專利名稱：一種棘孢木霉菌的篩選方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及真菌的篩選方法及其應用，尤其涉及棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)的篩選方法及其應用。
背景技術：
砷是一種在自然界廣泛存在的有毒并且致癌的非金屬元素，砷污染已成為全球危害十分嚴重的環境問題之一。據報道,全球至少5000多萬人口正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中大多數為亞洲國家，中國是受砷中毒危害最為嚴重的國家之一，在1956-1984年 二十多年間，中國曾發生過30余起地砷中毒事件。我國是砷礦大國，砷礦廣泛分布在我國的中南和西南的湖南、云南、廣西、廣東等省區，砷礦開采或冶煉，含砷農藥、化肥等農資產品的過量投入等，可造成土壤在砷的累積，進而影響著植物、動物的生長和發育，且可以通過食物鏈進入人體，對人類的生存和健康構成威脅。目前常用的砷污染土壤修復方法包括土壤改良劑法、客土法、化學沖洗法以及生物修復方法等。生物修復方法是利用生物(主要是植物、微生物)的作用來消減、凈化土壤中的砷或改變砷的結合形態和價態，被普遍認為是砷污染環境治理中最具應用前景的技術。其中，利用超富集植物去除土壤中砷的植物修復技術在最近幾年中取得了突破性的進展，蜈蚣草(Brakefern,Pteris vitta)和大葉井口邊草(Pteris nervosa)等砷超富集植物相繼被發現，并可用于砷污染地區的土壤修復。在重金屬污染土壤的生物修復技術中，除應用超富集植物吸收和富集重金屬外，利用植物、微生物將土壤中的重金屬轉化為難溶態或氣態化合物形式揮發到大氣中，從而達到鈍化甚至去除土壤中重金屬的目的，也逐漸引起了人們的重視。如Terry等利用微生物和植物的作用，將環境中的硒(Se)轉化為生物毒性較低的氣態形式(二甲基硒和二甲基二硒)，將其直接或通過植物的組織揮發到大氣中。Meagher等將細菌體內的汞(Hg)還原酶基因轉入芥子科植物Arabidopsis后，得到的轉基因植物能耐受、吸收土壤環境中的Hg，并將Hg2+還原成Hg°使其揮發進入大氣。土壤中的砷化合物也可以轉變為氣態的甲基砷等物質，在多個圈層中遷移和轉化。因此，利用某些微生物的對砷的富集、利用和轉化等功能，將砷累積到生物體內或使其轉化為易揮發態的砷化合物，已成為潛在的砷污染土壤修復技術之一。目前，國內還沒有對砷具有生物累積與揮發能力真菌的報道，國外的相關報道也屈指可數，且大多數還局限于實驗室研究階段。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種棘孢木霉菌的篩選方法，將棘孢木霉菌應用于治理砷污染土壤以及減少砷在作物和農產品中的累積。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種棘孢木霉菌的篩選方法，包括采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從該土壤樣品中分離出真菌，將該真菌純化后轉接于木霉菌屬的選擇性的培養基上；以該選擇性培養基上生長狀況最好的真菌菌株為對象，將該真菌在不同砷濃度下培養，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出棘抱木霉囷。該棘孢木霉菌Trichoderma asperellum已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址標注在后)保存，保存編號為CGMCC No. 3186，保存日期為2009年7月09臼。優選地，該方法具體包括將該土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養基上分離出該真菌；將分離出的真菌經多次純化后，分別挑取少量菌絲，于不含砷的PGP培養基上用劃線法純化培養3-5天，該過程重復2次；然后接種于木霉菌屬的選擇性培養基上，于24 26°C下培養5-7天后，以生長狀況最好的真菌菌株作為接種目標，取直徑zDDY為8 IOmm的圓形真菌菌塊或邊長為8 IOmm的方形真菌菌塊,置于含砷1000mg/kg的PGP培養基上，比較該菌塊的生長狀況，從中篩選出具有較高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。優選地，馬丁培養基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 · 7H20、瓊脂以及水，各成分的重量比為 20 : 10 : 2 : I : 80 : 4000 ；PGP培養基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為40 4 I 400 ；木霉菌屬的選擇性培養基成分包括葡萄糖、NH4NO3^ KH2PO4,MgSO4, KCl、ZnSO4, FeSO4, MnSO4,氯霉素、鏈霉素以及水，各成分的重量比為500 90 20 15 2 I 2 20 5 100000。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種棘孢木霉菌對砷的抗性的鑒定方法，包括在室內培養條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發能力，以及在含有不同濃度砷溶液的培養條件下棘孢木霉菌生物量的變化，由此鑒定棘孢木霉菌對砷的抗性。優選地，在室內培養條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發能力，具體包括配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后，接入O. Iml棘孢木霉菌生物量為104cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24 27°C，轉速為138 142rmp,培養5天后，以3800 4200rmp進行離心處理8 12分鐘,用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后對菌質稱重，用11 13ml體積比為4 6 I的HN03、HC104混合液在158 162°C條件下將菌質消煮10小時，采用原子熒光測定菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗菌質的超純水混合后作為上清液采用原子熒光測定總砷含量；菌質中的總砷含量作為棘孢木霉菌對砷的生物累積量，棘孢木霉菌對砷的揮發量=配置的總砷含量-該菌質中的總砷含量-上清液中的總砷含量。優選地，參照在總砷含量為50mg/L的PGP培養基中接入棘孢木霉菌的處理，分別以在總砷含量為50mg/L的PGP培養基中不接入棘孢木霉菌處理以及在PGP培養基中接入棘孢木霉菌而不添加砷的處理作為對照，對每項處理均重復多次。優選地，在室內條件下測定在含有不同濃度砷溶液的培養條件下棘孢木霉菌生物量的變化，具體包括配制總砷含量范圍為O 200mg/L的PGP培養基，在120 122°C溫度下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉速為138 142rmp振蕩培養；培養5天后，培養液以3800 4200rmp離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法對懸液中的孢子數目進行計數；用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基后，將該菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量該菌質重量，即棘孢木霉菌生物量。優選地，將不同砷含量下的相應處理均重復多次。
優選地，該方法還包括觀察隨著該培養液中總砷含量的增加棘孢木霉菌生物量的變化趨勢，并觀察棘孢木霉菌生物量達到最高時所述培養液的砷含量，由此確定棘孢木霉菌表現出的對砷抗性的含量范圍。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種棘孢木霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農產品中累積方面的應用。利用本發明篩選出的棘孢木霉菌，可以制成相應的微生物制劑，將制得的微生物制劑應用在污染土壤或環境中后，通過該棘孢木霉菌的富集和揮發作用，能夠在一定程度上降低土壤中砷的含量，特別是降低土壤有效砷的含量，從而保證作物正常生長，并使作物和農產品中砷的含量達到無公害農產品要求。


圖I為棘孢木霉菌在不同砷濃度水平下的生長曲線圖。
具體實施例方式本發明提供的棘孢木霉菌的篩選和培養方法，包括從砷污染的土壤中分離出真菌，經純化后，于木霉菌屬的選擇性的培養基上培養，以生長狀況佳的菌株為對象，觀察該真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出棘孢木霉菌；在室內培養條件下觀察分離出的棘孢木霉菌對砷的揮發能力。對篩選出的棘孢木霉菌接種于含有不同濃度砷的液態PGP培養基中，觀察棘孢木霉菌生物量的變化，結果表明該木霉菌在0-50mg/L的砷濃度范圍內表現出較強的對砷的抗性，且當含砷濃度為50mg/L時顯著性地刺激了該木霉菌株的生長；隨后進行的棘孢木霉菌對砷的生物累積量與揮發量測定實驗表明，當對該棘孢木霉菌培養時間為5天，且在培養基中加入的砷濃度為50mg/L時，該棘孢木霉菌對砷的生物累積量為11. 21 μ g，生物揮發量為111. 99 μ g。實驗說明該棘孢木霉菌對砷具有一定的生物累積與揮發能力，能應用于砷污染土壤的生物修復過程中，從而降低土壤中有效態砷含量、減少作物及農產品中砷的累積。以下結合附圖和優選實施例對本發明的技術方案進行詳細地闡述。以下實施例僅僅用于說明和解釋本發明，而不構成對本發明技術方案的限制。
在以下所有實施例中，砷均以Na3AsO4 · 12H20的形式加入培養基中。實施例I棘孢木霉菌的分離、篩選從砷污染區采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從該土壤樣品中分離出真菌，經純化培養后，接種于木霉菌屬的選擇性培養基上，以著生狀況最好的菌株為目標菌株，將其接種在固態且含有一定濃度砷的PGP培養基(土豆-葡萄糖-蛋白胨培養基)上培養，并觀察其在不同砷濃度下的菌落生長狀況，同時結合顯微鏡鏡檢結果，篩選出健壯、耐砷能力強的棘孢木霉菌。具體包括步驟上述砷污染土壤樣品來自湖南石門地區雄黃礦附近的礦渣堆積處，將該土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養基上分離出真菌，該 馬丁培養基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、瓊脂及水，其重量比為20 10 2 I 80 4000。將分離出的真菌挑取少量菌絲，于不含砷的PGP培養基上利用劃線法純化培養3-5天，該過程重復2次。然后接種于木霉菌屬的選擇性培養基上，于24 26°C下培養5_7天后，以著生情況最好的菌株作為接種目標，取直徑為8 10_的圓形菌塊或邊長為8 IOmm的方形菌塊置于含砷1000mg/kg的PGP培養基上，比較其生長狀況。同時，將該菌株進行顯微鏡鏡檢，以菌絲體形態、分生/厚垣孢子萌發等為指標，篩選出具有較高抗砷能力的棘孢木霉菌株。該木霉菌屬的選擇性培養基成分包括葡萄糖5g、NH4N03lg、KH2P040. 9g, MgSO4O. 2、KC10. 15g、ZnS040 . 02g,FeSO4O. Olg^MnSO4O. 02g、氯霉素 0. 2g、鏈霉素 0. 05g 以及水 IOOOmL0該棘孢木霉菌Trichoderma asperellum已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保存編號為CGMCC No. 3186，保存日期為2009年7月09日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，電話為010-64807355，電子由II件為 cRmccisun. im. ac. cn。實施例2棘孢木霉菌在不同含砷量溶液中生長量的變化實驗配制含砷量分別為0，10，30，50，80，100，200mg/L的PGP培養基，在120 122 °C下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C、轉速138 142rmp振蕩培養；培養5天后，培養液以3800 4200rmp離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法對懸液中的孢子數量進行計數；之后用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基后，將該菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量所述菌質重量，即棘孢木霉菌的生物量。如圖I所示為棘孢木霉菌在上述不同砷濃度(即含砷量)水平下的生物量。圖I表示，隨著砷濃度的增加，該棘孢木霉菌的生物量表現出一定的增加趨勢；當砷含量為50ppm時，其生物量達到最大，之后則隨砷含量的增加表現出緩慢的下降趨勢。這一結果說明，該棘孢木霉菌在O 50ppm的含砷范圍內其生物量隨含砷量的提高而增加。實施例3棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發功能的測定實驗配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120 125°C下滅菌14 17分鐘后，接入O. Iml棘孢木霉菌含量為104cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24 27°C，轉速為138 142rmp，培養5天后，以3800 4200rmp的轉速進行離心處理8 12分鐘，用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將該菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后對該菌質稱重，用11 13ml體積比為4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C條件下將該菌質消煮10小時，采用原子熒光測定該菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗該菌質的超純水混合后作為上清液也采用原子熒光測定其內總砷含量。以菌質中的總砷含量作為微生物棘孢木霉菌對砷的生物累積量，棘孢木霉菌對砷的揮發量=配置的總砷含量-菌質中的總砷含量-上清液中總砷含量。本實驗以加入50mg/ L砷不加棘孢木霉菌,加棘孢木霉菌不加砷的處理,對照上述加入50mg/L砷且加棘孢木霉菌的處理，各處理均重復3次。該棘孢木霉菌表現出了較強的抗砷性能，當培養時間為5天時，其對砷的生物累積量為11. 21 μ g,生物揮發量為111. 99 μ g,如表I所示。表I棘孢木霉菌對砷的生物累積與生物揮發量(平均值土S. D)
棘孢木霉菌I菌質T重I生物累積量&g)| ,效I生物揮發量__(g)___(累積f/干重)__(Mg)
T. asperellum 0.163±0.009 11.210±0.214 68.802±2.387 111.990±8.915目前，國內還沒有關于對砷具有生物累積與揮發能力的真菌的報道，國外有一些這方面的報道，但大多是基于理論上和實驗室的研究，現將本發明分離、篩選出的棘孢木霉菌與國外報道的抗砷真菌相比較，如表2所示。表2本發明與國外報道的抗砷真菌的情況比較
報道人報道期刊 ^ 菌株名稱私量、生,揮， , -]、
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Cernansky^ BioresourceAspergillus不同砷濃度下棘孢木霉菌孢子產生情況如表3所示。表3.砷濃度對棘孢木霉菌孢子產生的影響
培養基棘抱木霉菌(T. asperellum)
權利要求
1.一種棘孢木霉菌的篩選方法,包括 采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從所述土壤樣品中分離出真菌，將所述真菌純化后轉接于木霉菌屬的選擇性的培養基上；以該選擇性培養基上生長狀況最好的真菌菌株為對象，將所述真菌在不同砷濃度下培養，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出所述棘孢木霉菌。
2.按照權利要求I所述的方法，其特征在于，具體包括 將所述土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400 600mg/L的馬丁培養基上分離出所述真菌； 將分離出的真菌經多次純化后，分別挑取少量菌絲，于不含砷的PGP培養基上用劃線法純化培養3-5天，該過程重復2次；然后接種于所述木霉菌屬的選擇性培養基上，于24 26°C下培養5-7天后，以生長狀況最好的真菌菌株作為接種目標，取直徑為8 IOmm的圓形真菌菌塊或邊長為8 IOmm的方形真菌菌塊，置于含砷1000mg/kg的PGP培養基上，比較所述菌塊的生長狀況，從中篩選出具有較高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于， 所述馬丁培養基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 ·7Η20、瓊脂以及水，各成分的重量比為 20 : 10 : 2 : I : 80 : 4000 ； 所述PGP培養基的成分包括馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為40 4 I 400 ； 所述木霉菌屬的選擇性培養基成分包括葡萄糖、NH4NO3^ KH2PO4,MgSO4, KCl、ZnSO4, FeSO4, MnSO4,氯霉素、鏈霉素以及水，各成分的重量比為500 90 20 15 2 I 2 20 5 100000。
4.一種棘孢木霉菌對砷的抗性的鑒定方法，包括 在室內培養條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發能力，以及在含有不同濃度砷溶液的培養條件下棘孢木霉菌生物量的變化，由此鑒定所述棘孢木霉菌對砷的抗性。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室內培養條件下測定棘孢木霉菌對砷的生物累積與揮發能力，具體包括 配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120 125 °C下滅菌14 17分鐘后，接入O. Iml棘孢木霉菌生物量為104cfu/ml的菌懸液，培養溫度為24 27°C，轉速為138 142rmp,培養5天后，以3800 4200rmp進行離心處理8 12分鐘,用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后對菌質稱重，用11 13ml體積比為4 6 I的HN03、HC104混合液在158 162°C條件下將菌質消煮10小時，采用原子熒光測定菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗菌質的超純水混合后作為上清液采用所述原子熒光測定總砷含量； 所述菌質中的總砷含量作為棘孢木霉菌對砷的生物累積量，棘孢木霉菌對砷的揮發量=配置的總砷含量-所述菌質中的總砷含量-所述上清液中的總砷含量。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于， 參照在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中接入棘孢木霉菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中不接入棘孢木霉菌處理以及在PGP培養基中接入棘孢木霉菌而不添加砷的處理作為對照，對每項處理均重復多次。
7.按照權利要求5所述的方法，其特征在于，在室內條件下測定在含有不同濃度砷溶液的培養條件下棘孢木霉菌生物量的變化，具體包括 配制總砷含量范圍為O 200mg/L的PGP培養基，在120 122°C溫度下滅菌14 16分鐘后，將生長速率相同的8 IOmm棘孢木霉菌菌塊分別加入以上處理中，于搖床上溫度為23 27°C，轉速為138 142rmp振蕩培養；培養5天后，培養液以3800 4200rmp離心8 12分鐘，并采用稀釋梯度法對懸液中的孢子數目進行計數； 用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基后，將所述菌質于48 52°C下烘干至恒重，然后稱量所述菌質重量，即所述棘孢木霉菌生物量。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于，將不同砷含量下的相應處理均重復多次。
9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于，還包括 觀察隨著所述培養液中總砷含量的增加所述棘孢木霉菌生物量的變化趨勢，并觀察所述棘孢木霉菌生物量達到最高時所述培養液的砷含量，由此確定所述棘孢木霉菌表現出的對砷抗性的含量范圍。
10.一種棘孢木霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及農產品中累積方面的應用。
全文摘要
本發明披露了一種棘孢木霉菌的篩選方法及其應用，其中方法包括采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從該土壤樣品中分離出真菌，將該真菌純化后轉接于木霉菌屬的選擇性的培養基上；以該選擇性培養基上生長狀況最好的真菌菌株為對象，將該真菌在不同砷濃度下培養，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出棘孢木霉菌。
文檔編號C12N1/14GK102876586SQ20121036186
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者曾西柏, 蘇世鳴, 蔣細良, 白玲玉, 李蓮芳 申請人:中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所