一種利用木質(zhì)纖維素原料高溫同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的新工藝的制作方法
【專利摘要】乙醇是一種潔凈、可再生、生產(chǎn)過程不凈排放碳的交通燃料，是目前使用量最大的生物運輸燃料。本發(fā)明涉及一種利用木質(zhì)纖維素原料在高溫高固形物含量情況下同步酶解糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇工藝。木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過預(yù)處理之后，利用纖維素酶和耐溫釀酒酵母(TIB-S.C?Y01)進(jìn)行高溫同步糖化發(fā)酵，通過合理分批補料提高底物濃度，提高乙醇產(chǎn)量，使其達(dá)到經(jīng)濟的蒸餾濃度。實驗利用不同原料進(jìn)行高溫同步糖化發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量在5-10％(v/v)。利用耐溫釀酒酵母進(jìn)行高溫同步糖化發(fā)酵，為木質(zhì)纖維素原料高溫同步糖化發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】—種利用木質(zhì)纖維素原料高溫同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的新工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)生產(chǎn)乙醇生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種利用木質(zhì)纖維素原料在高溫、高固形物含量底物條件下的同步酶解糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)今傳統(tǒng)化石能源的供給日益緊張，以及人類對使用傳統(tǒng)化石能源所造成的嚴(yán)重環(huán)境污染有了充分認(rèn)識的情況下，纖維質(zhì)燃料乙醇作為一種新型的、可再生清潔能源越來越受到世人的重視。中國是一個農(nóng)業(yè)大國，各類農(nóng)作物纖維資源十分豐富，僅秸桿一項就達(dá)7.0X10nkg以上，其中玉米秸桿約2.2X10nkg，這些資源長期沒有得到合理的開發(fā)利用。如果將它們轉(zhuǎn)化成氣體或液體燃料，這樣不但緩解人類所面臨的資源危機，食物短缺，環(huán)境污染等一系列問題，也為人類持續(xù)發(fā)展提供了保證。
[0003]目前，國內(nèi)多數(shù)的燃料乙醇生產(chǎn)線，主要采用分步糖化發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，進(jìn)行燃料乙醇的生產(chǎn)。然而與分步糖化發(fā)酵相比，同步糖化發(fā)酵有很多優(yōu)點:1)可以促進(jìn)反應(yīng)動力學(xué)過程，減少酶解產(chǎn)物對酶的反饋抑制；2)葡萄糖生成與消耗幾乎同時進(jìn)行，增加了發(fā)酵產(chǎn)率；3)糖化與發(fā)酵在一個反應(yīng)器中進(jìn)行，減少了設(shè)備投資；4)由于同時糖化發(fā)酵可以縮短反應(yīng)時間等。1977年，Takgt首次報道了同步糖化發(fā)酵法。他將里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶和釀酒酵母放在一個容器里，創(chuàng)造了邊糖化邊發(fā)酵的所謂同步糖化發(fā)酵法(simultaneoussaccharification and fermentation, SSF),俗稱一步法。在同一容器中，加入纖維素材料、纖維素酶和酵母等乙醇生產(chǎn)菌，使纖維素糖化產(chǎn)生的葡萄糖、纖維二糖和各種寡糖分子在第一時間被發(fā)酵成乙醇。SSF法中常用的微生物是霉菌和釀酒酵母，主要特點是纖維素的糖化和糖的發(fā)酵在同一裝置內(nèi)同時進(jìn)行。
[0004]由于糖化和發(fā)酵可在同一反應(yīng)器里進(jìn)行，SSF節(jié)省了設(shè)備投資，反應(yīng)時間可縮短一半，大幅度減少了纖維素的酶解成本。與纖維素糖化和乙醇發(fā)酵相繼進(jìn)行的兩步法相比，SSF過程中，水解終產(chǎn)物一葡萄糖不斷被`乙醇生產(chǎn)菌利用，生成與消失幾乎同步，消除了葡萄糖濃度的增加對纖維素酶的反饋抑制作用，增加了乙醇的發(fā)酵產(chǎn)率。乙醇的存在和PH值降低使發(fā)酵過程污染雜菌的可能性減少。而葡萄糖苷酶及時降解反饋抑制纖維素酶活的纖維二糖，減輕了酶解中間產(chǎn)物對酶活性發(fā)揮的抑制，促進(jìn)了酶促反應(yīng)的動力學(xué)過程。
[0005]同步糖化發(fā)酵雖然被認(rèn)為是纖維素乙醇轉(zhuǎn)化最有效的途徑，可以使抑制纖維素酶的水解產(chǎn)物——葡萄糖和纖維二糖的積累降到最低。但常用作工業(yè)生產(chǎn)的纖維素酶生產(chǎn)菌的β -葡萄糖苷酶在酶系中含量相對較低，而發(fā)酵體系中水解的中間產(chǎn)物一纖維二糖只能通過β_葡萄糖苷酶來降解，因此發(fā)酵液中的纖維二糖不能得到完全的降解。作為纖維素酶的競爭性抑制物，纖維二糖的利用或減少就成為提高酶解效率的重要環(huán)節(jié)。
[0006]同步糖化發(fā)酵的效率通常以乙醇產(chǎn)量來表示。由于發(fā)酵中存在多種影響因素，乙醇濃度受到多方面的影響。其中，發(fā)酵溫度、底物濃度和酶液濃度是影響較大的因素。纖維素酶解與酵母糖化同時進(jìn)行，最為突出的是兩者的溫度不協(xié)調(diào)。在SSF過程中，表現(xiàn)纖維素酶的最佳溫度為45~50°C，而乙醇發(fā)酵的最佳溫度為20~40°C。折衷兩者的最佳溫度得到的溫度既不最適合發(fā)酵、也不最適合水解。美國可再生能量研究所的1.Ballesteros等人選用耐熱酵母對提高SSF過程的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了研究，但由于酵母產(chǎn)酒能力較差而無法應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。在工業(yè)生產(chǎn)中，發(fā)酵的乙醇達(dá)到5%為比較經(jīng)濟的蒸餾濃度，要達(dá)到這個濃度最可簡單的辦法是提高底物濃度和酶液濃度。理論上，底物濃度和酶液濃度直接影響底物糖化后的總糖量，進(jìn)而影響酵母的生長。由于纖維素材料在預(yù)處理過程中，會產(chǎn)生糠醛、羥甲基糠醛等一系列酵母生長的抑制物，因而底物濃度的一味提高會影響工業(yè)酵母的生長，繼而降低乙醇發(fā)酵濃度。而高劑量纖維素酶的使用會直接增加乙醇的生產(chǎn)成本。適宜的底物濃度和酶液濃度是同步糖化發(fā)酵體系里基礎(chǔ)的工藝標(biāo)準(zhǔn)。
[0007]為了克服上述缺點，我們經(jīng)過適應(yīng)性進(jìn)化改造工業(yè)釀酒酵母，提高菌種的發(fā)酵溫度以及對乙酸、糠醛、羥甲基糠醛等一系列酵母生長的抑制物的耐受性，為木質(zhì)纖維素原料高溫同步糖化發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種利用木質(zhì)纖維素原料在高溫、高固形物含量情況下同步酶解糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝，本發(fā)明所用菌種為耐高溫生產(chǎn)乙醇酵母菌，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) TIB-S.C YOl已于2011年12月30日藏保于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No5679。
[0009]為達(dá)到上述發(fā)明目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0010]—種利用木質(zhì)纖維素原料高溫同步酶解糖化發(fā)酵(high temperature SSF,ΗΤ-SSF)生產(chǎn)乙醇的工藝，包括如下步驟:
[0011]I)培養(yǎng)種子，其中又包括下述步驟:
[0012](I)配置培養(yǎng)基:在250mL三角瓶中，盛放50mL的YH)培養(yǎng)基，在1000mL三角瓶中，盛放250mL的YPD培養(yǎng)基，成分包括葡萄糖2%，蛋白胨2%，牛肉膏1%，pH為5.5，121°C，滅菌 20min。
[0013](2)種子活化:將耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679從_80°C中拿出轉(zhuǎn)接到有50mL —級種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)24小時后。
[0014](3)種子培養(yǎng):將活化的酵母菌轉(zhuǎn)接IOml到含有250ml的種子培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，共準(zhǔn)備4個1000mL三角瓶，共1000mL的種子培養(yǎng)基，在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)16小時后，加入到發(fā)酵罐中進(jìn)行同步糖化酶解發(fā)酵。
[0015]2)發(fā)酵消毒，其中又包括下述步驟:
[0016](I)準(zhǔn)備發(fā)酵罐:將發(fā)酵罐罐內(nèi)清理干凈，并將pH電極、溶氧電極等安裝。
[0017](2)滅菌消毒:將發(fā)酵罐內(nèi)注入水至浸沒電極之后進(jìn)行滅菌，110°C，0.1lOMpa滅菌20min之后冷卻并將罐內(nèi)水放掉。
[0018]3) HT-SSF過程，包括下述步驟:
[0019](I)計算物料含水量:將一定質(zhì)量的物料盛放在玻璃平皿中，在85°C條件下烘干至恒重之后冷卻，稱其質(zhì)量并計算含水量。
[0020](2)物料液化:將12%物料加入到發(fā)酵罐中，并加入對應(yīng)的水和纖維素酶，溫度40°C，轉(zhuǎn)速lOOrpm，罐壓0.005Mpa，通氣10L/min條件下液化12小時。[0021](3)加入菌種:12小時時，將菌種接入到發(fā)酵罐中，并補入6%的物料和相對應(yīng)的纖維素酶，溫度40°C，轉(zhuǎn)速lOOrpm，罐壓0.005Mpa,通氣3L/min開始SSF，每隔12小時取樣。
[0022](4)補料補酶:24小時時，補入6%的物料和相對應(yīng)的纖維素酶。
[0023](5)補菌種補料補酶:36小時時，接入一定量菌種，并補入3%的物料和相對應(yīng)的
纖維素酶。
[0024](6)補料補酶:48小時時，補入3%的物料和相對應(yīng)的纖維素酶，SSF總時間為96小時。
[0025](7)樣品檢測:樣品中葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸和乳酸等用HPLC檢測。
【具體實施方式】
[0026]下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0027]實施例1 30L發(fā)酵罐進(jìn)行玉米芯高溫同步糖化酶解發(fā)酵生產(chǎn)乙醇
[0028]測定含水量:稱取IOg原料，85°C烘干后稱取干重后測得含水量，根據(jù)含水量數(shù)據(jù)計算30%底物所對應(yīng)原料總質(zhì)量(本次實驗測得原料固形物含量為93.9% )。
[0029]發(fā)酵罐準(zhǔn)備:30L發(fā)酵罐進(jìn)行空氣過濾器消毒，安裝pH電極并加水沒過電極后進(jìn)行實消，之后排空水并清零。
[0030]發(fā)酵菌種準(zhǔn)備:耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接種裝有50mL —級種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖2 %，蛋白胨2%，酵母膏I %。在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)的酵母菌轉(zhuǎn)接IOml到含有250ml的二級種子培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，準(zhǔn)備4個1000mL三角瓶，共1.0L的種子，該培養(yǎng)基的PH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)16小時。
[0031]HT-SSF過程:根據(jù)含水量及補料方案計算出反應(yīng)體系需加水量(本次實驗反應(yīng)體系15L，一次性加水11L，稱取12%底物含量對應(yīng)的原料(1.9Kg)，纖維素酶0.465L(20FPU/g底物)，開攪拌并投料。完成后設(shè)定SSF程序，溫度40°C，pH5.0，轉(zhuǎn)速IOOrpm，罐壓0.005Mpa，微通氣。待攪拌均勻后取樣，之后12小時補料6%及對應(yīng)酶量；24小時補料6%及對應(yīng)酶量；36小時補料3%及對應(yīng)酶量；48小時補料3%及對應(yīng)酶量；12小時和36小時時接入耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679各IL總接種量為15 %。然后每12小時取一次樣，取樣在加料之前，總底物濃度為30%。利用HPLC測定96小時時剩余葡萄糖0.305g/L，乙醇產(chǎn)量為56.216g/L，酶解率為73%。
[0032]實施例2 30L發(fā)酵罐進(jìn)行汽爆玉米秸桿物料高溫同步糖化酶解發(fā)酵生產(chǎn)乙醇
[0033]測定含水量:稱取IOg原料，85°C烘干后稱取干重后測得含水量，根據(jù)含水量數(shù)據(jù)計算30%底物所對應(yīng)原料總質(zhì)量(本次實驗測得原料固形物含量為96.1% )。
[0034] 發(fā)酵罐準(zhǔn)備:30L發(fā)酵罐進(jìn)行空氣過濾器消毒，安裝pH電極并加水沒過電極后進(jìn)行實消，之后排空水并清零。
[0035]發(fā)酵菌種準(zhǔn)備:耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接種裝有50mL —級種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖2 %，蛋白胨2%，酵母膏I %。在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)的酵母菌轉(zhuǎn)接IOml到含有250ml的二級種子培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，準(zhǔn)備4個1000mL三角瓶，共1.0L的種子，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)16小時。
[0036]HT-SSF過程:根據(jù)含水量及補料方案計算出反應(yīng)體系需加水量(本次實驗反應(yīng)體系15L，一次性加水11L，稱取12%底物含量對應(yīng)的原料(1.87Kg)，纖維素酶0.455L(20FPU/g底物)，開攪拌并投料。完成后設(shè)定SSF程序，溫度40°C，pH5.0，轉(zhuǎn)速IOOrpm，罐壓
0.005Mpa，微通氣。待攪拌均勻后取樣，之后12小時補料6%及對應(yīng)酶量；24小時補料6%及對應(yīng)酶量；36小時補料3%及對應(yīng)酶量；48小時補料3%及對應(yīng)酶量；12小時和36小時時分別接入耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679各IL總接種量為15%。然后每12小時取一次樣，取樣在加料之前，總底物濃度為30%。利用HPLC測定96小時時剩余葡萄糖
3.305g/L,乙醇產(chǎn)量為34.694g/L，酶解率為65.8%。
[0037]實施例3 300L發(fā)酵罐進(jìn)行汽爆玉米秸桿物料高溫同步糖化酶解發(fā)酵生產(chǎn)乙醇
[0038]測定含水量:稱取IOg原料，85°C烘干后稱取干重后測得含水量，根據(jù)含水量數(shù)據(jù)計算30%底物所對應(yīng)原料總質(zhì)量。(本次實驗測得原料固形物含量為93.9% )
[0039]種子罐準(zhǔn)備:30L種子罐進(jìn)行空氣過濾器消毒，安裝pH電極和溶氧電極并加水沒過電極后進(jìn)行實消 ，之后排空水并配制YPD培養(yǎng)基進(jìn)行實消。
[0040]發(fā)酵罐準(zhǔn)備:300L發(fā)酵罐進(jìn)行空氣過濾器消毒，安裝pH電極并加水沒過電極后進(jìn)行實消，之后排空水并清零。
[0041]發(fā)酵菌種準(zhǔn)備:耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679接種裝有50mL—級種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2 %，酵母膏I %。在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)的酵母菌轉(zhuǎn)接IOml到含有250ml的二級種子培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，準(zhǔn)備4個1000mL三角瓶，共1.0L的種子，該培養(yǎng)基的PH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分:葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%。在40°C、200r/min的搖床培養(yǎng)16小時后，接種到30L發(fā)酵罐培養(yǎng)16小時。
[0042]HT-SSF過程:根據(jù)含水量及補料方案計算出反應(yīng)體系需加水量(本次實驗反應(yīng)體系150L，一次性加水106L，稱取12%底物含量對應(yīng)的原料(19Kg)，纖維素酶4.65L，開攪拌并投料。完成后設(shè)定SSF程序，溫度40°C，pH5.0，轉(zhuǎn)速lOOrpm，罐壓0.005Mpa，微通氣。待攪拌均勻后取樣，之后12小時補料6%及對應(yīng)酶量；24小時補料6%及對應(yīng)酶量；36小時補料3%及對應(yīng)酶量；48小時補料3%及對應(yīng)酶量；12小時和36小時時接入耐溫釀酒酵母TIB-S.C YOl CGMCC No5679，總接種量為15%。SSF過程中每12小時取一次樣，取樣在加料之前，總底物濃度為30%。利用HPLC測定96小時時剩余葡萄糖1.411g/L，乙醇產(chǎn)量為57.014g/L，酶解率為 73.9%。
[0043]參考文獻(xiàn)
[0044]Fang J, Qu YB.Wide distribution of c e 11 ob i o s e_o x i d i z i ngenzymes in wood-rot fungus indicates a physiological importance inlignocellulosicsdegradation.Biotechnology Techniques,19973(11): 195-197.[0045]Wy man C E.Biomass ethanol !Technical progress, opportunities, andcommercida challenges.A nnuRev Energy Environ, 1999, 24:189-226.[0046]South C R,Hogestt D A L,Lyna L R.Modeling simultaneous saccharificationand fer-mentation of lignocellulose to ethanol in batch and continuousreactors.Enzyme and MicrobTechnol,1995,17(9):797-803.[0047]George P Philippidis，Tammy K Smith.Limiting factors in thesimultaneoussaccharifica-tion and fermentation process for conversion ofcellulosic biomass to fuel ethanol.Applied Biochemistry and Biotechnology,1995,51/52:117-123.[0048]Ballesteros I，Oliva J M，Ballesteros M，et al.0ptimization of thesimultaneoussaccharif-1cation and fermentation process using thermotolerantyeasts.Applied Biochemistry and Biotechnology，1993，39/40:201-203.[0049]Diane D Spindler, Charles E Wyman, KarelGrohmann.Evaluation ofthermotolerant yeasts in controlled simultaneous sacchrifications andfermentations of cellulose to ethanol.Biotechnology and Bioengeering，1998，34:189-195.[0050]Zacchi G，Wingren A，Galbe M.Techno-economic evaluation ofproducingethanolfrom softwood:comparison ofSSF and SHF and identification ofbottlenecks.Biotechnological Progress,2003，19:1109 ~1117.[0051]Z.Lewis Liu.Genomic adaptation of ethanologenic yeast to biomassconversion inhibit-ors.Applied` Microbiology and Biotechnology，2006，73:27-36.
【權(quán)利要求】
1.一種利用木質(zhì)纖維素原料在高溫高固形物含量情況下同步酶解糖化發(fā)酵(HT-SSF)生產(chǎn)乙醇工藝，包括如下步驟: (1)發(fā)酵所用菌種在較高溫度下培養(yǎng)。 (2)HT-SSF過程中，初始底物濃度為12%，在48小時之內(nèi)分批補加底物，且溫度要維持聞于38 C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是菌種的生長溫度是38-50°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是菌種的生長及發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基包括碳源、氮源和維生素，pH4.5-6.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是所述碳源為質(zhì)量百分含量為5%-40%的葡萄糖和/或蔗糖和/或淀粉和/或糖蜜和/或生物質(zhì)水解糖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是所述氮源為質(zhì)量百分含量為0.1% -5%的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆柏和/或豆餅粉和/或花生柏。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是SSF過程中，初始底物濃度為12%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是SSF過程中，總底物濃度為25-40%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是SSF過程中，溫度控制在40-50°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征是SSF過程中，纖維素酶用量為10-40FPU/g底物。
10.根據(jù)權(quán)利要求2、6、7、8、9所述，本發(fā)明是用于高溫同步酶解糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。
【文檔編號】C12P7/10GK103667362SQ201210362282
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】馬延和, 王欽宏, 齊顯尼, 汪保衛(wèi), 涂然, 彭彥峰 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所