專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備cik細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備CIK細(xì)胞的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤生物治療是繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種治療模式。CIK細(xì)胞，即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-Induced killer, CIK)是ー種新型的免疫活性細(xì)胞，CIK増殖能力強(qiáng)，細(xì)胞毒作用強(qiáng)，具有一定的免疫特性，是目前國(guó)際上公認(rèn)用于腫瘤生物治療最有效的細(xì)胞之一。與過(guò)去過(guò)繼免疫治療所使用過(guò)的淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokine-activated killer, LAK)和 CD3 單抗活化的殺傷細(xì)胞(CD3AK)相比，CIK 細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞増殖能力和更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞作用，且毒副作用較小。CIK細(xì)胞治療腫瘤的療效主要取決于輸注細(xì)胞的數(shù)量和殺傷活性。目前傳統(tǒng)的 CIK細(xì)胞制備方法是先分離出外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，用適合于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入適量的⑶3單克隆抗體、IL-2，IFN-Y等細(xì)胞因子將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成CIK細(xì)胞。如《CIK細(xì)胞的制作及對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株體外抗腫瘤作用的研究》(隋承光等，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第34卷，第3期，210-211)公開(kāi)了ー種傳統(tǒng)的CIK細(xì)胞制備方法，采集外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液梯度分離，取界面層細(xì)胞，PBS洗滌2次，懸浮于AM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度1父106/1111，于當(dāng)日加入正.ゎ2411后加入0)310八13，IL-2，IL-I α ,在370C，5% ニ氧化碳孵箱中培養(yǎng)制成。該方法利用IFN- Y使CIK細(xì)胞大量擴(kuò)增，但CIK細(xì)胞的殺傷活性卻隨著細(xì)胞的擴(kuò)增有下降的趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中制備CIK細(xì)胞的方法在使CIK細(xì)胞大量擴(kuò)增的同吋，CIK細(xì)胞的殺傷活性卻下降的問(wèn)題，進(jìn)而提供一種既可以保證CIK細(xì)胞的數(shù)量，又可以提高其殺傷活性的制備CIK細(xì)胞的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種制備CIK細(xì)胞的方法，包括以下步驟a、從外周血中采集和分離單個(gè)核細(xì)胞；b、將步驟a得到的單個(gè)核細(xì)胞置于適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，加入⑶3單克隆抗體、IL-2，IFN-Y，將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成CIK細(xì)胞；C、在步驟b的培養(yǎng)液中培養(yǎng)8-15天后，再加入IFN- α和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)2-6天。所述步驟c培養(yǎng)液中IFN-α的含量為100u/ml-1000u/ml，IL-2的濃度為IOOu/ml_500u/ml。所述步驟c培養(yǎng)液中IFN- α的含量為500u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為3天。所述步驟a中所述分離單個(gè)核細(xì)胞是經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離，經(jīng)貼壁除去單核細(xì)胞。所述步驟b中培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基。所述步驟b中細(xì)胞濃度為0. 5X 106/ml-l· 5X 106/ml，CD3單克隆抗體IOng/ml-70ng/ml，IL-2 濃度為 100u/ml_500u/ml，IFN-γ 濃度為 100u/ml-1000u/ml，培養(yǎng)時(shí)間為72h以上。所述步驟b中細(xì)胞濃度為I X 106/ml，CD3單克隆抗體50ng/ml，IL-2濃度為3000u/ml, IFN-y 濃度為 1000u/ml。本發(fā)明還涉及ー種所述方法制備的CIK細(xì)胞。本發(fā)明所述的技術(shù)方案相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明首先按照常規(guī)方法將T淋巴細(xì)胞制備成CIK細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至能滿(mǎn)足臨床治療的細(xì)胞量時(shí)，加入IFN-α繼續(xù)培養(yǎng)，既可以保證CIK細(xì)胞的數(shù)量，又可以提高其殺傷活性，MTT法檢測(cè)表明利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞較不加IFN-α培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性能高50%-1000%。經(jīng)過(guò)對(duì)100多例臨床惡性腫瘤患者治療，有效率(PR+CR+MR+SD)達(dá)到76%，其中PR+CR+MR達(dá)50%，不但提高了腫瘤晚期病人的生存期，還提高了病人的生存質(zhì) 量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I從外周血中采集和分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離；取界面層單個(gè)核細(xì)胞，置于適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，本實(shí)施例選用AM-V無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為O. 5Χ 106/ml，加入⑶3單克隆抗體、IL_2，IFN- Y，調(diào)整⑶3單克隆抗體濃度為30ng/ml、IL-2濃度為100u/ml，IFN-y濃度為500u/ml，培養(yǎng)12天；在上述培養(yǎng)液中再加入IFN-α和IL-2，調(diào)整IFN-α的濃度為100u/ml, IL-2濃度為100u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2天即得CIK細(xì)胞。實(shí)施例2從外周血中采集和分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離；取界面層單個(gè)核細(xì)胞，置于適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，本實(shí)施例選用AM-V無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5X106/ml，加入⑶3單克隆抗體、IL_2，IFN-Y，調(diào)整⑶3單克隆抗體濃度為70ng/ml、IL-2濃度為500u/ml，IFN-y濃度為1500u/ml，培養(yǎng)8天；在上述培養(yǎng)液中再加入IFN-α和IL-2，調(diào)整IFN-α的濃度為1000u/ml，IL-2濃度為500u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6天即得CIK細(xì)胞。實(shí)施例3從外周血中采集和分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離；取界面層單個(gè)核細(xì)胞，置于適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，本實(shí)施例選用AM-V無(wú)血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/ml，加入⑶3單克隆抗體、IL-2，IFN-Y，調(diào)整⑶3單克隆抗體濃度為50ng/ml、IL-2濃度為300u/ml，IFN-y濃度為1000u/ml，培養(yǎng)10天；在上述培養(yǎng)液中再加入IFN-α和IL-2，調(diào)整IFN-α的濃度為500u/ml, IL-2濃度為300u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4天即得CIK細(xì)胞。對(duì)比例按照參考文獻(xiàn)《CIK細(xì)胞的制作及對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株體外抗腫瘤作用的研究》(隋承光等，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，第34卷，第3期，210-211)公開(kāi)的方法制備CIK細(xì)胞，采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液梯度分離，取界面層細(xì)胞，PBS洗滌2次，懸浮于AM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度I X 106/ml，于當(dāng)日加入I FN-Y (1000u/ml )，24h后加入CD3 單克隆抗體(50ng/ml)，IL-2 (300u/ml), IL-1 α (100u/ml)，在 37°C，5%C02 孵箱中培養(yǎng)得CIK細(xì)胞。MTT法檢測(cè)CIK細(xì)胞的殺傷活性將實(shí)施例1-3和對(duì)比例所得CIK細(xì)胞分別與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞株有兩種I、對(duì)NK敏感的K562腫瘤株；2、對(duì)NK不敏感的HL-60腫瘤株)，培養(yǎng)6小時(shí)胡，用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞死亡比例來(lái)比較殺瘤活性，結(jié)果換算成殺瘤單位(LU)如下表I :表I
權(quán)利要求
1.一種制備CIK細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟a、從外周血中采集和分離單個(gè)核細(xì)胞；b、將步驟a得到的單個(gè)核細(xì)胞置于適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，除去單核細(xì)胞，懸浮細(xì)胞加入⑶3單克隆抗體、IL-2，IFN-Y，將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成CIK細(xì)胞；C、在步驟b的培養(yǎng)液中培養(yǎng)8-15天后，再加入IFN- a、IL-2繼續(xù)培養(yǎng)2_6天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟c培養(yǎng)液中IFN-α的濃度為100u/ml-1000u/ml, IL-2 的濃度為 100u/ml_500u/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟c培養(yǎng)液中IFN-α的含量為500u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為3天。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟a中所述分離單個(gè)核細(xì)胞是經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離，經(jīng)貼壁除去單核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟b中培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟b中細(xì)胞濃度為O.5X IO6/ml-1. 5 X 106/ml，CD3 單克隆抗體 10ng/ml_70ng/ml，IL-2 濃度為 100u/ml-500u/ml，IFN- y濃度為100u/ml-1000u/ml，培養(yǎng)時(shí)間為72h以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟b中細(xì)胞濃度為lX106/ml，CD3單克隆抗體 50ng/ml，IL-2 濃度為 300u/ml，I FN-Y 濃度為 1000u/ml。
8.—種如權(quán)利要求I至7任一所述方法制備的CIK細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備CIK細(xì)胞的方法，包括以下步驟a、從外周血中采集和分離單個(gè)核細(xì)胞；b、將步驟a得到的單個(gè)核細(xì)胞置于適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，用單核細(xì)胞貼壁的特性除去其中的單核細(xì)胞，其余部分加入CD3單克隆抗體、IL-2，IFN-γ，將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成CIK細(xì)胞；c、在步驟b的培養(yǎng)液中培養(yǎng)8～15天后，再加入IFN-α和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞較不加IFN-α培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性能高50%-200%。經(jīng)過(guò)對(duì)100多例臨床惡性腫瘤患者治療，有效率(PR+CR+MR+SD)達(dá)到75%，其中PR+CR+MR達(dá)50%，不但提高了腫瘤晚期病人的生存期，還提高了病人的生存質(zhì)量。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102827808SQ201210365499
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者高岱清, 蘭克濤, 馬偉, 魏曉芳, 趙鵬, 解西河, 李長(zhǎng)優(yōu), 孫偉紅 申請(qǐng)人:高岱清