專利名稱：一種表達抗凝血酶iii的重組羊胎兒成纖維細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因克隆細胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞。
背景技術(shù)：
抗凝血酶III (antithrombinIII,簡稱ATIII)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑,是人體血漿中的一種重要的抗凝血因子，它在血漿中承擔著60% 70%的抗凝血活性，在維持血液生理性凝血與抗凝血中起著重要的作用。抗凝血酶III的合成場所為肝臟，其主要通過與凝血酶Xa及XIa結(jié)合等方式滅活凝血酶，從而發(fā)揮抗凝血的作用。抗凝血酶III在人體中含量減少常見于以下病例a)遺傳性抗凝血酶III缺乏；·b)獲得性抗凝血酶III缺乏，見于肝硬化、肝癌晚期等各種肝臟疾病；c)抗凝血酶III丟失增多，見于腎臟疾病；d)抗凝血酶III消耗增多，見于各種原因造成的血液凝固性增高；e)由抗凝血酶III先天或后天缺乏導(dǎo)致血栓的形成而引起的腦血栓或心肌梗塞
等疾病。目前人抗凝血酶III蛋白多來自于人類血漿提取，隨著市場需求的不斷擴增以及血漿原料的不斷萎縮，血漿來源的人抗凝血酶III逐漸呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的態(tài)勢。鑒于此種情況，利用重組DNA技術(shù)在體外高效表達與天然蛋白結(jié)構(gòu)功能均類似的重組蛋白替代品便成為了解決血漿蛋白供不應(yīng)求的不二之選。已有報道的重組人抗凝血酶III蛋白表達體系包括酵母、CHO細胞及轉(zhuǎn)基因動物等。其中美國GTC生物治療公司的顯微注射法轉(zhuǎn)基因胚胎所培育的山羊乳腺生物反應(yīng)器表達體系所生產(chǎn)達到重組人抗凝血酶III蛋白表達量最高，其結(jié)構(gòu)與功能最接近天然蛋白。但是，GTC公司所制作的轉(zhuǎn)基因細胞系(胚胎)，由于隨機整合等因素，難以保持外源基因的穩(wěn)定遺傳，一般外源基因會隨細胞系傳代或轉(zhuǎn)基因動物繁育而逐漸丟失，不利于優(yōu)良轉(zhuǎn)基因形狀的保持及目的蛋白的高效表達。因此，如何獲得一種能夠高效表達目的蛋白且外源基因可以隨之穩(wěn)定遺傳的細胞系，成為了動物生物反應(yīng)器制藥行業(yè)一項亟待解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，即一種作為核供體細胞的包含rhATIII乳腺特異性表達載體的奶山羊胎兒成纖維細胞系，為制作高質(zhì)量的rhATIII轉(zhuǎn)基因奶山羊反應(yīng)器提供堅實的基礎(chǔ)，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足之處。本發(fā)明的表達抗凝血酶III的轉(zhuǎn)hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT已于2012年8月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C 2012103。本發(fā)明的重組羊胎兒成纖維細胞的制備方法，是將攜帶有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表達載體轉(zhuǎn)染入羊胎兒成纖維細胞內(nèi)，再篩選出目的基因rhATIII已整合到基因組上的山羊胎兒成纖維細胞。本發(fā)明的重組羊胎兒成纖維細胞在制備奶山羊生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建的rhATIII乳腺特異性表達載體，使目的基因rhATIII整合到羊胎兒成纖維細胞的基因組上。通過在rhATIII基因兩端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’調(diào)控區(qū)，山羊β酪蛋白基因的5’和3’調(diào)控區(qū)可以指導(dǎo)目的基因在山羊乳腺組織中特異的高效表達。而且，本發(fā)明使用基因打靶技術(shù)，使含有目的基因rhATIII的特異性表達載體可以定點整合至山羊胎兒成纖維細胞基因組中，避免了由于隨機整合而對目的基因表達帶來的不確定性，使目的基因rhATIII的表達效率更高。本發(fā)明的包含目的基因rhATIII的山羊胎兒成纖維細胞可作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細胞，通過體細胞核移植法獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚，將所得胚胎移入受體羊的子宮即可高效率生產(chǎn)出轉(zhuǎn)rhATIII基因的奶山羊生物反應(yīng)器。
具體實施例方式本發(fā)明首先是構(gòu)建攜帶有抗凝血酶III (ATIII)基因的重組表達載體，載體構(gòu)建方法可以參照申請?zhí)枮?011102521955的專利說明書中的描述來進行，其具體步驟如下I、包含目的基因rhATIII的重組載體構(gòu)建從人類肝臟組織中提取總RNA，以oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。以合成的 cDNA第一鏈為模板，根據(jù)已公開的ATIII基因序列(GenBank，D29832)設(shè)計PCR引物，并在引物5’端引入一個唯一的XhoI酶切位點，進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆至pUC19載體上，通過DNA測序分析確定載體所包含的ATIII序列與已公開ATIII序列一致。上述的ATIII基因序列也可以根據(jù)GenBank中記錄的序列人工合成。2、重組基因打靶表達載體的構(gòu)建將奶山羊的β —酪蛋白基因去除第二外顯子與第七外顯子及其之間的DNA序列，建立一個Notl酶切位點。在PCR擴增的ATIII序列片段加上一個Iox序列、一個polyA序列、一個新霉素(Neomycin)篩選基因和另一個Iox序列，使兩個Iox序列方向相同。最后將改造后的ATIII序列連接至奶山羊β —酪蛋白DNA載體的表達框架上。通過DNA測序分析確定重組表達載體序列與理論序列一致。將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染細胞，來構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的細胞系。3、定點打靶載體的細胞轉(zhuǎn)染、篩選與鑒定從30d-45d胎齡的嶗山奶山羊胎兒中分離出胎兒成纖維細胞，將分離的細胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清(FCS)和抗菌素的DMEM-F12 (1:1)培養(yǎng)基中。用電穿孔或脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將基因打靶載體轉(zhuǎn)入山羊胎兒成纖維細胞中。轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48小時后，培養(yǎng)液中加入G418 (600 μ g/mL)進行篩選培養(yǎng)。篩選出的細胞經(jīng)PCR及Southern雜交檢測外源基因整合情況后冷凍保存。陽性轉(zhuǎn)基因細胞株傳代30代后，提取基因組DNA進行PCR及Southern雜交檢測，PCR引物序列如下正向引物5’-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG -3’反向引物5’ -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3 ’
Southern雜交探針選用Pstl酶切Genome DNA plasmid片段,長度為440bp。檢測結(jié)果顯示，外源 基因插入片段仍保持完整，說明所得陽性轉(zhuǎn)基因細胞株中外源目的基因完全整合至細胞基因組中，并可隨之穩(wěn)定遺傳；提取細胞株總mRNA進行Northern雜交檢測，雜交探針選用ATIII基因序列(GenBank,D29832)或部分序列。檢測結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)后的陽性轉(zhuǎn)基因細胞株具有較高的目的基因轉(zhuǎn)錄水平，約為正常轉(zhuǎn)錄的人類肝臟細胞的3-5倍，說明所得陽性轉(zhuǎn)基因細胞株中外源基因可高效轉(zhuǎn)錄。該細胞株命名為轉(zhuǎn)hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT，已于2012年8月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C 2012103。4、以上述基因組整合了 ATIII目的基因的山羊胎兒成纖維細胞作為核供體細胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚通過同期發(fā)情和超排處理獲得體內(nèi)成熟的卵母細胞和寄母羊。陽性細胞體外饑餓2-5天后移入去核卵母細胞卵周隙內(nèi)，用電刺激法使供核細胞與去核卵母細胞融合，體外培養(yǎng)4小時并用離子霉素(Ionomycin)激活5分鐘，之后在含有6- 二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5小時。最后將克隆胚移入正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，第二天移入寄母羊輸卵管中。寄母羊通過妊娠期可產(chǎn)下定點整合的ATIII轉(zhuǎn)基因克隆羊。該克隆羊即為轉(zhuǎn)基因動物反應(yīng)器，其乳汁中含有高效表達的ATIII藥用蛋白。
權(quán)利要求
1.一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，為轉(zhuǎn)hATIII基因成纖維細胞SMl sCh-AT，其保藏編號為 CCTCC C 2012103。
2.權(quán)利要求I所述的重組羊胎兒成纖維細胞的制備方法，是將攜帶有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表達載體轉(zhuǎn)染入羊胎兒成纖維細胞內(nèi)，再篩選出目的基因rhATIII已整合到基因組上的山羊胎兒成纖維細胞。
3.權(quán)利要求I所述的重組羊胎兒成纖維細胞在制備奶山羊生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，為轉(zhuǎn)hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT,已于2012年8月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C 2012103。本發(fā)明通過構(gòu)建的rhATIII乳腺特異性表達載體，使目的基因rhATIII整合到羊胎兒成纖維細胞的基因組上。通過在rhATIII基因兩端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’調(diào)控區(qū)，可以指導(dǎo)目的基因在山羊乳腺組織中特異的高效表達。本發(fā)明的包含目的基因rhATIII的山羊胎兒成纖維細胞可作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細胞，通過體細胞核移植法獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚，將所得胚胎移入受體羊的子宮即可高效率生產(chǎn)出轉(zhuǎn)rhATIII基因的奶山羊生物反應(yīng)器。
文檔編號C12R1/91GK102899292SQ20121036248
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者鄒賢剛, 趙雅琳, 袁三平 申請人:青島森淼實業(yè)有限公司