬時離心，再用白槍頭吸干，置冰上干燥沉淀5~lOmin，使乙醇揮發；
[0029]5)將干燥的RNA用11 μ L DEPC水溶解，即用或_80°C保存備用。
[0030]2、反轉錄合成cDNA
[0031]用反轉錄試劑盒(K1622, Fermentas)將步驟I獲得的總RNA樣品進行反轉錄,得到 cDNAo
[0032]I)將 Oligo 引物(20pmol/y L) I μ L 加到含 RNA 的 11 μ L DEPC 水中，瞬時離心，65°C水浴5min后，置于冰上5min，使RNA線性化。
[0033]2)反轉錄體系 20yL:01igo 引物(20pmol/μ L) I μ L ;總 RNAlly L ;Reaction(5X)4y L ； IOmMdNTP Μ?χ2μ L ；Ribolock?Rnase Inhibitor (20U/μ L) I μ L ；Revert Aid? M-MuLVReverse Transcriptase(200U/μ L)I μ L。
[0034]3)步驟I)完成后，依次加入反轉錄體系中的其余4種成分，混勻，瞬時離心。
反應條件:37°C水浴lh，65°C 5min，4°C保存。
[0035]3、RT-PCR條件的優化
[0036]采用總體積為25 μ L的反應體系:2XPCR MIX buffer (北京全式金生物技術有限公司，其成分為Easy Taq RNA聚合酶、dNTPS及反應緩沖液)12.5 μ L ;濃度為20pmol/ μ L序列表 SEQ ID NO:1 引物 I μ L ;濃度為 20pmol/y L 序列表 SEQ ID NO:2 引物 I μ L ；ddH20補足至25 μ L0
[0037]對雙重RT-PCR的變性、退火、延伸溫度和時間、循環次數等進行優化。
[0038]雙重RT-PCR最佳循環條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53 °C退火35s，72°C延伸35s，從第二步開始進行34個循環，然后72°C延伸IOmin。
[0039]4、電泳
[0040]取PCR產物5 μ L用1.5 %的瓊脂糖凝膠進行電泳。結果見圖1，Η9Ν2亞型禽流感病毒擴增出425bp的目的條帶，與預期產物大小相符。
[0041]5、PCR產物測序
[0042]將PCR產物進行回收，送北京華大基因科技股份有限公司進行序列測定。
[0043]將HA基因擴增片段測序結果在NCBI流感數據庫中進行BLAST，HA基因序列與A/Chicken/Shandong/Al/2009(H9N2)、A/Chicken/Zhejiang/611/2011 (H9N2)等毒株的第 4個片段HA基因的同源性為99%。
[0044]實施例3、PCR引物對的特異性試驗
[0045]1、總RNA的提取
[0046]分別對一株H9N2亞型禽流感病毒、一株H3N8亞型禽流感病毒、一株H4N6亞型禽流感病毒、一株H5N1亞型禽流感病毒、一株雞傳染性法氏囊炎病毒、一株雞新城疫病毒、一株雞傳染性支氣管炎病毒、一株雞傳染性喉氣管炎病毒的雞胚尿囊液提取總RNA，方法同實施例2。
[0047]2、反轉錄合成cDNA
[0048]用反轉錄試劑盒(K1622, Fermentas)分別將步驟I獲得的總RNA樣品進行反轉錄，得到cDNA。
[0049]反應體系、反應條件及方法同實施例2。[0050]3、PCR擴增檢測RT-PCR方法的特異性
[0051]以實施例1中所確定的引物對為引物，對步驟2得到的cDNA樣品進行PCR擴增。
[0052]反應體系同實施例2。
[0053]反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，53°C退火35s，72°C延伸35s，從第二步開始進行34個循環，然后72°C延伸lOmin。
[0054]電泳。分別取PCR產物5 μ L用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳。結果見圖2，Η9Ν2亞型禽流感病毒擴增出425bp的目的條帶。而雞新城疫病毒、H3N8亞型禽流感病毒、H4N6亞型禽流感病毒、H5N1亞型禽流感病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊炎病毒的尿囊液樣品均無PCR目的條帶。結果表明，本發明所提供的引物對H9亞型禽流感病毒進行RT-PCR檢測具有很強的特異性，可以特異性地檢出H9亞型禽流感病毒。
[0055]實施例4、PCR引物對的靈敏度檢測
[0056]1、H9N2亞型AIV病毒含量的測定
[0057]取感染H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液，采用Reed-Muench法進行病毒EID5tl的測定,獲得該病毒在雞胚尿囊液中的含毒量。其病毒含量為 1X107 25EID50/100y L0
[0058]2、不同稀釋度尿囊液的制備
[0059]對上述病毒尿囊`液進行ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4等不同稀釋度稀釋，得到病毒含量分別為 1 X 107 25EID50/100y L、1 X 106 25EIDS0/100y L、1 X 105 25EID50/100y L、1X104 25EID50/100y LUX103 25EID50/100y L 的樣品。
[0060]3、不同稀釋度尿囊液的總RNA提取
[0061]方法同實施例2。
[0062]4、反轉錄合成cDNA
[0063]反應體系、反應條件及方法同實施例2。
[0064]5、PCR擴增檢測RT-PCR方法的靈敏度
[0065]反應體系同實施例2。反應條件同實施例3。
[0066]電泳。分別取PCR產物5yL用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳。結果見圖3，在10_3稀釋時仍然可以擴增出明顯的目的條帶，該方法對病毒尿囊液的最低檢出量為I X 104 25EID50/100 μ L，靈敏度較高，敏感性較強。
[0067]實施例5、PCR引物對的應用
[0068]1、樣品的采集與處理
[0069]取經常規方法鑒定的H9N2亞型禽流感病毒感染雞的組織樣品8份，稱量，放滅菌的組織研磨器研磨成勻漿，加入含雙抗的PBS制成10%-20% (W/V)的懸液。轉入滅菌離心管中，經4°C 12000r/min離心lOmin，取上清液接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，收集24_96h死亡及未死亡的雞胚尿囊液。
[0070]2、總RNA的提取
[0071]對10株H9亞型禽流感病毒感染的尿囊液以及步驟I得到的8個樣品分別提取總RNA，方法同實施例2。
[0072]3、反轉錄合成cDNA[0073]反應體系、反應條件及方法同實施例2。
[0074]4、PCR 擴增
[0075]反應體系同實施例2。反應條件同實施例3
[0076] 電泳。分別取PCR產物5yL用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳。結果見圖4。10株H9亞型禽流感病毒及8個病雞組織的雞胚尿囊液樣品均擴增出了目的條帶，大小與預期相符，鑒定結果與血凝抑制試驗等常規方法相比，符合率為100%。
【權利要求】
1.一種鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，其特征在于:所述兩條單鏈DNA是序列表中SEQ ID NO:USEQ ID NO:2所示的單鏈DNA。
2.一種如權利要求1所述的PCR引物對在制備鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用。
3. —種如權利要求1所述的PCR引物對在制備診斷或輔助診斷H9亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用。
4.一種鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR試劑，其特征在于:所述PCR試劑中含有如權利要求1所述的PCR引物對。
5.一種鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中含有如權利要求4所述的PCR試劑。
6.—種如權利要求1所述的PCR引物對的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括將權利要求1所述的PCR引物對中所述的兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
7.—種如權利要求5所述的試劑盒的制備方法，包括如下步驟:將權利要求1所述的PCR引物對中所述的兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種物質包裝在同一試劑盒內=DNA聚合酶和下述4種dNTP:dATP, dTTP，dCTP，dGTP。
【文檔編號】C12N15/11GK103667519SQ201210361526
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2012年9月14日
【發明者】司振書, 劉金華, 蒲娟, 包靜楠 申請人:聊城大學